Name: analysis of &#946;-amyloid-induced abnormalities on fibrin clot structure by spectroscopy and scanning electron microscopy
Uploaded: 2018-11-30T14:30:00
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Auteurs remercient Masanori Kawasaki, Kazuyoshi Aso et Michael Foley de Tri-institutionnels Therapeutics Discovery Institute (TDI), New York pour la synthèse d’inhibiteurs d’interaction Aβ-fibrinogène et leurs précieuses suggestions. Auteurs remercient également les membres du laboratoire Strickland de discussion utile. Ce travail a été soutenu par les NIH grant NS104386, Alzheimer Drug Discovery Foundation et fonds de développement thérapeutique Robertson pour H.A., NIH grant NS50537, la Tri-institutionnels Therapeutics Discovery Institute, Alzheimer Drug Discovery Foundation, Rudin Family Foundation et John A. Herrmann pour la S.S.

1. préparation du fibrinogène et Aβ42 pour l’analyse
<ol><li>Préparer Aβ42 monomère de poudre lyophilisée<ol>
<li>Réchauffer Aβ42 poudre à température ambiante et de la rotation vers le bas à 1 500 g pendant 30 s.</li>
		<li>Ajouter 100 µL de hexafluoroisopropanol glacee (HFIP) par 0,5 mg de poudre de Aβ42 et incuber pendant 30 minutes sur la glace. ATTENTION : Soyez prudent lorsque vous manipulez HFIP et effectuez toutes les opérations sous une hotte chimique.</li>
		<li>Préparer 20 µL d’extra...

<ol>
	<li>Selkoe, D. J., Schenk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease:+molecular+understanding+predicts+amyloid-based+therapeutics.">Alzheimer's disease: molecular understanding predicts amyloid-based therapeutics.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 43, 545-584 (2003).</li><li>Kurz, A., Perneczky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+clearance+as+a+treatment+target+against+Alzheimer's+disease.">Amyloid clearance as a treatment target against Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 24, 61-73 (2011).</li><li>Benilova, I., Karran, E., De Strooper, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+toxic+Abeta+oligomer+and+Alzheimer's+disease:+an+emperor+in+need+of+clothes.">The toxic Abeta oligomer and Alzheimer's disease: an emperor in need of clothes.</a> Nature Neuroscience. 15 (3), 349-357 (2012).</li><li>Karran, E., Hardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critique+of+the+drug+discovery+and+phase+3+clinical+programs+targeting+the+amyloid+hypothesis+for+Alzheimer+disease.">A critique of the drug discovery and phase 3 clinical programs targeting the amyloid hypothesis for Alzheimer disease.</a> Annals of Neurology. 76 (2), 185-205 (2014).</li><li>Yoshikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+cerebral+blood+flow+in+Alzheimer+disease+and+vascular+dementia.">Heterogeneity of cerebral blood flow in Alzheimer disease and vascular dementia.</a> AJNR, American Journal of Neuroradiology. 24 (7), 1341-1347 (2003).</li><li>Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+will+out:+vascular+contributions+to+Alzheimer's+disease.">Blood will out: vascular contributions to Alzheimer's disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (2), 556-563 (2018).</li><li>Ahn, H. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Abeta-fibrinogen+interaction+inhibitor+rescues+altered+thrombosis+and+cognitive+decline+in+Alzheimer's+disease+mice.">A novel Abeta-fibrinogen interaction inhibitor rescues altered thrombosis and cognitive decline in Alzheimer's disease mice.</a> The Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1049-1062 (2014).</li><li>Singh, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminopyrimidine+Class+Aggregation+Inhibitor+Effectively+Blocks+Abeta-Fibrinogen+Interaction+and+Abeta-Induced+Contact+System+Activation.">Aminopyrimidine Class Aggregation Inhibitor Effectively Blocks Abeta-Fibrinogen Interaction and Abeta-Induced Contact System Activation.</a> Biochemistry. 57 (8), 1399-1409 (2018).</li><li>Pretorius, E., Mbotwe, S., Bester, J., Robinson, C. J., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+induction+of+anomalous+and+amyloidogenic+blood+clotting+by+molecular+amplification+of+highly+substoichiometric+levels+of+bacterial+lipopolysaccharide.">Acute induction of anomalous and amyloidogenic blood clotting by molecular amplification of highly substoichiometric levels of bacterial lipopolysaccharide.</a> Journal of the Royal Society Interface. 13 (122), (2016).</li><li>Veklich, Y., Francis, C. W., White, J., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+studies+of+fibrinolysis+by+electron+microscopy.">Structural studies of fibrinolysis by electron microscopy.</a> Blood. 92 (12), 4721-4729 (1998).</li><li>Weisel, J. W., Nagaswami, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+modeling+of+fibrin+polymerization+kinetics+correlated+with+electron+microscope+and+turbidity+observations:+clot+structure+and+assembly+are+kinetically+controlled.">Computer modeling of fibrin polymerization kinetics correlated with electron microscope and turbidity observations: clot structure and assembly are kinetically controlled.</a> Biophysical Journal. 63 (1), 111-128 (1992).</li><li>Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+clots+are+equilibrium+polymers+that+can+be+remodeled+without+proteolytic+digestion.">Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion.</a> Scientific Reports. 2, 879 (2012).</li><li>Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+amyloid+beta-peptide+(Abeta)+aggregation+using+the+Congo+red-Abeta+(CR-abeta)+spectrophotometric+assay.">Quantifying amyloid beta-peptide (Abeta) aggregation using the Congo red-Abeta (CR-abeta) spectrophotometric assay.</a> Analytical Biochemistry. 266 (1), 66-76 (1999).</li><li>Zhao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+amyloid+formation+by+turbidity+assay-seeing+through+the+cloud.">Measurement of amyloid formation by turbidity assay-seeing through the cloud.</a> Biophysical Reviews. 8 (4), 445-471 (2016).</li><li>Bester, J., Soma, P., Kell, D. B., Pretorius, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+and+ultrastructural+characteristics+of+whole+blood+and+plasma+in+Alzheimer-type+dementia,+and+the+possible+role+of+bacterial+lipopolysaccharides+(LPS).">Viscoelastic and ultrastructural characteristics of whole blood and plasma in Alzheimer-type dementia, and the possible role of bacterial lipopolysaccharides (LPS).</a> Oncotarget. 6 (34), 35284-35303 (2015).</li><li>Pretorius, E., Page, M. J., Mbotwe, S., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-binding+protein+(LBP)+can+reverse+the+amyloid+state+of+fibrin+seen+or+induced+in+Parkinson's+disease.">Lipopolysaccharide-binding protein (LBP) can reverse the amyloid state of fibrin seen or induced in Parkinson's disease.</a> PLoS One. 13 (3), e0192121 (2018).</li><li>Kell, D. B., Pretorius, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+behaving+badly.+Substoichiometric+molecular+control+and+amplification+of+the+initiation+and+nature+of+amyloid+fibril+formation:+lessons+from+and+for+blood+clotting.">Proteins behaving badly. Substoichiometric molecular control and amplification of the initiation and nature of amyloid fibril formation: lessons from and for blood clotting.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 123, 16-41 (2017).</li><li>Wolberg, A. S., Campbell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombin+generation,+fibrin+clot+formation+and+hemostasis.">Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis.</a> Transfusion and Apheresis Science. 38 (1), 15-23 (2008).</li><li>Soon, A. S., Lee, C. S., Barker, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+fibrin+matrix+properties+via+knob:hole+affinity+interactions+using+peptide-PEG+conjugates.">Modulation of fibrin matrix properties via knob:hole affinity interactions using peptide-PEG conjugates.</a> Biomaterials. 32 (19), 4406-4414 (2011).</li></ol>

Les méthodes décrites ici constituent un moyen reproductible et rapid d’évaluation de fibrine caillot formation in vitro. En outre, la simplicité du système rend l’interprétation de la façon dont Aβ affecte la formation de caillots de fibrine et la structure relativement simple. La dernière publication de ce laboratoire, il a été démontré que ces tests peuvent servir à tester les composés pour leur capacité à inhiber l’Aβ-fibrinogène interaction13,<sup ...

Maladie d’Alzheimer (ma), une maladie neurodégénérative conduisant à un déclin cognitif chez les personnes âgées, majoritairement découle anormale bêta-amyloïde (Aß) expression, d’agrégation et dégagement ayant une déficience entraînant neurotoxicité1, 2. Malgré l’association bien caractérisée entre les agrégats de bêta-amyloïdes et AD3, les mécanismes précis qui sous-tendent la pathologie de la maladie ne sont pas bien compris4. Plus en plus évident suggère que les déficits neurovasculaires jouent un rôle dans la progression et la sévérité des AD5, comme Aβ interagit directement avec les composants de l' appareil circulatoire6. Bêta-amyloïdes a une interaction de forte affinité avec le fibrinogène7,8, qui localise également aux dépôts de bêta-amyloïdes dans les patients de l’AD et les souris modèles9,10,11. Par ailleurs, l’interaction Aβ-fibrinogène induit la formation de caillot de fibrine anormale et structure, ainsi que la résistance à la fibrinolyse9,12. Une des possibilités thérapeutiques dans le traitement de la ma est atténuer les déficits circulatoires en inhibant l’interaction entre Aβ et fibrinogène13,14. Nous avons, par conséquent, identifié plusieurs petits composés inhibant l’interaction Aβ-fibrinogène à l’aide de criblage à haut débit et la chimie médicinale approches13,14. Pour tester l’efficacité des inhibiteurs de l’interaction Aβ-fibrinogène, nous avons optimisé les deux méthodes d’analyse de in vitro formation de caillots de fibrine : coagulation test de turbidité et scanning electron microscopy (SEM)14.
Test de turbidité de caillot est une méthode simple et rapide pour le suivi de formation de caillots de fibrine en utilisant la spectroscopie UV-visible. Tant que le caillot de fibrine, formes, lumière est plus en plus dispersés et la turbidité de la solution augmente. À l’inverse, lorsque Aβ est présent, la structure du caillot de fibrine est altérée et la turbidité du mélange est réduite (Figure 1). L’effet des composés inhibiteurs peut être évaluée pour le potentiel de restaurer caillot turbidité d’anomalies induite par l’Aß. Alors que le test de turbidité permet pour l’analyse rapide des conditions multiples, il fournit des informations limitées sur le caillot forme et la structure. SEM, dans lequel la topographie des objets solides est révélée par la sonde électronique, permettant l’analyse de l’architecture 3D du caillot15,16,17,18 et l’évaluation de la façon dont la présence de bêta-amyloïdes et composés inhibiteurs et/ou modifie cette structure9,14. Les deux spectrométrie et SEM sont des techniques de laboratoire classiques qui ont été utilisés à diverses fins, par exemple, spectrophotométrie est utilisée pour surveiller l’agrégation amyloïde19,20. De même, SEM est également utilisé pour analyser le caillot de fibrine formé à partir du plasma de l’Alzheimer, Parkinson et maladies thrombo-emboliques patients21,22,23. Les protocoles présentés ici sont optimisés pour l’évaluation de la formation de caillot de fibrine de façon reproductible et rapide.
Le protocole suivant fournit les instructions pour la préparation d’un in vitro -caillot de fibrine avec et sans Aβ. Il détaille également les méthodes pour analyser l’effet des bêta-amyloïdes sur la formation de caillots de fibrine et de la structure. L’efficacité de ces deux méthodes pour mesurer l’inhibition de l’interaction d’Aβ-fibrinogène est démontrée à l’aide de TDI-2760, un petit composé inhibiteur14. Ces méthodes, individuellement et ensemble, permettent une analyse rapide et simple de in vitro formation de caillots de fibrine.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fibriogen, Plasminogen-Depleted, Plasma</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>341578</td>
			<td>keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-Amyloid (1-42), Human</td>
			<td>Anaspec</td>
			<td>AS-20276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from human plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>105228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTERED</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>C70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Syringe, 0.2&#181;M, 25mm</td>
			<td>Pall</td>
			<td>4612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia.</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLVV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat Bottom</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>21377203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectramax Plus384</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>89212-396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, 5417R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 200 Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>15-337-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Rotator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>2314-1CEQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spare washers for cover slip holder</td>
			<td>Tousimis</td>
			<td>8766-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow Stem Pipets - Sedi-Pet</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>70967-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample holder for CPD (Cover slip holder)</td>
			<td>Tousimis</td>
			<td>8766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mount Holder Box, Pin Type</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>76610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round glass cover slides (12 mm)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>16120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Cacodylate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM Stubs, Tapered end pin.</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>75192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm OD</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16084-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosamdri-815 Critical Point Dryer with Gold/Palladium target</td>
			<td>Tousimis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denton Desk IV Coater</td>
			<td>Denton Vacuum</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leo 1550 FE-SEM</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smart SEM Software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of &#946;-amyloid-induced abnormalities on fibrin clot structure by spectroscopy and scanning electron microscopy

Cet article présente des méthodes pour générer des caillots de fibrine in vitro et analyser l’effet de la protéine de bêta-amyloïde (Aß) sur la formation de caillots et de la structure par spectrométrie et microscopie électronique (MEB). Bêta-amyloïdes, qui forme des agrégats amyloïdes neurotoxiques dans la maladie d’Alzheimer (ma), s’est avéré d’interagir avec le fibrinogène. Cette interaction Aβ-fibrinogène rend le caillot de fibrine structurellement anormale et résistant à la fibrinolyse. Induite par l’Aß anomalies de coagulation de la fibrine peuvent aussi contribuer aux aspects cérébro-vasculaires de la pathologie AD tels que microinfarcts, l’inflammation, ainsi que, angiopathie amyloïde (CAA). Étant donné le rôle potentiellement critique des déficits neurovasculaire dans la pathologie de la ma, développement de composés qui peuvent inhiber ou réduire l’interaction Aβ-fibrinogène a une valeur thérapeutique prometteuse. Méthodes in vitro par lequel fibrine la formation de caillots peut être facilement et systématiquement évaluée sont des outils potentiellement utiles pour développer des composés thérapeutiques. Présenté ici est un protocole optimisé pour in vitro génération du caillot de fibrine, ainsi que l’analyse de l’effet des inhibiteurs d’interaction Aβ et Aβ-fibrinogène. Le test de turbidité de caillot est rapide, hautement reproductible et peut être utilisé pour tester plusieurs conditions en même temps, ce qui permet la projection d’un grand nombre d’inhibiteurs d’Aβ-fibrinogène. Succès composés de ce dépistage peuvent être évaluées davantage pour leur capacité à améliorer Aβ-induit des anomalies structurelles de l’architecture de caillot de fibrine à l’aide de SEM L’efficacité de ces protocoles optimisés est démontrée ici en utilisant TDI-2760, un inhibiteur d’interaction Aβ-fibrinogène identifié récemment.

Dans in vitro test (turbidité) de la coagulation, la thrombine enzyme clive fibrinogène, entraînant la formation de la fibrine réseau24. Cette formation de caillot de fibrine entraîne la diffusion de la lumière passant à travers la solution, ce qui entraîne une augmentation de la turbidité (Figure 1), plafonnement avant la fin de la période de lecture (Figure 2, vert). Lorsque le fibrino...

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Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analyse des anomalies induite par la β-amyloïde sur Structure de caillot de fibrine par spectroscopie et microscopie électronique à balayage

Présentées ici sont deux méthodes qui peuvent être utilisés individuellement ou en combinaison pour analyser l’effet de la protéine bêta-amyloïde sur structure de caillot de fibrine. Inclus est un protocole créant un caillot de fibrine in vitro , suivie de turbidité de caillot et la microscopie électronique à balayage méthodes.

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Le principal avantage de cet essai de turbidité à base de plaques est qu’il est rapide et permet à plusieurs inhibiteurs d’interaction amyloïde-bêta fibrinogen d’être examinés à la fois sans configuration sophistiquée ou des exigences. Les composés de tête qui sont dans l’essai de turbidité de fibrine peuvent être davantage évalués pour leur capacité à reconstituer l’anomalie structurale A-bêta-induite dans les caillots de fibrine analysés par microscopie électronique de balayage. La démonstration visuelle de la préparation de caillot pour l’analyse électronique de microscopie de balayage est critique car toutes les variations dans la préparation peuvent contribuer aux variations dans les résultats expérimentaux.Cette démonstration met l’accent sur les interactions A-beta fibrinogen. Ce protocole peut être facilement modifié pour analyser d’autres interactions avec d’autres protéines et les composés avec le caillot de fibrine. Commencez par ajouter 1,5 micromolaire de fibrinogen fraîchement préparé dans 200 microlitres de tampon de formation de caillots à chaque A-bêta négatif 42 contenant et contrôlant des puits et incubez la plaque sur une plate-forme rotative à température ambiante.Après 30 minutes simultanément ajouter 30 microlitres de solution thrombine fraîchement préparé directement dans le centre du puits contenant du fibrinogen pour initier la formation de caillots et lire immédiatement l’absorption des caillots in vitro à 350 nanomètres, répétant la mesure toutes les 30 à 60 secondes au cours de 10 minutes. Pour évaluer l’effet des inhibiteurs d’interaction de fibrinogen d’A-bêta sur la structure de caillot de fibrine, utilisez d’abord des forceps pour placer le couvercle propre et siliconized de cercle en verre de 12 millimètres glisse aux puits individuels d’une plaque de puits de 12 et ajoutez 80 microlitres de fibrinogène sur chaque glissement de couverture, répandant doucement la solution de sorte qu’ils soient uniformément distribués. Ajouter 20 microlitres de solution thrombine à chaque puits pour initier la formation de caillots.Couvrir la plaque pendant une incubation de 30 à 60 minutes à température ambiante, puis submerger doucement chaque caillot en deux millilitres de tampon cacodylate de sodium glacé pendant deux minutes, couvert, à température ambiante deux fois, à l’aide d’une pipette d’un millilitre pour enlever soigneusement le tampon après chaque lavage. Après le dernier lavage, vérifiez l’état de la formation du caillot sur la feuille de couverture et fixez les caillots en deux à trois millilitres de glutaraldehyde glacé de 2 % sur la glace pendant 30 minutes. À la fin de l’incubation, retirer délicatement le glutaraldehyde de chaque puits et laver les caillots avec un tampon cacodylate de sodium frais comme le démontre la glace.Pour hydrater les caillots fixes dans une série classée de cinq minutes, l’éthanol glacé se lave sur la glace sans enlever complètement l’éthanol entre les lavages pour protéger les caillots contre l’exposition à l’air. Au cours du dernier lavage à 100 % éthanol, transférer le couvercle dans un porte-échantillon de sécheuse à point critique, en plaçant au moins 1 rondelle entre chaque feuillet de couvercle et en plaçant le support dans une chambre sèche-point critique remplie d’éthanol. Après un cycle de séchage de 30 minutes, utilisez du ruban carbone pour monter les feuillets de couverture sur les talons de microscopie électronique à balayage individuel et transférez les échantillons dans la chambre de revêtement de pulvérisateur d’un revêtement de pulvérisateur sous vide.Puis pulvériser manteau moins de 20 nanomètres de palladium d’or ou d’autres matériaux conducteurs sur les échantillons pendant 25 secondes à quatre angstroms par seconde et l’image des échantillons sur un microscope électronique à balayage équipé d’un détecteur d’électrons secondaires de type deux à quatre kilovolts. La formation de caillots fibrins provoque la diffusion de la lumière passant à travers la solution, ce qui entraîne une turbidité accrue qui plafonne à la fin de la période de lecture. Lorsque le fibrinogen est incubé en présence d’A-beta 42, la turbidité de la solution diminue avec la courbe atteignant une hauteur maximale d’environ la moitié de celle du fibrinogène seul.En présence d’un bloqueur d’interaction A-beta 42, l’effet de la bêta-amyloïde est amélioré et la turbidité est plus élevée que celle de la bêta-A seule. L’effet du bloqueur n’apparaît pas en raison de la turbidité de fond car le composé ne change pas la turbidité fibrine de caillot quand A-bêta est absent. En outre, la formation de caillots en présence de GPRP, un peptide connu pour interférer avec la polymérisation fibrine, démontre une turbidité significativement réduite par rapport à la formation de caillots fibrine en l’absence de l’inhibiteur.Le fibrinogène produit en présence de thrombine et de chlorure de calcium ne forme qu’un maillage fibrine avec des fils allongés et intercalés de fibrine ainsi que de plus gros faisceaux. Quand A-bêta est présent, les fils de fibrine sont devenus plus minces avec plusieurs touffes collantes dans les agrégats, indiquant des anomalies structurales induites par A-bêta. Conformément aux résultats de l’analyse de turbidité, la formation de caillots en présence d’un bloqueur d’interaction a-bêta fibrinogen restaure partiellement la structure du caillot de fibrine des changements induits par la bêta-A à mesure que moins de touffes sont observées avec ce traitement.L’analyse de turbidité des caillots et les protocoles d’analyse du microscope électronique à balayage ont été optimisés pour évaluer plusieurs inhibiteurs de l’interaction a-bêta fibrinogen d’une manière rapide et reproductible. Et bientôt les données fourniront des informations précieuses sur la formation de caillots fibrins qui peuvent être appliquées à d’autres études à la fois in vitro et in vivo.

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