Name: analysis of &#946;-amyloid-induced abnormalities on fibrin clot structure by spectroscopy and scanning electron microscopy
Uploaded: 2018-11-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of ÃŽÂ²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Auteurs bedanken Masanori Kawasaki, Kazuyoshi Aso en Michael Foley van Tri-institutionele Therapeutics Discovery Instituut (TDI), New York voor de synthese van Aβ-fibrinogeen interactie remmers en hun waardevolle suggesties. Auteurs dank ook de leden van de lab Strickland voor nuttige discussie. Dit werk werd gesteund door de NIH grant NS104386, de ziekte van Alzheimer Drug Discovery Foundation en Robertson therapeutische Ontwikkelingsfonds voor H.A., NIH verlenen NS50537, de Tri-institutionele Therapeutics Discovery Institute, Alzheimer Drug Discovery Foundation, Rudin Family Foundation, en John A. Herrmann voor SS

1. bereiding van Aβ42 en fibrinogeen p.a.
<ol><li>Bereiden monomere Aβ42 van gelyofiliseerd poeder<ol>
<li>Warme Aβ42 poeder op kamertemperatuur en spin down bij 1.500 x g gedurende 30 s.</li>
		<li>Voeg 100 µL van ijskoude hexafluoroisopropanol (HFIP) per 0,5 mg Aβ42 poeder en incubeer gedurende 30 min op ijs. Let op: Wees voorzichtig bij het verwerken van HFIP en alle stappen in een chemische kap.</li>
		<li>Bereiden 20 µL aliquots en laat die de films lucht droog in een chemische kap voor 2-3 h. Films kan w...

<ol>
	<li>Selkoe, D. J., Schenk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease:+molecular+understanding+predicts+amyloid-based+therapeutics.">Alzheimer's disease: molecular understanding predicts amyloid-based therapeutics.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 43, 545-584 (2003).</li><li>Kurz, A., Perneczky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+clearance+as+a+treatment+target+against+Alzheimer's+disease.">Amyloid clearance as a treatment target against Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 24, 61-73 (2011).</li><li>Benilova, I., Karran, E., De Strooper, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+toxic+Abeta+oligomer+and+Alzheimer's+disease:+an+emperor+in+need+of+clothes.">The toxic Abeta oligomer and Alzheimer's disease: an emperor in need of clothes.</a> Nature Neuroscience. 15 (3), 349-357 (2012).</li><li>Karran, E., Hardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critique+of+the+drug+discovery+and+phase+3+clinical+programs+targeting+the+amyloid+hypothesis+for+Alzheimer+disease.">A critique of the drug discovery and phase 3 clinical programs targeting the amyloid hypothesis for Alzheimer disease.</a> Annals of Neurology. 76 (2), 185-205 (2014).</li><li>Yoshikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+cerebral+blood+flow+in+Alzheimer+disease+and+vascular+dementia.">Heterogeneity of cerebral blood flow in Alzheimer disease and vascular dementia.</a> AJNR, American Journal of Neuroradiology. 24 (7), 1341-1347 (2003).</li><li>Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+will+out:+vascular+contributions+to+Alzheimer's+disease.">Blood will out: vascular contributions to Alzheimer's disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (2), 556-563 (2018).</li><li>Ahn, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease+peptide+beta-amyloid+interacts+with+fibrinogen+and+induces+its+oligomerization.">Alzheimer's disease peptide beta-amyloid interacts with fibrinogen and induces its oligomerization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21812-21817 (2010).</li><li>Zamolodchikov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+structural+analysis+of+the+interaction+between+beta-amyloid+and+fibrinogen.">Biochemical and structural analysis of the interaction between beta-amyloid and fibrinogen.</a> Blood. 128 (8), 1144-1151 (2016).</li><li>Cortes-Canteli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrinogen+and+beta-amyloid+association+alters+thrombosis+and+fibrinolysis:+a+possible+contributing+factor+to+Alzheimer's+disease.">Fibrinogen and beta-amyloid association alters thrombosis and fibrinolysis: a possible contributing factor to Alzheimer's disease.</a> Neuron. 66 (5), 695-709 (2010).</li><li>Cortes-Canteli, M., Mattei, L., Richards, A. T., Norris, E. H., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+deposited+in+the+Alzheimer's+disease+brain+promotes+neuronal+degeneration.">Fibrin deposited in the Alzheimer's disease brain promotes neuronal degeneration.</a> Neurobiology of Aging. 36 (2), 608-617 (2015).</li><li>Liao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+characterization+of+postmortem+amyloid+plaques+isolated+by+laser+capture+microdissection.">Proteomic characterization of postmortem amyloid plaques isolated by laser capture microdissection.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 37061-37068 (2004).</li><li>Zamolodchikov, D., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abeta+delays+fibrin+clot+lysis+by+altering+fibrin+structure+and+attenuating+plasminogen+binding+to+fibrin.">Abeta delays fibrin clot lysis by altering fibrin structure and attenuating plasminogen binding to fibrin.</a> Blood. 119 (14), 3342-3351 (2012).</li><li>Ahn, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Abeta-fibrinogen+interaction+inhibitor+rescues+altered+thrombosis+and+cognitive+decline+in+Alzheimer's+disease+mice.">A novel Abeta-fibrinogen interaction inhibitor rescues altered thrombosis and cognitive decline in Alzheimer's disease mice.</a> The Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1049-1062 (2014).</li><li>Singh, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminopyrimidine+Class+Aggregation+Inhibitor+Effectively+Blocks+Abeta-Fibrinogen+Interaction+and+Abeta-Induced+Contact+System+Activation.">Aminopyrimidine Class Aggregation Inhibitor Effectively Blocks Abeta-Fibrinogen Interaction and Abeta-Induced Contact System Activation.</a> Biochemistry. 57 (8), 1399-1409 (2018).</li><li>Pretorius, E., Mbotwe, S., Bester, J., Robinson, C. J., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+induction+of+anomalous+and+amyloidogenic+blood+clotting+by+molecular+amplification+of+highly+substoichiometric+levels+of+bacterial+lipopolysaccharide.">Acute induction of anomalous and amyloidogenic blood clotting by molecular amplification of highly substoichiometric levels of bacterial lipopolysaccharide.</a> Journal of the Royal Society Interface. 13 (122), (2016).</li><li>Veklich, Y., Francis, C. W., White, J., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+studies+of+fibrinolysis+by+electron+microscopy.">Structural studies of fibrinolysis by electron microscopy.</a> Blood. 92 (12), 4721-4729 (1998).</li><li>Weisel, J. W., Nagaswami, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+modeling+of+fibrin+polymerization+kinetics+correlated+with+electron+microscope+and+turbidity+observations:+clot+structure+and+assembly+are+kinetically+controlled.">Computer modeling of fibrin polymerization kinetics correlated with electron microscope and turbidity observations: clot structure and assembly are kinetically controlled.</a> Biophysical Journal. 63 (1), 111-128 (1992).</li><li>Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+clots+are+equilibrium+polymers+that+can+be+remodeled+without+proteolytic+digestion.">Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion.</a> Scientific Reports. 2, 879 (2012).</li><li>Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+amyloid+beta-peptide+(Abeta)+aggregation+using+the+Congo+red-Abeta+(CR-abeta)+spectrophotometric+assay.">Quantifying amyloid beta-peptide (Abeta) aggregation using the Congo red-Abeta (CR-abeta) spectrophotometric assay.</a> Analytical Biochemistry. 266 (1), 66-76 (1999).</li><li>Zhao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+amyloid+formation+by+turbidity+assay-seeing+through+the+cloud.">Measurement of amyloid formation by turbidity assay-seeing through the cloud.</a> Biophysical Reviews. 8 (4), 445-471 (2016).</li><li>Bester, J., Soma, P., Kell, D. B., Pretorius, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+and+ultrastructural+characteristics+of+whole+blood+and+plasma+in+Alzheimer-type+dementia,+and+the+possible+role+of+bacterial+lipopolysaccharides+(LPS).">Viscoelastic and ultrastructural characteristics of whole blood and plasma in Alzheimer-type dementia, and the possible role of bacterial lipopolysaccharides (LPS).</a> Oncotarget. 6 (34), 35284-35303 (2015).</li><li>Pretorius, E., Page, M. J., Mbotwe, S., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-binding+protein+(LBP)+can+reverse+the+amyloid+state+of+fibrin+seen+or+induced+in+Parkinson's+disease.">Lipopolysaccharide-binding protein (LBP) can reverse the amyloid state of fibrin seen or induced in Parkinson's disease.</a> PLoS One. 13 (3), e0192121 (2018).</li><li>Kell, D. B., Pretorius, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+behaving+badly.+Substoichiometric+molecular+control+and+amplification+of+the+initiation+and+nature+of+amyloid+fibril+formation:+lessons+from+and+for+blood+clotting.">Proteins behaving badly. Substoichiometric molecular control and amplification of the initiation and nature of amyloid fibril formation: lessons from and for blood clotting.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 123, 16-41 (2017).</li><li>Wolberg, A. S., Campbell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombin+generation,+fibrin+clot+formation+and+hemostasis.">Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis.</a> Transfusion and Apheresis Science. 38 (1), 15-23 (2008).</li><li>Soon, A. S., Lee, C. S., Barker, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+fibrin+matrix+properties+via+knob:hole+affinity+interactions+using+peptide-PEG+conjugates.">Modulation of fibrin matrix properties via knob:hole affinity interactions using peptide-PEG conjugates.</a> Biomaterials. 32 (19), 4406-4414 (2011).</li></ol>

De hier beschreven methoden bieden een reproduceerbaar en snelle methode voor de beoordeling van fibrine clot vorming in vitro. Bovendien, de eenvoud van het systeem vergemakkelijkt de interpretatie van hoe Aβ invloed op de vorming van fibrine clot en structuur relatief rechttoe-rechtaan. In dit lab vorige publicatie, werd aangetoond dat deze tests kunnen worden gebruikt voor het testen van verbindingen voor hun vermogen om te remmen de Aβ-fibrinogeen interactie13,<sup class=...

De ziekte van Alzheimer (AD), een neurodegeneratieve ziekte leidt tot cognitieve achteruitgang bij oudere patienten, voornamelijk voortkomt uit abnormale amyloid-bèta (Aβ) expressie, aggregatie en verminderde klaring resulterend in neurotoxiciteit1, 2. ondanks de goed gekarakteriseerd associatie tussen Aβ aggregaten en AD3, zijn de precieze mechanismen die ten grondslag liggen aan de pathologie ziekte niet goed begrepen4. Een groeiende hoeveelheid bewijs suggereert dat neurovasculaire tekorten een rol bij de progressie en de ernst van AD5 spelen, zoals Aβ rechtstreeks met de componenten van de bloedsomloop6 communiceert. Aβ heeft een hoge-affiniteit interactie met fibrinogeen7,8, die ook Aβ deposito's in zowel AD patiënten en muis modellen9,10,11 lokaliseert. Bovendien is de interactie Aβ-fibrinogeen induceert abnormale fibrine-clot formatie en structuur, evenals de weerstand tegen Fibrinolyse9,12. Een van de therapeutische mogelijkheden bij de behandeling van AD, is het verlichten van bloedsomloop tekorten door remming van de interactie tussen Aβ en fibrinogeen13,14. Wij, geïdentificeerd daarom diverse kleine verbindingen remming van de Aβ-fibrinogeen interactie met behulp van hoge-doorvoer screening en medicinale chemie benaderingen13,14. Om te testen van de werkzaamheid van Aβ-fibrinogeen interactie remmers, geoptimaliseerd we twee methoden voor de analyse van in vitro fibrine clot vorming: stollen troebelheid assay en scanning elektronen microscopie (SEM),14.
Clot troebelheid assay is een rechttoe-rechtaan en snelle methode voor de controle van fibrine clot vorming met behulp van UV-zichtbaar spectroscopie. Als de fibrine clot formulieren, licht is steeds meer verspreid en de troebelheid van de oplossing verhoogt. Omgekeerd, wanneer Aβ aanwezig is, de structuur van het fibrine clot wordt gewijzigd, en de troebelheid van het mengsel wordt verminderd (Figuur 1). Het effect van remmende stoffen kan worden beoordeeld voor de mogelijkheden waaruit u wilt terugzetten clot troebelheid Aβ-geïnduceerde afwijkingen. Terwijl de troebelheid assay voor snelle analyse van meerdere voorwaarden zorgt, biedt het beperkte informatie over de klonter vorm en structuur. SEM, waarin de topografie voor massieve voorwerpen is geopenbaard door elektron sonde, zorgt voor de analyse van de 3D-architectuur van de klonter15,16,17,18 en de beoordeling van hoe de aanwezigheid van Aβ en / of inhiberende verbindingen verandert die structuur9,14. Beide spectrometrie en SEM zijn klassieke laboratoriumtechnieken die zijn gebruikt voor verschillende doeleinden, bijvoorbeeld spectrofotometrie wordt gebruikt voor de controle van amyloïde aggregatie19,20. Evenzo, SEM wordt ook gebruikt voor het analyseren van fibrine clot gevormd uit het plasma van de ziekte van Alzheimer, Parkinson en trombo-embolische beroerte patiënten21,22,23. De protocollen die hier gepresenteerd worden geoptimaliseerd voor de beoordeling van de vorming van fibrine-clot reproduceerbaar en snelle wijze.
Het volgende protocol bevat de instructies voor de voorbereiding van een in vitro fibrine-clot zowel met als zonder Aβ. Het ook een overzicht van de methoden voor het analyseren van het effect van Aβ op fibrine clot formatie en structuur. De effectiviteit van deze twee methoden voor het meten van de remming van de Aβ-fibrinogeen interactie is aangetoond door middel van TDI-2760, een kleine remmende samengestelde14. Deze methoden, toestaan zowel individueel als samen voor snelle en eenvoudige analyse van in vitro fibrine clot vorming.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fibriogen, Plasminogen-Depleted, Plasma</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>341578</td>
			<td>keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-Amyloid (1-42), Human</td>
			<td>Anaspec</td>
			<td>AS-20276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from human plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>105228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTERED</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>C70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Syringe, 0.2&#181;M, 25mm</td>
			<td>Pall</td>
			<td>4612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia.</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLVV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat Bottom</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>21377203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectramax Plus384</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>89212-396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, 5417R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 200 Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>15-337-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Rotator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>2314-1CEQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spare washers for cover slip holder</td>
			<td>Tousimis</td>
			<td>8766-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow Stem Pipets - Sedi-Pet</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>70967-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample holder for CPD (Cover slip holder)</td>
			<td>Tousimis</td>
			<td>8766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mount Holder Box, Pin Type</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>76610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round glass cover slides (12 mm)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>16120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Cacodylate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM Stubs, Tapered end pin.</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>75192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm OD</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16084-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosamdri-815 Critical Point Dryer with Gold/Palladium target</td>
			<td>Tousimis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denton Desk IV Coater</td>
			<td>Denton Vacuum</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leo 1550 FE-SEM</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smart SEM Software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of &#946;-amyloid-induced abnormalities on fibrin clot structure by spectroscopy and scanning electron microscopy

Dit artikel bevat methoden voor het genereren van in vitro fibrine stolsels en het analyseren van het effect van bèta-amyloid (Aβ) eiwit op clot formatie en structuur door spectrometrie en scanning elektronen microscopie (SEM). Aβ, dat vormt neurotoxische amyloïde aggregaten in de ziekte van Alzheimer (AD), heeft aangetoond dat interactie met fibrinogeen. Deze interactie Aβ-fibrinogeen maakt het fibrine clot structureel abnormale en resistent zijn tegen Fibrinolyse. Aβ-geïnduceerde afwijkingen in fibrine stolling kunnen ook bijdragen aan cerebrovasculaire aspecten van de AD-pathologie zoals microinfarcts, ontsteking, evenals, Cerebrale amyloïde angiopathie (CAA). Gezien de potentieel kritische rol van neurovasculaire tekorten in AD pathologie, heeft ontwikkeling van verbindingen die kunnen remmen of verminderen van de Aβ-fibrinogeen interactie veelbelovende therapeutische waarde. In vitro methoden door welke fibrine clot vorming kan worden gemakkelijk en systematisch geëvalueerd zijn potentieel nuttige hulpmiddelen voor het ontwikkelen van therapeutische stoffen. Hier gepresenteerd is een geoptimaliseerde protocol voor in vitro generatie van het fibrine clot, alsmede een analyse van het effect van Aβ en Aβ-fibrinogeen interactie-remmers. De bepaling van de troebelheid clot is snelle, zeer reproduceerbaar en kan worden gebruikt om meerdere proefomstandigheden tegelijk, waardoor voor het screenen van grote aantallen Aβ-fibrinogeen remmers. Hit verbindingen uit deze screening kunnen verder worden geëvalueerd voor hun vermogen om te verzachten Aβ-geïnduceerde structurele afwijkingen van de fibrine clot architectuur met behulp van SEM. De effectiviteit van deze geoptimaliseerde protocollen is hier aangetoond door middel van TDI-2760, een onlangs geïdentificeerde Aβ-fibrinogeen interactie inhibitor.

In de in vitro assay (troebelheid) bloedstolling, cleaves de enzym trombine fibrinogeen, wat resulteert in de vorming van fibrine netwerk24. Deze fibrine clot formatie veroorzaakt verstrooiing van het licht door de oplossing, wat resulteert in verhoogde troebelheid (Figuur 1), plateauing voor het einde van de lezing periode (Figuur 2, groen). Wanneer de fibrinogeen was geïncubeerd in aanwezigheid...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of ÃŽÂ²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analyse van β-Amyloid-geïnduceerde afwijkingen op fibrine Clot structuur door spectroscopie en Scanning elektronen microscopie

Hier zijn twee methoden die afzonderlijk of in combinatie kunnen worden gebruikt voor het analyseren van het effect van bèta-amyloid op fibrine clot structuur. Inbegrepen is een protocol voor het maken van een in vitro fibrine clot, gevolgd door clot turbiditeit en scanning elektronen microscopie methodes.

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Het belangrijkste voordeel van deze op plaat gebaseerde troebelheidstest is dat het snel is en het mogelijk maakt om verschillende amyloïde-bètafibrinogen-interactieremmers in één keer te screenen zonder geavanceerde setup of vereisten. De hoofdverbindingen die zich in de fibrin troebelheidstest bevinden, kunnen verder worden geëvalueerd op hun vermogen om a-bèta-geïnduceerde structurele afwijking in de fibrinstols te herstellen die worden geanalyseerd door elektronenmicroscopie te scannen. Visuele demonstratie van stolselvoorbereiding voor het scannen van elektronenmicroscopie analyse is van cruciaal belang als eventuele variaties in de voorbereiding kan bijdragen aan variaties binnen de experimentele resultaten.De focus van deze demonstratie ligt hier op A-beta fibrinogen interacties. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast om andere interacties met andere eiwitten en de verbindingen met het fibrinstolsel te analyseren. Begin met het toevoegen van 1,5 micromolar vers bereide fibrinogen in 200 microliter stolselvormingsbuffer aan elke A-bèta-negatieve 42 die putten bevat en controleert en de plaat op een roterend platform bij kamertemperatuur uitbroedt.Voeg na 30 minuten tegelijkertijd 30 microliters vers bereide trombineoplossing direct toe in het midden van fibrinogen-bevattende put om stolselvorming te starten en lees onmiddellijk de absorptie van de in vitro stolsels op 350 nanometer, waarbij de meting elke 30 tot 60 seconden in de loop van 10 minuten wordt herhaald. Om het effect van A-beta fibrinogen interactieremmers op fibrin stolsel structuur te evalueren, eerst gebruik tangen schoon te plaatsen, 12 millimeter siliconen glazen cirkel deksel slips aan individuele putten van een 12 put plaat en voeg 80 microliter fibrinogen op elke cover slip, voorzichtig verspreiden van de oplossing, zodat ze gelijkmatig worden verdeeld. Voeg 20 microliter tromber van trombine oplossing aan elke put om stolsel vorming te starten.Bedek de plaat voor een incubatie van 30 tot 60 minuten bij kamertemperatuur en dompel elk stolsel voorzichtig onder in twee milliliter ijskoude natriumcaanolaatbuffer gedurende twee minuten, bedekt, bij kamertemperatuur twee keer, met behulp van een pijpzak van één milliliter om de buffer na elke wasbeurt zorgvuldig te verwijderen. Controleer na de laatste wasbeurt de status van de stolselvorming op de afdekslip en bevestig de stolsels in twee tot drie milliliter ijskoude 2%glutaraldehyde op ijs gedurende 30 minuten. Verwijder aan het einde van de incubatie voorzichtig de glutaraldehyde uit elke put en was de stolsels met een verse natriumcaanoodylaatbuffer zoals aangetoond op ijs.Om de vaste stolsels te hydrateren in een gesorteerde serie van vijf minuten ijskoude ethanol wast op ijs zonder volledig verwijderen van de ethanol tussen de wasbeurten om de stolsels beschermd tegen blootstelling aan de lucht te houden. Breng tijdens de laatste 100% ethanolwas de afdekkingslip in een monsterhouder van een kritieke puntdroger, waarbij ten minste 1 wasmachine tussen elke afdeksel wordt gedrogeerd en plaats de houder in een met ethanol gevulde kritische puntdrogerkamer. Gebruik na een droogcyclus van 30 minuten koolstoftape om de afdekkingslips op individuele scanning elektronenmicroscopie stubs te monteren en breng de monsters over naar de sputtercoatingkamer van een vacuümsputtercoater.Dan sputter laag minder dan 20 nanometer van goud palladium of andere geleidende materialen op de monsters voor 25 seconden op vier angstroms per seconde en beeld de monsters op een scanning elektronenmicroscoop uitgerust met een type twee secundaire elektronen detector op vier kilovolts. Fibrin stolsel vorming veroorzaakt verstrooiing van het licht dat door de oplossing, wat resulteert in een verhoogde troebelheid die plateaus aan het einde van de leesperiode. Wanneer fibrinogen in aanwezigheid van A-bèta 42 wordt geïncubeerd neemt de troebelheid van de oplossing met de kromme af die een maximumhoogte van ruwweg de helft bereikt die van fibrinogen alleen.In aanwezigheid van een A-beta 42 interactieblokker wordt het effect van bèta-amyloïde verbeterd en is de troebelheid hoger dan die met A-beta alleen. Het effect van de blokker verschijnt niet als gevolg van achtergrondturbisiteit als de verbinding verandert niet de fibrin stolsel troebelheid wanneer A-beta afwezig is. Verder, stolselvorming in aanwezigheid van GPRP, een peptide waarvan bekend is dat interfereert met fibrin polymerisatie, toont een aanzienlijk verminderde troebelheid in vergelijking met de fibrin stolsel vorming in de afwezigheid van de remmer.Fibrinogen gegenereerd in aanwezigheid van trombine en calciumchloride vormen slechts een fibrine gaas met langwerpige en intercalated draden van fibrin evenals grotere bundels. Wanneer A-beta aanwezig is, werden de fibrin draden dunner met verschillende kleverige klonters in aggregaten, wat duidt op A-beta geïnduceerde structurele afwijkingen. In overeenstemming met de resultaten van de troebelheidstest herstelt stolselvorming in aanwezigheid van een A-bèta fibrinogen interactieblokker gedeeltelijk de structuur van het fibrinstolsel van de A-bèta-geïnduceerde veranderingen als er minder klontjes worden waargenomen met deze behandeling.De stollingstest en scanning elektronenmicroscoopanalyseprotocollen zijn geoptimaliseerd voor het snel en reproduceerbaar evalueren van verschillende A-bèta fibrinogen interactieremmers. En binnenkort gegevens zullen waardevolle informatie over fibrin stolsel vorming die kunnen worden toegepast op verdere studies zowel in vitro en in vivo.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Methode om te visualiseren en te analyseren Membrane interagerende eiwitten door Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Hoge resolutie single particle analyse van elektroncryo-microscopie beelden met behulp van SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Semi-automatische Biopanning van bacteriële Display bibliotheken voor Peptide affiniteit reagens detectie en analyse van de resulterende isolaten

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems

Variaties op negatieve vlek elektronenmicroscopie methoden: Tools voor de aanpak van de uitdagende systemen

Negative stain electron microscopy (EM) allows relatively simple and quick observation of macromolecules and macromolecular complexes through the use of ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

Analyseren van de dynamische eiwitcomplexen op gemonteerd en vrijgelaten uit Biolayer interferometrie Biosensor met behulp van spectrometrie van de massa en elektronenmicroscopie

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Mitochondriën en Endoplasmisch reticulum beeldvorming door Correlatief licht en volume elektronenmicroscopie

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Dwarsdoorsnede van rijpe rijst(Oryza sativa L.) Kernels voor scanning elektronenmicroscopie beeldvorming met behulp van pipet tips als immobilisatie ondersteuning

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Single cell analyse van transcriptioneel actieve allelen door single molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Cryo-elektronenmicroscopie met enkele deeltjes: van monster tot structuur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Micropatterning Transmissie ElektronenMicroscopie Grids naar Direct Cell Positioning binnen Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...