Name: analysis of &#946;-amyloid-induced abnormalities on fibrin clot structure by spectroscopy and scanning electron microscopy
Uploaded: 2018-11-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of ÃŽÂ²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Forfattere takke nationer Kawasaki, Kazuyoshi Aso og Michael Foley fra Tri-institutionelle Therapeutics Discovery Institute (TDI), New York for syntese af Aβ-fibrinogen interaktion hæmmere og deres værdifulde forslag. Forfatterne også takke medlemmerne af Strickland lab for nyttig diskussion. Dette arbejde blev støttet af NIH grant NS104386, Alzheimer's Drug Discovery Foundation og Robertson terapeutiske Udviklingsfond for H.A., NIH give NS50537, Tri-institutionelle Therapeutics Discovery Institut, Alzheimer's Drug Discovery Foundation, RUDIN Family Foundation, og John A. Herrmann for S.S.

1. forberedelse af Aβ42 og Fibrinogen til analyse
<ol><li>Forberede monomere Aβ42 fra frysetørrede pulver<ol>
<li>Varm Aβ42 pulver til stuetemperatur og spin-ned på 1.500 x g for 30 s.</li>
		<li>Tilsæt 100 µL af iskolde hexafluoroisopropanol (HFIP) pr. 0,5 mg Aβ42 pulver og Inkuber i 30 min på is. FORSIGTIGHED: Vær forsigtig ved håndtering af HFIP og udføre alle trinene i en kemisk hætte.</li>
		<li>Forberede 20 µL delprøver og lad film air tørre i en kemisk hood for 2-3 h. film kan opbevares ved-20...

<ol>
	<li>Selkoe, D. J., Schenk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease:+molecular+understanding+predicts+amyloid-based+therapeutics.">Alzheimer's disease: molecular understanding predicts amyloid-based therapeutics.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 43, 545-584 (2003).</li><li>Kurz, A., Perneczky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+clearance+as+a+treatment+target+against+Alzheimer's+disease.">Amyloid clearance as a treatment target against Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 24, 61-73 (2011).</li><li>Benilova, I., Karran, E., De Strooper, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+toxic+Abeta+oligomer+and+Alzheimer's+disease:+an+emperor+in+need+of+clothes.">The toxic Abeta oligomer and Alzheimer's disease: an emperor in need of clothes.</a> Nature Neuroscience. 15 (3), 349-357 (2012).</li><li>Karran, E., Hardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critique+of+the+drug+discovery+and+phase+3+clinical+programs+targeting+the+amyloid+hypothesis+for+Alzheimer+disease.">A critique of the drug discovery and phase 3 clinical programs targeting the amyloid hypothesis for Alzheimer disease.</a> Annals of Neurology. 76 (2), 185-205 (2014).</li><li>Yoshikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+cerebral+blood+flow+in+Alzheimer+disease+and+vascular+dementia.">Heterogeneity of cerebral blood flow in Alzheimer disease and vascular dementia.</a> AJNR, American Journal of Neuroradiology. 24 (7), 1341-1347 (2003).</li><li>Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+will+out:+vascular+contributions+to+Alzheimer's+disease.">Blood will out: vascular contributions to Alzheimer's disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (2), 556-563 (2018).</li><li>Ahn, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease+peptide+beta-amyloid+interacts+with+fibrinogen+and+induces+its+oligomerization.">Alzheimer's disease peptide beta-amyloid interacts with fibrinogen and induces its oligomerization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21812-21817 (2010).</li><li>Zamolodchikov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+structural+analysis+of+the+interaction+between+beta-amyloid+and+fibrinogen.">Biochemical and structural analysis of the interaction between beta-amyloid and fibrinogen.</a> Blood. 128 (8), 1144-1151 (2016).</li><li>Cortes-Canteli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrinogen+and+beta-amyloid+association+alters+thrombosis+and+fibrinolysis:+a+possible+contributing+factor+to+Alzheimer's+disease.">Fibrinogen and beta-amyloid association alters thrombosis and fibrinolysis: a possible contributing factor to Alzheimer's disease.</a> Neuron. 66 (5), 695-709 (2010).</li><li>Cortes-Canteli, M., Mattei, L., Richards, A. T., Norris, E. H., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+deposited+in+the+Alzheimer's+disease+brain+promotes+neuronal+degeneration.">Fibrin deposited in the Alzheimer's disease brain promotes neuronal degeneration.</a> Neurobiology of Aging. 36 (2), 608-617 (2015).</li><li>Liao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+characterization+of+postmortem+amyloid+plaques+isolated+by+laser+capture+microdissection.">Proteomic characterization of postmortem amyloid plaques isolated by laser capture microdissection.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 37061-37068 (2004).</li><li>Zamolodchikov, D., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abeta+delays+fibrin+clot+lysis+by+altering+fibrin+structure+and+attenuating+plasminogen+binding+to+fibrin.">Abeta delays fibrin clot lysis by altering fibrin structure and attenuating plasminogen binding to fibrin.</a> Blood. 119 (14), 3342-3351 (2012).</li><li>Ahn, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Abeta-fibrinogen+interaction+inhibitor+rescues+altered+thrombosis+and+cognitive+decline+in+Alzheimer's+disease+mice.">A novel Abeta-fibrinogen interaction inhibitor rescues altered thrombosis and cognitive decline in Alzheimer's disease mice.</a> The Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1049-1062 (2014).</li><li>Singh, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminopyrimidine+Class+Aggregation+Inhibitor+Effectively+Blocks+Abeta-Fibrinogen+Interaction+and+Abeta-Induced+Contact+System+Activation.">Aminopyrimidine Class Aggregation Inhibitor Effectively Blocks Abeta-Fibrinogen Interaction and Abeta-Induced Contact System Activation.</a> Biochemistry. 57 (8), 1399-1409 (2018).</li><li>Pretorius, E., Mbotwe, S., Bester, J., Robinson, C. J., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+induction+of+anomalous+and+amyloidogenic+blood+clotting+by+molecular+amplification+of+highly+substoichiometric+levels+of+bacterial+lipopolysaccharide.">Acute induction of anomalous and amyloidogenic blood clotting by molecular amplification of highly substoichiometric levels of bacterial lipopolysaccharide.</a> Journal of the Royal Society Interface. 13 (122), (2016).</li><li>Veklich, Y., Francis, C. W., White, J., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+studies+of+fibrinolysis+by+electron+microscopy.">Structural studies of fibrinolysis by electron microscopy.</a> Blood. 92 (12), 4721-4729 (1998).</li><li>Weisel, J. W., Nagaswami, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+modeling+of+fibrin+polymerization+kinetics+correlated+with+electron+microscope+and+turbidity+observations:+clot+structure+and+assembly+are+kinetically+controlled.">Computer modeling of fibrin polymerization kinetics correlated with electron microscope and turbidity observations: clot structure and assembly are kinetically controlled.</a> Biophysical Journal. 63 (1), 111-128 (1992).</li><li>Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+clots+are+equilibrium+polymers+that+can+be+remodeled+without+proteolytic+digestion.">Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion.</a> Scientific Reports. 2, 879 (2012).</li><li>Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+amyloid+beta-peptide+(Abeta)+aggregation+using+the+Congo+red-Abeta+(CR-abeta)+spectrophotometric+assay.">Quantifying amyloid beta-peptide (Abeta) aggregation using the Congo red-Abeta (CR-abeta) spectrophotometric assay.</a> Analytical Biochemistry. 266 (1), 66-76 (1999).</li><li>Zhao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+amyloid+formation+by+turbidity+assay-seeing+through+the+cloud.">Measurement of amyloid formation by turbidity assay-seeing through the cloud.</a> Biophysical Reviews. 8 (4), 445-471 (2016).</li><li>Bester, J., Soma, P., Kell, D. B., Pretorius, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+and+ultrastructural+characteristics+of+whole+blood+and+plasma+in+Alzheimer-type+dementia,+and+the+possible+role+of+bacterial+lipopolysaccharides+(LPS).">Viscoelastic and ultrastructural characteristics of whole blood and plasma in Alzheimer-type dementia, and the possible role of bacterial lipopolysaccharides (LPS).</a> Oncotarget. 6 (34), 35284-35303 (2015).</li><li>Pretorius, E., Page, M. J., Mbotwe, S., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-binding+protein+(LBP)+can+reverse+the+amyloid+state+of+fibrin+seen+or+induced+in+Parkinson's+disease.">Lipopolysaccharide-binding protein (LBP) can reverse the amyloid state of fibrin seen or induced in Parkinson's disease.</a> PLoS One. 13 (3), e0192121 (2018).</li><li>Kell, D. B., Pretorius, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+behaving+badly.+Substoichiometric+molecular+control+and+amplification+of+the+initiation+and+nature+of+amyloid+fibril+formation:+lessons+from+and+for+blood+clotting.">Proteins behaving badly. Substoichiometric molecular control and amplification of the initiation and nature of amyloid fibril formation: lessons from and for blood clotting.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 123, 16-41 (2017).</li><li>Wolberg, A. S., Campbell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombin+generation,+fibrin+clot+formation+and+hemostasis.">Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis.</a> Transfusion and Apheresis Science. 38 (1), 15-23 (2008).</li><li>Soon, A. S., Lee, C. S., Barker, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+fibrin+matrix+properties+via+knob:hole+affinity+interactions+using+peptide-PEG+conjugates.">Modulation of fibrin matrix properties via knob:hole affinity interactions using peptide-PEG conjugates.</a> Biomaterials. 32 (19), 4406-4414 (2011).</li></ol>

De metoder, der beskrives her give en reproducerbar og hurtigt middel til vurdering af fibrin blodprop dannelse i vitro. Desuden er enkelheden i systemet gør fortolkning af hvordan Aβ påvirker fibrin koageldannelse og struktur forholdsvis ligetil. I denne øvelse forrige udgivelse, blev det vist, at disse assays kan bruges til at teste forbindelser for deres evne til at hæmme Aβ-fibrinogen interaktion13,14. Ved hjælp af disse to assays, en serie af...

Alzheimers sygdom (AD), en neurodegenerativ sygdom fører til kognitiv tilbagegang i ældre patienter, overvejende skyldes unormal beta-amyloid (Aβ) udtryk, sammenlægning og nedsat clearance resulterer i neurotoksicitet1, 2. trods den godt karakteriseret association mellem Aβ aggregater og AD3, de underliggende sygdom patologi præcise mekanismer er ikke vel forstået4. Stadig flere beviser antyder, at neurovaskulære underskud rolle for progression og sværhedsgraden af AD5, som Aβ interagerer direkte med komponenter af kredsløbssygdomme6. Aβ har en høj-affinitet interaktion med fibrinogen7,8, som også lokaliserer Aβ indskud i både AD patienter og mus modeller9,10,11. Derudover inducerer Aβ-fibrinogen interaktion unormal fibrin-koageldannelse samt struktur og modstand mod fibrinolyse9,12. En terapeutisk mulighed i behandling af annonce, lindre kredsløbssygdomme underskud ved at hæmme samspillet mellem Aβ og fibrinogen13,14. Derfor identificerede vi, flere små forbindelser hæmme Aβ-fibrinogen interaktion ved hjælp af high throughput screening og medicinalkemi tilgange13,14. For at teste effekten af Aβ-fibrinogen interaktion hæmmere, vi optimeret to metoder til analyse af in vitro- fibrin koageldannelse: størkne turbiditet assay og scanning elektronmikroskopi (SEM)14.
Blodprop turbiditet assay er en straight-forward og hurtig metode til overvågning af fibrin koageldannelse ved hjælp af UV-synlige spektroskopi. Som fibrin blodprop former, lys er mere og mere spredt og turbiditet af løsningen øger. Omvendt, når Aβ er til stede, strukturen af fibrin blodprop er ændret, og turbiditet i blandingen er reduceret (figur 1). Effekten af hæmmende forbindelser kan vurderes for potentiale til at gendanne blodprop turbiditet fra Aβ-induceret abnormiteter. Mens turbiditet analysen giver mulighed for hurtig analyse af flere betingelser, giver det begrænsede oplysninger om blodprop form og struktur. SEM, hvor topografi af faste genstande er afsløret af elektron sonde, giver mulighed for analyse af blodprop15,16,17,18 3D arkitektur og vurdering af hvordan tilstedeværelsen af Aβ og / eller hæmmende stoffer ændrer struktur9,14. Både massespektrometri og SEM er klassisk laboratoriemetoder, der er blevet anvendt til forskellige formål, eksempelvis spektrofotometri bruges til overvågning af amyloid sammenlægning19,20. SEM bruges ligeledes, også til at analysere fibrin blodprop dannet fra plasma af Alzheimers, Parkinsons og tromboemboliske apopleksi patienter21,22,23. Protokollerne præsenteres her er optimeret til vurdering af fibrin-koageldannelse i en reproducerbar og hurtig måde.
Følgende protokol indeholder vejledning til forberedelse af en in vitro- fibrin-blodprop både med og uden Aβ. Det beskriver også metoder til at analysere effekten af Aβ på fibrin koageldannelse og struktur. Effektiviteten af disse to metoder til måling af hæmning af Aβ-fibrinogen interaktion er påvist ved hjælp af TDI-2760, en lille hæmmende sammensatte14. Disse metoder, både individuelt og sammen, giver mulighed for hurtig og enkel analyse af in vitro- fibrin blodprop dannelse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fibriogen, Plasminogen-Depleted, Plasma</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>341578</td>
			<td>keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-Amyloid (1-42), Human</td>
			<td>Anaspec</td>
			<td>AS-20276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from human plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>105228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTERED</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>C70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Syringe, 0.2&#181;M, 25mm</td>
			<td>Pall</td>
			<td>4612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia.</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLVV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat Bottom</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>21377203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectramax Plus384</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>89212-396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, 5417R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 200 Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>15-337-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Rotator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>2314-1CEQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spare washers for cover slip holder</td>
			<td>Tousimis</td>
			<td>8766-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow Stem Pipets - Sedi-Pet</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>70967-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample holder for CPD (Cover slip holder)</td>
			<td>Tousimis</td>
			<td>8766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mount Holder Box, Pin Type</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>76610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round glass cover slides (12 mm)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>16120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Cacodylate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM Stubs, Tapered end pin.</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>75192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm OD</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16084-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosamdri-815 Critical Point Dryer with Gold/Palladium target</td>
			<td>Tousimis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denton Desk IV Coater</td>
			<td>Denton Vacuum</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leo 1550 FE-SEM</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smart SEM Software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of &#946;-amyloid-induced abnormalities on fibrin clot structure by spectroscopy and scanning electron microscopy

Denne artikel præsenterer metoder til at skabe i vitro fibrin blodpropper og analysere effekten af beta-amyloid (Aβ) protein på koageldannelse og struktur ved SPEKTROMETRI og scanning elektronmikroskopi (SEM). Aβ, som danner neurotoksiske amyloid aggregater i Alzheimers sygdom (AD), har vist sig at interagere med fibrinogen. Denne Aβ-fibrinogen interaktion gør fibrin blodprop strukturelt unormal og modstandsdygtige over for fibrinolyse. Aβ-induceret abnormiteter i fibrin koagulation kan også bidrage til cerebrovaskulær aspekter af annonce patologi såsom microinfarcts, inflammation samt cerebral amyloid angiopathie (CAA). På grund af neurovaskulære underskud potentielt kritiske rolle i annonce patologi, har udvikle forbindelser, som kan hæmme eller mindske Aβ-fibrinogen interaktion lovende terapeutisk værdi. In vitro metoder ved hvilke fibrin koageldannelse kan nemt og systematisk vurderes er potentielt nyttige værktøjer til at udvikle terapeutiske forbindelser. Præsenteres her er en optimeret protokol for in vitro- generation af fibrin blodprop, samt analyse af effekten af Aβ og Aβ-fibrinogen interaktion hæmmere. Blodprop turbiditet assay er hurtige, meget reproducerbare og kan bruges til at teste flere betingelser samtidig, giver mulighed for screening af stort antal Aβ-fibrinogen hæmmere. Hit forbindelser fra denne screening kan yderligere evalueret for deres evne til at rette op på Aβ-inducerede strukturelle abnormiteter af fibrin blodprop arkitektur ved hjælp af SEM. Effektiviteten af disse optimerede protokoller er demonstreret her ved hjælp af TDI-2760, en nyligt identificerede Aβ-fibrinogen interaktion hæmmer.

In vitro- koagulation (turbiditet) assay kløver enzymet thrombin fibrinogen, resulterer i dannelsen af fibrin netværk24. Denne fibrin koageldannelse forårsager spredning af lyset passerer gennem den løsning, som resulterer i øget turbiditet (figur 1), plateauing inden udgangen af perioden læsning (figur 2, grøn). Når fibrinogen var inkuberes med Aβ42, turbiditet af løsningen faldet med k...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of ÃŽÂ²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analyse af β-Amyloid-induceret afvigelser Fibrin blodprop strukturen af spektroskopi og Scanning elektronmikroskopi

Præsenteres her er to metoder, der kan bruges individuelt eller i kombination til at analysere effekten af beta-amyloid på fibrin blodprop struktur. Inkluderet er en protokol for at skabe en in vitro- fibrin blodprop, efterfulgt af blodprop Turbiditet og scanning Elektron Mikroskopi metoder.

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Den største fordel ved denne plade-baserede turbiditet assay er, at det er hurtig og giver mulighed for flere amyloid-beta fibrinogen interaktion hæmmere, der skal screenes på én gang uden sofistikeret opsætning eller krav. Hovedet forbindelser, der er i fibrin turbiditet assay kan yderligere evalueres for deres evne til at genoprette A-beta-induceret strukturel abnormitet i fibrin blodpropper analyseret ved scanning elektronmikroskopi. Visuel demonstration af tilberedning af blodprop til scanning af elektronmikroskopianalyse er afgørende, da eventuelle variationer i præparatet kan bidrage til variationer i forsøgsresultaterne.Fokus for denne demonstration her er på A-beta fibrinogen interaktioner. Denne protokol kan let ændres for at analysere andre interaktioner med andre proteiner og forbindelser med fibrinproppen. Begynd med at tilsætte 1,5 mikromolar frisklavet fibrinogen i 200 mikroliter af blodprop buffer til hver A-beta negativ 42 indeholdende og kontrol brønde og inkubere pladen på en roterende platform ved stuetemperatur.Efter 30 minutter samtidig tilføje 30 mikroliter af frisklavet trombin opløsning direkte ind i midten af fibrinogen-holdige godt at indlede blodprop dannelse og straks læse absorbans af in vitro blodpropper ved 350 nanometer, gentage målingen hver 30 til 60 sekunder i løbet af 10 minutter. For at vurdere effekten af A-beta fibrinogen interaktion hæmmere på fibrin blodprop struktur, første brug antævring til at placere rene, 12 millimeter siliconized glas cirkel dække glider til individuelle brønde af en 12 brønd plade og tilsæt 80 mikroliter fibrinogen på hvert dæksel slip, forsigtigt sprede opløsningen, så de er jævnt fordelt. Tilsæt 20 mikroliter trombinopløsning til hver brønd for at starte dannelse af blodpropper.Pladen dækkes i en 30 til 60 minutters inkubation ved stuetemperatur, og hver blodprop nedsænkes forsigtigt i to milliliter iskold natriumkakodylatbuffer i to minutter, dækket ved stuetemperatur to gange ved hjælp af en en milliliterpipette for omhyggeligt at fjerne bufferen efter hver vask. Efter den sidste vask kontrolleres status for blodproppens dannelse på dækslet, og blodpropperne fastgøres i to til tre milliliter iskold 2% glutaraldehyd på is i 30 minutter. Ved slutningen af inkubationen fjernes glutaraldehyd forsigtigt fra hver brønd og blodpropperne vaskes med frisk natriumkaakodylatbuffer som påvist på is.At fugte de faste blodpropper i en sorteret serie på fem minutter iskold ethanol vasker på is uden helt at fjerne ethanol mellem vaskerne for at holde blodpropper beskyttet mod lufteksponering. Under den sidste 100% ethanolvask overføres dækslet til en prøveholder med kritisk punkttørrer, hvor der anbringes mindst én skive mellem hver dækslet, og holderen anbringes i et kritisk punkttørrerkammer fyldt med ethanol. Efter en 30 minutters tørringscyklus skal du bruge carbontape til at montere dækslet på individuelle scanningselektromikroskopiståser og overføre prøverne til sputter belægningskammeret i en vakuumsputtercoater.Derefter sputter pels mindre end 20 nanometer af guld palladium eller andre ledende materialer på prøverne i 25 sekunder ved fire angstroms per sekund og billede prøverne på en scanning elektron mikroskop udstyret med en type to sekundære elektroner detektor på fire kilovolts. Fibrin blodprop dannelse forårsager spredning af lyset passerer gennem opløsningen, hvilket resulterer i en øget turbiditet, at plateauer i slutningen af læsning periode. Når fibrinogen inkuberes i nærvær af A-beta 42, falder opløsningens turbiditet, mens kurven når en maksimal højde på ca. halvdelen af fibrinogen alene.Ved tilstedeværelse af en A-beta 42 interaktionsblokker er effekten af beta-amyloid ameliorated og turbiditeten er højere end med A-beta alene. Effekten af blokkeren vises ikke på grund af baggrundsturbiditet, da forbindelsen ikke ændrer fibrinproppens turbiditet, når A-beta er fraværende. Endvidere, blodprop dannelse i nærvær af GPRP, et peptid kendt for at forstyrre fibrin polymerisering, viser en signifikant reduceret turbiditet i forhold til fibrin blodprop dannelse i mangel af inhibitor.Fibrinogen genereret i nærvær af trombin og calciumchlorid danner kun en fibrin mesh med aflange og interkalerede tråde af fibrin samt større bundter. Når A-beta er til stede, fibrin tråde blev tyndere med flere klæbrige klumper i aggregater, hvilket indikerer A-beta induceret strukturelle abnormiteter. I overensstemmelse med resultaterne af turbiditetsanalysen genopretter blodpropdannelsen ved tilstedeværelse af en A-beta fibrinogeninteraktionsblokker delvist strukturen af fibrinproppen fra A-beta-inducerede ændringer, da der observeres færre klumper ved denne behandling.De clot turbiditet assay og scanning elektron mikroskop analyse protokoller er blevet optimeret til evaluering af flere A-beta fibrinogen interaktion hæmmere på en hurtig og reproducerbar måde. Og snart data vil give værdifulde oplysninger om fibrin blodprop dannelse, der kan anvendes til yderligere undersøgelser både in vitro og in vivo.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Metode til at visualisere og analysere membran interagerende proteiner af Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

High-resolution single particle analyse fra elektronkryo-mikroskopi billeder ved hjælp af SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Semi-automatiske Biopanning af bakteriel Display biblioteker for peptid affinitet reagens opdagelse og analyse af resulterende isolater

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems

Variationer på Negative pletten Elektron Mikroskopi metoder: værktøjer til håndtering af udfordrende systemer

Negative stain electron microscopy (EM) allows relatively simple and quick observation of macromolecules and macromolecular complexes through the use of ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

Analysere dynamisk proteinkomplekser samles på og frigivet fra Biolayer interferometri Biosensor ved hjælp af massespektrometri og elektronmikroskopi

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Mitokondrier og Endoplasmic reticulum Imaging af Korrelativ lys og volumen elektronmikroskopi

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Tværgående 2000 af ældre ris(Oryza sativa L.) Kerner til scanning elektronmikroskopi imaging ved hjælp af pipette tips som immobilisering Support

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Enkeltcelleanalyse af transskriptionsaktive alleler efter enkeltmolekyle FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Enkelt partikel kryo-elektronmikroskopi: Fra prøve til struktur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Micropatterning Transmission ElektronMikroskopiGitre til direkte cellepositionering i hele celle kryo-elektrontomografi arbejdsprocesser

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...