Name: analysis of &#946;-amyloid-induced abnormalities on fibrin clot structure by spectroscopy and scanning electron microscopy
Uploaded: 2018-11-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of ÃŽÂ²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

يشكر المؤلفون كاواساكي ماسانوري واسو كازويوشي مايكل فولي من معهد ديسكفري المداواة الثلاثية المؤسسية (TDI) ونيويورك لتوليف مثبطات التفاعل Aβ-الفيبرينوجين ومقترحاتهم القيمة. يشكر المؤلفون أيضا أعضاء المختبر ستريكلاند لمناقشة مفيدة. تم دعم هذا العمل من المعاهد الوطنية للصحة منحة NS104386، ومؤسسة اكتشاف المخدرات مرض الزهايمر، وصندوق التنمية العلاجية روبرتسون إتش، المعاهد الوطنية للصحة منح NS50537، المعهد اكتشاف العلاجات ثلاثي المؤسسية، "مؤسسة اكتشاف المخدرات" مرض الزهايمر، مؤسسة عائلة Rudin، وهيرمان جون أ عن س. س.

1. إعداد Aβ42 والفيبرينوجين للتحليل
<ol><li>إعداد Aβ42 أحادي من مسحوق المجففة بالتبريد<ol>
<li>الحارة مسحوق Aβ42 إلى درجة حرارة الغرفة وتدور إلى أسفل في 1,500 س ز لمدة 30 ثانية.</li>
		<li>إضافة 100 ميليلتر من المثلج هيكسافلورويسوبروبانول (هفيب) لكل 0.5 ملغ مسحوق Aβ42 واحتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد. تحذير: استخد...

<ol>
	<li>Selkoe, D. J., Schenk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease:+molecular+understanding+predicts+amyloid-based+therapeutics.">Alzheimer's disease: molecular understanding predicts amyloid-based therapeutics.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 43, 545-584 (2003).</li><li>Kurz, A., Perneczky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+clearance+as+a+treatment+target+against+Alzheimer's+disease.">Amyloid clearance as a treatment target against Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 24, 61-73 (2011).</li><li>Benilova, I., Karran, E., De Strooper, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+toxic+Abeta+oligomer+and+Alzheimer's+disease:+an+emperor+in+need+of+clothes.">The toxic Abeta oligomer and Alzheimer's disease: an emperor in need of clothes.</a> Nature Neuroscience. 15 (3), 349-357 (2012).</li><li>Karran, E., Hardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critique+of+the+drug+discovery+and+phase+3+clinical+programs+targeting+the+amyloid+hypothesis+for+Alzheimer+disease.">A critique of the drug discovery and phase 3 clinical programs targeting the amyloid hypothesis for Alzheimer disease.</a> Annals of Neurology. 76 (2), 185-205 (2014).</li><li>Yoshikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+cerebral+blood+flow+in+Alzheimer+disease+and+vascular+dementia.">Heterogeneity of cerebral blood flow in Alzheimer disease and vascular dementia.</a> AJNR, American Journal of Neuroradiology. 24 (7), 1341-1347 (2003).</li><li>Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+will+out:+vascular+contributions+to+Alzheimer's+disease.">Blood will out: vascular contributions to Alzheimer's disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (2), 556-563 (2018).</li><li>Ahn, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease+peptide+beta-amyloid+interacts+with+fibrinogen+and+induces+its+oligomerization.">Alzheimer's disease peptide beta-amyloid interacts with fibrinogen and induces its oligomerization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21812-21817 (2010).</li><li>Zamolodchikov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+structural+analysis+of+the+interaction+between+beta-amyloid+and+fibrinogen.">Biochemical and structural analysis of the interaction between beta-amyloid and fibrinogen.</a> Blood. 128 (8), 1144-1151 (2016).</li><li>Cortes-Canteli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrinogen+and+beta-amyloid+association+alters+thrombosis+and+fibrinolysis:+a+possible+contributing+factor+to+Alzheimer's+disease.">Fibrinogen and beta-amyloid association alters thrombosis and fibrinolysis: a possible contributing factor to Alzheimer's disease.</a> Neuron. 66 (5), 695-709 (2010).</li><li>Cortes-Canteli, M., Mattei, L., Richards, A. T., Norris, E. H., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+deposited+in+the+Alzheimer's+disease+brain+promotes+neuronal+degeneration.">Fibrin deposited in the Alzheimer's disease brain promotes neuronal degeneration.</a> Neurobiology of Aging. 36 (2), 608-617 (2015).</li><li>Liao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+characterization+of+postmortem+amyloid+plaques+isolated+by+laser+capture+microdissection.">Proteomic characterization of postmortem amyloid plaques isolated by laser capture microdissection.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 37061-37068 (2004).</li><li>Zamolodchikov, D., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abeta+delays+fibrin+clot+lysis+by+altering+fibrin+structure+and+attenuating+plasminogen+binding+to+fibrin.">Abeta delays fibrin clot lysis by altering fibrin structure and attenuating plasminogen binding to fibrin.</a> Blood. 119 (14), 3342-3351 (2012).</li><li>Ahn, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Abeta-fibrinogen+interaction+inhibitor+rescues+altered+thrombosis+and+cognitive+decline+in+Alzheimer's+disease+mice.">A novel Abeta-fibrinogen interaction inhibitor rescues altered thrombosis and cognitive decline in Alzheimer's disease mice.</a> The Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1049-1062 (2014).</li><li>Singh, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminopyrimidine+Class+Aggregation+Inhibitor+Effectively+Blocks+Abeta-Fibrinogen+Interaction+and+Abeta-Induced+Contact+System+Activation.">Aminopyrimidine Class Aggregation Inhibitor Effectively Blocks Abeta-Fibrinogen Interaction and Abeta-Induced Contact System Activation.</a> Biochemistry. 57 (8), 1399-1409 (2018).</li><li>Pretorius, E., Mbotwe, S., Bester, J., Robinson, C. J., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+induction+of+anomalous+and+amyloidogenic+blood+clotting+by+molecular+amplification+of+highly+substoichiometric+levels+of+bacterial+lipopolysaccharide.">Acute induction of anomalous and amyloidogenic blood clotting by molecular amplification of highly substoichiometric levels of bacterial lipopolysaccharide.</a> Journal of the Royal Society Interface. 13 (122), (2016).</li><li>Veklich, Y., Francis, C. W., White, J., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+studies+of+fibrinolysis+by+electron+microscopy.">Structural studies of fibrinolysis by electron microscopy.</a> Blood. 92 (12), 4721-4729 (1998).</li><li>Weisel, J. W., Nagaswami, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+modeling+of+fibrin+polymerization+kinetics+correlated+with+electron+microscope+and+turbidity+observations:+clot+structure+and+assembly+are+kinetically+controlled.">Computer modeling of fibrin polymerization kinetics correlated with electron microscope and turbidity observations: clot structure and assembly are kinetically controlled.</a> Biophysical Journal. 63 (1), 111-128 (1992).</li><li>Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+clots+are+equilibrium+polymers+that+can+be+remodeled+without+proteolytic+digestion.">Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion.</a> Scientific Reports. 2, 879 (2012).</li><li>Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+amyloid+beta-peptide+(Abeta)+aggregation+using+the+Congo+red-Abeta+(CR-abeta)+spectrophotometric+assay.">Quantifying amyloid beta-peptide (Abeta) aggregation using the Congo red-Abeta (CR-abeta) spectrophotometric assay.</a> Analytical Biochemistry. 266 (1), 66-76 (1999).</li><li>Zhao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+amyloid+formation+by+turbidity+assay-seeing+through+the+cloud.">Measurement of amyloid formation by turbidity assay-seeing through the cloud.</a> Biophysical Reviews. 8 (4), 445-471 (2016).</li><li>Bester, J., Soma, P., Kell, D. B., Pretorius, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+and+ultrastructural+characteristics+of+whole+blood+and+plasma+in+Alzheimer-type+dementia,+and+the+possible+role+of+bacterial+lipopolysaccharides+(LPS).">Viscoelastic and ultrastructural characteristics of whole blood and plasma in Alzheimer-type dementia, and the possible role of bacterial lipopolysaccharides (LPS).</a> Oncotarget. 6 (34), 35284-35303 (2015).</li><li>Pretorius, E., Page, M. J., Mbotwe, S., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-binding+protein+(LBP)+can+reverse+the+amyloid+state+of+fibrin+seen+or+induced+in+Parkinson's+disease.">Lipopolysaccharide-binding protein (LBP) can reverse the amyloid state of fibrin seen or induced in Parkinson's disease.</a> PLoS One. 13 (3), e0192121 (2018).</li><li>Kell, D. B., Pretorius, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+behaving+badly.+Substoichiometric+molecular+control+and+amplification+of+the+initiation+and+nature+of+amyloid+fibril+formation:+lessons+from+and+for+blood+clotting.">Proteins behaving badly. Substoichiometric molecular control and amplification of the initiation and nature of amyloid fibril formation: lessons from and for blood clotting.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 123, 16-41 (2017).</li><li>Wolberg, A. S., Campbell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombin+generation,+fibrin+clot+formation+and+hemostasis.">Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis.</a> Transfusion and Apheresis Science. 38 (1), 15-23 (2008).</li><li>Soon, A. S., Lee, C. S., Barker, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+fibrin+matrix+properties+via+knob:hole+affinity+interactions+using+peptide-PEG+conjugates.">Modulation of fibrin matrix properties via knob:hole affinity interactions using peptide-PEG conjugates.</a> Biomaterials. 32 (19), 4406-4414 (2011).</li></ol>

الأساليب الموصوفة هنا توفر وسيلة سريعة واستنساخه لتقييم فيبرينوجين جلطة تشكيل في المختبر. وعلاوة على ذلك، بساطة النظام يجعل تفسير كيف يؤثر Aβ فيبرينوجين جلطة تكوين وهيكل نسبيا على التوالي إلى الأمام. في منشور سابق هذا المعمل، وقد تبين أنه يمكن استخدام هذه الاختبارات لاختبار المركبا?...

مرض الزهايمر (AD)، مرض الأعصاب مما يؤدي إلى التدهور المعرفي في المرضى المسنين، يغلب عليها الطابع ينبع من التعبير (Aβ) بيتا-اميلويد الشاذ والتجميع والتخليص البصر أدى إلى تسمم1، 2-على الرغم من الرابطة تميز جيدا بين المجاميع Aβ والإعلان3، الآليات الدقيقة الكامنة وراء باثولوجيا المرض ليست مفهومة جيدا4. تزايد الأدلة تقترح أن العجز neurovascular تلعب دوراً في تطور وشدة5من الإعلان، كما Aβ تتفاعل مباشرة مع مكونات نظام الدورة الدموية6. وقد Aβ إلى تفاعل عالية تقارب مع الفيبرينوجين7،8، الذي يموضع أيضا رواسب Aβ المرضى الإعلانية والماوس نماذج9،،من1011. وعلاوة على ذلك، يدفع التفاعل Aβ-الفيبرينوجين تشكيل جلطة فيبرينوجين الشاذ والهيكل، فضلا عن مقاومة فيبرينوليسيس9،12. أحد الاحتمالات العلاجية في علاج الإعلانية، هو التخفيف من حدة العجز في الدورة الدموية عن طريق تثبيط التفاعل بين13،Aβ والفيبرينوجين14. ولذلك، حددنا عدة مركبات الصغيرة التي تعوق التفاعل Aβ-الفيبرينوجين باستخدام فحص إنتاجية عالية والكيمياء الطبية النهج13،14. لاختبار فعالية مثبطات التفاعل Aβ-الفيبرينوجين، نحن الأمثل طريقتين للتحليل في المختبر فيبرينوجين جلطة تشكيل: تجلط التعكر المقايسة، وفحص المجهر الإلكتروني (SEM)14.
تجلط التعكر المقايسة أسلوب مستقيم إلى الأمام والسريع لرصد فيبرينوجين جلطة تكوين باستخدام مطيافية الأشعة فوق البنفسجية-المرئية. متزايدة مبعثرة تجلط فيبرينوجين أشكال، الخفيفة ويزيد من التعكر للحل. على العكس من ذلك، عندما Aβ غير موجود، يتم تغيير هيكل تجلط فيبرينوجين، وتقليل التعكر المخلوط (الشكل 1). ويمكن تقييم تأثير المركبات المثبطة لإمكانية استعادة التعكر جلطة من التشوهات الناجمة عن Aβ. حين المقايسة التعكر يسمح للتحليل السريع لظروف متعددة، فإنه يوفر معلومات محدودة عن تجلط الشكل والهيكل. ووزارة شؤون المرأة، التي كشفت طبوغرافية الأجسام الصلبة بمسبار الإلكترون، يسمح بتحليل بنية ثلاثية الأبعاد بجلطة15،16،،من1718 وتقييم كيفية وجود Aβ و المركبات المثبطة أو يغير هذا الهيكل9،14. كل قياس الطيف الكتلي ووزارة شؤون المرأة هي التقنيات المختبرية الكلاسيكية التي استخدمت لأغراض مختلفة، على سبيل المثال، كانت تستخدم لرصد تراكم اميلويد19،20. وبالمثل، يستخدم أيضا وزارة شؤون المرأة لتحليل فيبرينوجين جلطة تكونت من البلازما من مرض الزهايمر، باركنسون والسكتة الدماغية انصماميه المرضى21،،من2223. البروتوكولات المقدمة هنا هي الأمثل لتقييم تكوين فيبرينوجين جلطة بطريقة سريعة واستنساخه.
ويوفر البروتوكول التالي التعليمات الخاصة بإعداد في المختبر فيبرينوجين-كلوت على حد سواء مع ودون Aβ. أنها أيضا تفاصيل أساليب لتحليل تأثير Aβ على تشكيل جلطة فيبرينوجين والهيكل. هو أظهرت فعالية هاتين الطريقتين لقياس تثبيط التفاعل Aβ-الفيبرينوجين باستخدام مؤشر التجارة والتنمية-2760، مجمع مثبطة صغيرة14. هذه الأساليب، كل على حدة ومعا، تسمح بتحليل في المختبر فيبرينوجين جلطة تشكيل سريع ومباشر.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fibriogen, Plasminogen-Depleted, Plasma</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>341578</td>
			<td>keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-Amyloid (1-42), Human</td>
			<td>Anaspec</td>
			<td>AS-20276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from human plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>105228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTERED</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>C70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Syringe, 0.2&#181;M, 25mm</td>
			<td>Pall</td>
			<td>4612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia.</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLVV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat Bottom</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>21377203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectramax Plus384</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>89212-396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, 5417R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 200 Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>15-337-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Rotator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>2314-1CEQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spare washers for cover slip holder</td>
			<td>Tousimis</td>
			<td>8766-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow Stem Pipets - Sedi-Pet</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>70967-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample holder for CPD (Cover slip holder)</td>
			<td>Tousimis</td>
			<td>8766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mount Holder Box, Pin Type</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>76610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round glass cover slides (12 mm)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>16120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Cacodylate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM Stubs, Tapered end pin.</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>75192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm OD</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16084-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosamdri-815 Critical Point Dryer with Gold/Palladium target</td>
			<td>Tousimis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denton Desk IV Coater</td>
			<td>Denton Vacuum</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leo 1550 FE-SEM</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smart SEM Software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of &#946;-amyloid-induced abnormalities on fibrin clot structure by spectroscopy and scanning electron microscopy

تعرض هذه المقالة طرق لتوليد في المختبر فيبرينوجين جلطات وتحليل تأثير بروتين اميلويد بيتا (Aβ) على تشكيل جلطة وهيكل بقياس الطيف الكتلي والمسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM). لقد ثبت Aβ، التي تشكل مجاميع اميلويد الأعصاب في مرض الزهايمر (AD)، للتفاعل مع الفيبرينوجين. يجعل هذا التفاعل Aβ-الفيبرينوجين تجلط فيبرينوجين هيكلياً غير طبيعي ومقاومة ل fibrinolysis. التشوهات الناجمة عن Aβ في تخثر فيبرينوجين قد تسهم أيضا في جوانب المخية الباثولوجي الإعلانية مثل ميكروينفاركتس، التهاب، فضلا عن أنجيوباثي اميلويد الدماغي (هيئة الطيران المدني). نظراً للدور الحاسم يحتمل أن العجز في نيوروفاسكولار في الباثولوجيا الإعلانية، تطوير المركبات التي يمكن أن تمنع أو تقلل من التفاعل Aβ-الفيبرينوجين له قيمة علاجية واعدة. في المختبر الأساليب التي فيها فيبرينوجين تشكيل جلطة يمكن بسهولة ومنهجية تقييم أدوات يمكن أن تكون مفيدة لتطوير المركبات العلاجية. قدم هنا بروتوكول أمثل لجيل في المختبر من جلطة فيبرينوجين، فضلا عن تحليل لتأثير مثبطات التفاعل Aβ و Aβ-الفيبرينوجين. مقايسة التعكر تجلط السريع، واستنساخه بدرجة عالية، ويمكن استخدامها لاختبار شروط متعددة في وقت واحد، مما يسمح لفحص عدد كبير من مثبطات Aβ-الفيبرينوجين. ويمكن تقييم ضرب المركبات من هذا الفحص كذلك لقدرتها على التخفيف من التشوهات الهيكلية المستحثة Aβ فيبرينوجين جلطة البنية باستخدام sem. وأظهرت فعالية هذه البروتوكولات الأمثل هو هنا استخدام TDI-2760، مثبط تفاعل Aβ-الفيبرينوجين التي تم تحديدها مؤخرا.

في في المختبر تخثر الإنزيم (التعكر)، كليفس ثرومبين الإنزيم الفيبرينوجين، أسفر عن تشكيل شبكة فيبرينوجين24. يسبب هذا تشكيل جلطة فيبرينوجين تشتت الضوء يمر من خلال الحل، نتج عنه زيادة تعكر (الشكل 1)، مخفري قبل نهاية فترة القراءة (ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of ÃŽÂ²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

تحليل للتشوهات التي يسببها بيتا-اميلويد فيبرينوجين جلطة هيكل بالتحليل الطيفي، وفحص المجهر الإلكتروني

المقدمة هنا هي اثنين من الأساليب التي يمكن استخدامها منفردة أو مجتمعة لتحليل أثر بيتا-اميلويد على هيكل فيبرينوجين جلطة. وشملت بروتوكول لإنشاء في المختبر فيبرينوجين جلطة، تليها التعكر تجلط والمجهر الإلكتروني المسح أساليب.

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

الميزة الرئيسية لهذه اللوحة القائمة على الكسارة فحص هو أنه سريع ويسمح لعدة مثبطات التفاعل فيبرينوجين اميلويد بيتا ليتم فحصها في وقت واحد دون إعداد متطورة أو متطلبات. يمكن تقييم مركبات الرأس الموجودة في مقايسة التعكر في الـ Fibrin لمزيد من التقييم لقدرتها على استعادة الشذوذ الهيكلي الناجم عن A-beta في جلطات الفيبرين التي تم تحليلها عن طريق مسح المجهر الإلكتروني. إن البرهان المرئي على إعداد الجلطات لمسح التحليل المجهري للإلكترون أمر بالغ الأهمية لأن أي اختلافات في الإعداد يمكن أن تسهم في الاختلافات داخل النتائج التجريبية.التركيز في هذه المظاهرة هنا هو على التفاعلات الفيبرينوجين A-بيتا. يمكن تعديل هذا البروتوكول بسهولة لتحليل التفاعلات الأخرى مع البروتينات الأخرى والمركبات مع جلطة الفيبرين. تبدأ بإضافة 1.5 micromolar من الفيبرينوجين الطازجة في 200 microliters من تشكيل جلطة العازلة لكل A-بيتا السلبية 42 تحتوي على الآبار والسيطرة واحتضان لوحة على منصة الدورية في درجة حرارة الغرفة.بعد 30 دقيقة في وقت واحد إضافة 30 ميكرولترات من محلول الخثرات الطازجة المعدة مباشرة إلى مركز الفيرينوجين التي تحتوي على جيدا لبدء تشكيل جلطة وقراءة فورا امتصاص الجلطات في المختبر في 350 نانومتر، وتكرار القياس كل 30 إلى 60 ثانية على مدى 10 دقيقة. لتقييم تأثير مثبطات التفاعل A-beta fibrinogen على هيكل جلطة الفيبرين ، استخدم أولاً ملقط لوضع نظيف ، 12 ملليمترًا غطاء دائرة زجاجية سيليكونية ينزلق إلى الآبار الفردية من لوحة 12 بئرًا وإضافة 80 ميكرولترات من الفيبرينوجين على كل زلة غطاء ، ونشر الحل بلطف بحيث يتم توزيعها بالتساوي. إضافة 20 ميكرولترات من حل ثرومبين إلى كل بئر لبدء تشكيل جلطة.غطي الطبق لاحتضان لمدة 30 إلى 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، ثم غمر كل جلطة بلطف في ميليلترين من عازلة cacodylate الصوديوم الباردة للجليد لمدة دقيقتين ، مغطاة ، في درجة حرارة الغرفة مرتين ، باستخدام ماصة ملليلتر واحدة لإزالة المخزن المؤقت بعناية بعد كل غسل. بعد الغسيل الأخير ، تحقق من حالة تشكيل الجلطة على زلة الغطاء ، ثم قم بإصلاح الجلطات في 2-3 ملليلتر من الثلج البارد 2٪ من الجلوتارالديهيد على الجليد لمدة 30 دقيقة. في نهاية الحضانة، وإزالة بلطف الجلثارالدهيد من كل بئر وغسل الجلطات مع عازلة الصوديوم الطازجة كما هو موضح على الجليد.لترطيب الجلطات الثابتة في سلسلة متدرجة من خمس دقائق الإيثانول البارد الجليد يغسل على الجليد دون إزالة الإيثانول تماما بين يغسل للحفاظ على الجلطات محمية من التعرض للهواء. خلال غسل الإيثانول 100٪ الماضي، نقل الغطاء زلات إلى حامل عينة مجفف نقطة حرجة، ووضع ما لا يقل عن 1 غسالة بين كل زلة الغطاء ووضع حامل في غرفة مجفف نقطة حرجة مليئة الإيثانول. بعد دورة تجفيف 30 دقيقة، استخدم شريط الكربون لتركيب الغطاء ينزلق على المجهر الإلكتروني المسح الفردية ونقل العينات إلى غرفة الطلاء sputter من معطف فراغ sputter.ثم معطف sputter أقل من 20 نانومتر من الذهب البلاديوم أو غيرها من المواد موصل على العينات لمدة 25 ثانية في أربعة angstroms في الثانية الواحدة وصورة العينات على المجهر الإلكتروني المسح مجهزة نوع اثنين كاشف الإلكترونات الثانوية في أربعة كيلوفولت. تكوين جلطة الفيبرين يسبب تشتت الضوء الذي يمر عبر الحل، مما يؤدي إلى زيادة التعكر الذي الهضاب في نهاية فترة القراءة. عندما يتم احتضان الفيبرينوجين في وجود A-بيتا 42 يتناقص عكر الحل مع منحنى تصل إلى أقصى ارتفاع من نصف تقريبا أن من الفيبرينوجين وحده.في وجود A-بيتا 42 مُنع التفاعل يتم تحسين تأثير بيتا اميلويد والعكر أعلى من ذلك مع بيتا فقط. لا يظهر تأثير مانع بسبب عكر الخلفية كما مركب لا يغير من عكرة تجلط الفيبرين عندما يكون A-beta غائبة. علاوة على ذلك ، فإن تكوين الجلطات في وجود GPRP ، وهو ببتيد معروف بالتدخل في البلمرة الفيبرين ، يوضح انخفاضًا كبيرًا في التعكر مقارنة بتكوين جلطة الفيبرين في غياب المانع.الفيبرينوجين ولدت في وجود ثربن وكلوريد الكالسيوم تشكل فقط شبكة الفيبرين مع خيوط ممدود ومتشابك من الفيبرين وكذلك حزم أكبر. عندما A-بيتا هو الحاضر, أصبحت أرق المواضيع الفيبرين مع كتل لزجة عدة في المجاميع, مما يدل على تشوهات الهيكلية الناجمة عن A-بيتا. بما يتفق مع نتائج فحص التعكر، تشكيل جلطة في وجود A-بيتا مانع التفاعل الفيبرينوجين جزئيا استعادة هيكل جلطة الفيبرين من التغيرات الناجمة عن A-بيتا كما لوحظ عدد أقل من الكتل مع هذا العلاج.تم تحسين تحليل تحليل المجهر الإلكتروني الجلطة والمسح الإلكتروني لتقييم العديد من مثبطات التفاعل الفيبرينوجين A-beta بطريقة سريعة وقابلة للتكرار. وقريبا سوف توفر البيانات معلومات قيمة حول تشكيل جلطة الفيبرين التي يمكن تطبيقها على مزيد من الدراسات سواء في المختبر وفي الجسم الحي.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

طريقة لتصور وتحليل غشاء متبادلة البروتينات التي نقل المجهر

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

عالية الدقة تحليل الجسيمات واحد من البريد الإلكتروني المجهر الصور باستخدام سفير

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

بيوبانينج شبه الآلي المكتبات عرض البكتيريا الببتيد تقارب كاشف اكتشاف وتحليل يعزل الناتجة

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems

تنويعات على سلبية وصمة عار أساليب الميكروسكوب الإلكتروني: أدوات للتصدي لتحدي الأنظمة

Negative stain electron microscopy (EM) allows relatively simple and quick observation of macromolecules and macromolecular complexes through the use of ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

تحليل البروتين الحيوي المجمعات تجميعها على والإفراج عن بيوسينسور بيولايير قياس التداخل باستخدام الطيف الكتلي والمجهر الإلكتروني

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

تصوير الميتوكوندريا والشبكية الإندوبلازمية بواسطة الضوء المترابطة والفحص المجهري للإلكترون الحجم

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

المقطع المستعرض من الأرز الناضج(Oryza sativa L.) حبات لمسح المجهر الإلكتروني التصوير باستخدام نصائح ماصة كدعم تعطيل

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

تحليل خلية واحدة من الأليل النشطة نسخيا بواسطة جزيء واحد FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

المجهر أحادي الجسيمات كريو إلكترون: من عينة إلى هيكل

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

شبكات المجهر الإلكتروني للإرسال بالنمط المجهري لتحديد مواقع الخلايا مباشرة ضمن سير عمل التصوير المقطعي بالتبريد والإلكترون للخلية الكاملة

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...