Name: purification of low-abundant cells in the drosophila visual system
Uploaded: 2018-09-26T15:00:00
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Questa ricerca è stata finanziata dal NINDS dei National Institutes of Health, sotto numero premio K01NS094545, andgrants dal centro Lefler per la studio di Malattie Neurodegenerative. Riconosciamo Liming Tan e Jason McEwan per conversazioni importanti.

1. pianificazione prima dell'esperimento
<ol><li>
Prima di iniziare l'esperimento, eseguire un esperimento pilota su piccola scala per confermare se la genetica funziona come previsto per etichettare in modo specifico le cellule desiderate.
	<ol>
<li>Come primo passaggio, uso immunoistochimica e microscopia per determinare se le cellule indesiderate vengono etichettate. In teoria, marcatori genetici saranno specifici all'interno della retina e del lobo ottico (Figura 3). S...

<ol>
	<li>Fischbach, K. -. F., Dittrich, A. P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+optic+lobe+of+Drosophila+melanogaster.+I.+A+Golgi+analysis+of+wild-type+structure.">The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure.</a> Cell and Tissue Research. 258, 441-475 (1989).</li><li>Pfeiffer, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+neuroanatomy+and+neurogenetics+in+Drosophila.">Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (28), 9715-9720 (2008).</li><li>Jenett, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+GAL4-driver+line+resource+for+Drosophila+neurobiology.">A GAL4-driver line resource for Drosophila neurobiology.</a> Cell Rep. 2 (4), 991-1001 (2012).</li><li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues.">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li><li>Tan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ig+Superfamily+ligand+and+receptor+pairs+expressed+in+synaptic+partners+in+drosophila.">Ig Superfamily ligand and receptor pairs expressed in synaptic partners in drosophila.</a> Cell. 163 (7), 1756-1769 (2015).</li><li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Fezf+coordinates+laminar-specific+connectivity+through+cell-intrinsic+and+cell-extrinsic+mechanisms.">Drosophila Fezf coordinates laminar-specific connectivity through cell-intrinsic and cell-extrinsic mechanisms.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Krasnow, M. A., Cumberledge, S., Manning, G., Herzenberg, L. A., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+cell+sorting+of+Drosophila+embryos.">Whole animal cell sorting of Drosophila embryos.</a> Science. 251 (4989), 81-85 (1991).</li><li>Cumberledge, S., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+analysis+of+pure+cell+populations+from+Drosophila.">Preparation and analysis of pure cell populations from Drosophila.</a> Methods in Cell Biology. 44, 143-159 (1994).</li><li>Bryant, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+differentially+expressed+genes+in+purified+Drosophila+follicle+cells:+toward+a+general+strategy+for+cell+type-specific+developmental+analysis.">Characterization of differentially expressed genes in purified Drosophila follicle cells: toward a general strategy for cell type-specific developmental analysis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (10), 5559-5564 (1999).</li><li>Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+growth+and+cell+division+in+the+Drosophila+wing.">Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing.</a> Cell. 93 (7), 1183-1193 (1998).</li><li>Calvi, B. R., Lilly, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+BrdU+labeling+and+nuclear+flow+sorting+of+the+Drosophila+ovary.">Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary.</a> Methods in Molecular Biology. , 203-213 (2004).</li><li>Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-activated+cell+sorting+(FACS)+of+Drosophila+hemocytes+reveals+important+functional+similarities+to+mammalian+leukocytes.">Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (9), 2912-2917 (2004).</li><li>Bryantsev, A. L., Cripps, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+cardiac+cells+from+Drosophila+embryos.">Purification of cardiac cells from Drosophila embryos.</a> Methods. 56 (1), 44-49 (2012).</li><li>Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+purification+of+Drosophila+larval+neuroblasts+for+next-generation+sequencing.">FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).</li><li>Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+gentle+and+scalable+method+for+dissociation+and+fluorescent+sorting+of+imaginal+disc+cells+for+mRNA+sequencing.">A rapid, gentle and scalable method for dissociation and fluorescent sorting of imaginal disc cells for mRNA sequencing.</a> Fly (Austin). 10 (2), 73-80 (2016).</li><li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2.">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).</li><li>Nern, A., Zhu, Y., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+N-cadherin+interactions+mediate+distinct+steps+in+the+targeting+of+lamina+neurons.">Local N-cadherin interactions mediate distinct steps in the targeting of lamina neurons.</a> Neuron. 58 (1), 34-41 (2008).</li></ol>

Questo protocollo è semplice e non tecnicamente difficili da eseguire, ma ci sono chiave diversi passaggi che se trascurato volontà causare una notevole riduzione di resa cellulare. (Passaggio 2.3.2). È fondamentale che le croci sono sani, e che il cibo non si asciughi. Annaffiature regolari di croci è essenziale per massimizzare il numero di mosche disponibili per dissezione del genotipo giusto e nella corretta fase di sviluppo. Quanto spesso croci c'è bisogno di essere innaffiato variano a seconda il cibo utilizza...

Il sistema visivo di Drosophila è un eccezionale modello per studiare la base genetica dello sviluppo e comportamento. Si compone di un' architettura cellulare stereotipato1 e un toolkit di genetico avanzato per la manipolazione delle cellule specifiche tipi2,3. Un punto di forza di questo sistema è la capacità di interrogare in modo autonomo la funzione del gene in tipi cellulari di interesse con risoluzione singola cella, utilizzando metodi mosaico genetico4,5. Abbiamo cercato di combinare questi strumenti genetici con gli avanzamenti recenti nel sequenziamento di nuova generazione per eseguire cella specifica del tipo trascrittomica e analisi genomica nella singola cella cloni in esperimenti di mosaico genetico.
A tale scopo, è essenziale sviluppare una tecnica robusta ed efficiente per isolare selettivamente popolazioni bassa abbondante delle cellule nel cervello. In precedenza, abbiamo sviluppato un protocollo per isolare tipi cellulari specifici nel sistema visivo durante lo sviluppo Pupa mediante FACS e determinare la loro trascrittomi utilizzando RNA-seq6. In questi esperimenti, la stragrande maggioranza delle cellule di un tipo particolare (ad es. R7 fotorecettori) fluorescente sono stata etichettata. Utilizzando questo metodo, negli esperimenti di mosaico genetico, in cui sono etichettati solo un sottoinsieme delle cellule dello stesso tipo, non siamo riusciti a isolare abbastanza cellule per ottenere dati di sequenziamento di qualità. Per risolvere questo problema, abbiamo cercato di aumentare il rendimento cellulare migliorando il protocollo di dissociazione delle cellule.
Il nostro approccio era quello di diminuire la lunghezza totale del protocollo per massimizzare la salute delle cellule dissociate, migliorare la salute cellulare alterando la dissezione e la dissociazione di buffer e ridurre la quantità di rottura meccanica al tessuto dissecato. Abbiamo testato il protocollo migliore7 usando analisi di mosaico con una cella reprensibile indicatore5 (MARCM), che permette la generazione di singolo fluorescente etichettati cloni particolari tipi di cellule, che sono wild-type o mutanti per un gene di interesse in un in caso contrario eterozigote fly. Dove, in condizioni identiche, il nostro protocollo precedente non è riuscito a generare abbastanza materiale per RNA-seq, il protocollo migliore era successo. Abbiamo riproducibile raggiungere un alto rendimento cellulare (~ 25% delle cellule con etichettate) e ottenere alta qualità RNA-seq dati da appena 1.000 cellule7.
Un numero di protocolli precedentemente è stati descritti per isolare particolare cellula scrive dentro drosofila6,8,9,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16. questi protocolli sono progettati principalmente per isolare le cellule che sono abbondanti all'interno del cervello. Il nostro protocollo è ottimizzato per isolare popolazioni di cellule abbondanti basso (meno di 100 cellule per cervello) nel sistema visivo utilizzando FACS per analisi genomiche e trascrittomica successiva. Con questo protocollo, ci proponiamo di fornire un modo per isolare riproducibile basse abbondanti cellule dal sistema visivo Vola FACS e ottenendo dati del trascrittoma di alta qualità di RNA-seq.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Liberase TM</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401127001</td>
			<td>Proteolytic enzyme blend</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G0350500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutathione</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Culture Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21720024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LK003178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td>RNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free DNase</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript II Reverse Transcriptase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>18064-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>R0191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1028-10X1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaine Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0300-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseOUT</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10777-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity 2x Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0492S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Library Prepration Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT Index Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test Tube with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle-Top Vacuum Filter Systems</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS431153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer F1.5</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5384000020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>656700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 2500 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY&#8211;401&#8211;2501</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of low-abundant cells in the drosophila visual system

Recenti miglioramenti nella sensibilità di sequenziamento di nuova generazione hanno facilitato l'applicazione di analisi genomiche e trascrittomica ad un piccolo numero di cellule. Utilizzando questa tecnologia per lo studio di sviluppo nel sistema visivo della drosofila, che vanta una ricchezza di strumenti genetici specifici del tipo di cella, fornisce un approccio potente per affrontare le basi molecolari di sviluppo con precisa risoluzione cellulare. Un siffatto approccio essere fattibile, è fondamentale avere la capacità di attendibilmente ed efficientemente purificare cellule presenti in abbondanza bassa all'interno del cervello. Qui, presentiamo un metodo che permette di purificazione efficiente di singola cellula Clona in esperimenti di mosaico genetico. Con questo protocollo, realizziamo costantemente un alto rendimento cellulare dopo purificazione mediante fluorescenza attivato cella ordinamento (FACS) (~ 25% di tutte le celle con etichettate) ed eseguito con successo analisi trascrittomica su singola cellula cloni generati attraverso analisi di mosaico con un indicatore di cella reprensibile (MARCM). Questo protocollo è ideale per l'applicazione di analisi genomiche e trascrittomica di tipi cellulari specifici nel sistema visivo, attraverso diverse fasi di sviluppo e nel contesto delle diverse manipolazioni genetiche.

Regime generale Uno schema generale del protocollo è illustrato nella Figura 1. Il protocollo è diviso in tre parti principali: volare lavoro, preparazione del campione, sequenziamento e analisi dei dati. La "Pianificazione prima dell'esperimento" sessione del protocollo non è incluso nel regime generale per semplicità.
Timeline Un calendario delle parti p...

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Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System

Purificazione di basso-abbondanti cellule nel sistema visivo della drosofila

Qui, presentiamo un protocollo di dissociazione delle cellule per isolare in modo efficiente le cellule presenti in abbondanza bassa all'interno del sistema visivo di Drosophila attraverso celle attivate la fluorescenza che ordinano (FACS).

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small ...

Questo metodo può aiutare ad affrontare le domande chiave in biologia, come il modo in cui diversi tipi di cellule vengono generati e organizzati in strutture di ordine superiore con funzioni specifiche. Il principale vantaggio di questa tecnica è che facilita un'efficiente purificazione delle cellule presenti a bassa abbondanza nel sistema visivo Drosophila per l'analisi trascritomica e genomica. Martedì della settimana sei del protocollo, 45 minuti prima delle dissezioni, recuperare una fiala di polvere di papaina da quattro gradi Celsius e incubarla a temperatura ambiente.Successivamente, mettere da parte Complete Schneider's Medium, o CSM, in un tubo Eppendorf a temperatura ambiente da aggiungere alla polvere di papaina in seguito. Da cinque a dieci minuti prima delle dissezioni, utilizzare una siringa per aggiungere il CSM a temperatura ambiente al flaconcino di papaina direttamente attraverso il tappo a una concentrazione di 100 unità per millilitro. Per mescolare, invertire prima il flaconcino per catturare qualsiasi polvere bloccata all'interno del cappuccio e quindi pipettare il contenuto su e giù.Dopo aver mescolato i reagenti, portare l'acqua fino a 37 gradi Celsius in un becher in un bagno d'acqua. Quindi posizionare il flaconcino nel becher per 30 minuti per attivare la papaina e assicurarsi che il flaconcino non galleggia. Mentre la papaina sta incubando, recuperare un'aliquota di miscela enzimatica proteolitica dal congelatore e incubarla a temperatura ambiente.Dopo 30 minuti di attivazione, incubare la papaina a temperatura ambiente. Martedì della sei settimana, sezionare il cervello della pupilla in scena nel CSM freddo con forcep pulite. Sezionare il maggior numero possibile di cervelli in 10 minuti e mettere in comune il cervello in una nuova goccia di CSM freddo.Tagliare i lobi ottici pizzicando alla giunzione del lobo ottico e del cervello centrale. Quindi, aggiungere i lobi sul fondo di un microtubo contenente 500 microlitri di 1x RS. Un microtubo per il tessuto sperimentale e uno per il tessuto di controllo negativo. Tieni i tubi sul ghiaccio.Seziona il maggior numero possibile di lobi in un'ora. Mettere in comune i lobi ottici sezionati in un unico microtubo per eliminare la perdita di tessuto durante il trasferimento tra microtubi. Rimuovere con cura il 1x RS dal microtubo con i lobi ottici sezionati utilizzando una pipetta P200, lasciando una soluzione sufficiente per coprire i lobi.Aggiungere con cura 500 microlitri da 1x RS sul lato del tubo. Lasciare che i lobi si sistemino sul fondo del tubo, quindi pipettare fino a 200 microlitri. Espellere il mix, osservare i lobi in movimento e lasciare che i lobi si sistemino di nuovo.Per i due campioni, aliquote 600 microlitri di papaina attivata a temperatura ambiente in un microtubo. Creare quindi la soluzione di dissociazione. Aggiungere 4,2 microlitri di miscela enzimatica proteolitica a temperatura ambiente in 600 microlitri di soluzione di papaina per ottenere una concentrazione finale di 0,18 WU per millilitro e mescolare la soluzione tubazione su e giù.Quindi rimuovere con cura il 1x RS da ogni campione e aggiungere 300 microlitri di soluzione di dissociazione ai lobi. Incubare i campioni a 25 gradi Celsius. 1.000 giri/min per 15 minuti in un ThermoMixer a microtubo.Nei punti di tempo di 5 e 10 minuti, ferma thermomixer e lascia che i lobi sprofondno nella parte inferiore del microtubo. Pipettare fino a 200 microlitri della soluzione e mescolare. Dopo l'incubazione di 15 minuti, attendere che i lobi si sistemino sul fondo e rimuovere con cura la soluzione di dissociazione dai lobi senza disturbare i lobi.Lavare i lobi due volte con 1x RS. Aggiungere con cura 500 microlitri da 1x RS senza disturbare i lobi. Quindi pipettare con cura 200 microlitri ed espellere delicatamente la soluzione. Lasciare che i lobi affondino sul fondo e si ripetano.Successivamente, lavare ogni campione due volte con 500 microlitri di CSM. Rimuovere con cura il CSM e aggiungere altri 200 microlitri di CSM al tubo. Utilizzando una pipetta P200, interrompere il tessuto tubando su e giù senza schiumare fino a quando la soluzione non è omogenea.Utilizzando una pipetta P200, filtrare la sospensione cellulare attraverso un tappo a rete da 30 micrometri in un tubo fax da 5 millilitri sul ghiaccio. E assicurati che l'intera sospensione sia attraversata. Aggiungere 500 microlitri di CSM per risciacquare il microtubo di dissociazione.E filtrare la soluzione nel tubo fax. Infine, togliere con cura il tappo del tubo fax. Raccogliere la soluzione sotto il filtro a rete con un P200 e aggiungerla al resto della sospensione nel tubo fax.Microscopia confocale di lobi immuno macchiati con anticorpi specifici contro DSRed e GFP, nonché l'anticorpo 24B10 come riferimento per i neuropile lamina e midollo hanno confermato che L3 è l'unico tipo di cellula etichettato sia da DsRed che da GFP nel lobo ottico. Sono stati registrati i dati dei fatti di 100.000 eventi, di cui il 29,9% di tutti gli eventi sono potenziali singoletti. Dopo che i farsa nelle cellule con dimensioni diverse sono stati recintati in base alla granularità e alle dimensioni, le restanti singole cellule, i neuroni L3, sono apparse come ammassi stretti in P1, che era ben separato dalle cellule di sfondo.Seguendo questa procedura, altri metodi come RNA-seq o ATAC-seq possono essere eseguiti per affrontare questioni biologiche attraverso l'analisi dell'espressione genica o dell'organizzazione della cromatina, rispettivamente. Questa tecnica migliora notevolmente la capacità dei ricercatori di esplorare i meccanismi genetici alla base dello sviluppo e della funzione di tessuti complessi utilizzando il sistema visivo Drosophila come modello.

Research

JoVE Journal

Genetics

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Ibridazione fluorescente In Situ ad alta risoluzione in embrioni della drosofila e tessuti mediante amplificazione del segnale Tyramide

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Ricerca

Genetica

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Produzione e purificazione di Baculovirus per applicazione di terapia genica

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CRISPR-mediata di riorganizzazione della struttura della cromatina Loop

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Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System (REQS)

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