Name: analysis of &#946;-amyloid-induced abnormalities on fibrin clot structure by spectroscopy and scanning electron microscopy
Uploaded: 2018-11-30T14:30:00
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Autoren danken Masanori Kawasaki, Kazuyoshi Aso und Michael Foley von Tri-Institutionelle Therapeutics Discovery Institute (TDI), New York für die Synthese von Aβ-Fibrinogen-Interaktion-Inhibitoren und ihre wertvollen Anregungen. Autoren auch danken Mitgliedern des Strickland Labor für hilfreiche Diskussion. Diese Arbeit wurde von NIH Grant NS104386, der Alzheimers Drug Discovery Foundation und Robertson therapeutische Entwicklungsfonds für H.A., unterstützt NIH grant NS50537, Tri-Institutionelle Therapeutics Discovery Institute, Alzheimer Drug Discovery Foundation, Rudin Family Foundation und John A. Herrmann für S.S.

1. Vorbereitung des Aβ42 und Fibrinogen zur Analyse
<ol><li>Bereiten Sie Monomere Aβ42 aus gefriergetrockneten Pulver<ol>
<li>Warm Aβ42 Pulver auf Raumtemperatur und Spin down bei 1.500 x g für 30 s.</li>
		<li>Fügen Sie 100 µL der eiskalte Hexafluoroisopropanol (HFIP hinzu) pro 0,5 mg Aβ42 Pulver und inkubieren Sie für 30 min auf Eis. Achtung: Vorsicht beim Umgang mit HFIP und führen Sie alle Schritte in einer chemischen Kapuze.</li>
		<li>Bereiten Sie 20 µL Aliquots und lassen Sie die Filme Luft trocken ...

<ol>
	<li>Selkoe, D. J., Schenk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease:+molecular+understanding+predicts+amyloid-based+therapeutics.">Alzheimer's disease: molecular understanding predicts amyloid-based therapeutics.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 43, 545-584 (2003).</li><li>Kurz, A., Perneczky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+clearance+as+a+treatment+target+against+Alzheimer's+disease.">Amyloid clearance as a treatment target against Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 24, 61-73 (2011).</li><li>Benilova, I., Karran, E., De Strooper, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+toxic+Abeta+oligomer+and+Alzheimer's+disease:+an+emperor+in+need+of+clothes.">The toxic Abeta oligomer and Alzheimer's disease: an emperor in need of clothes.</a> Nature Neuroscience. 15 (3), 349-357 (2012).</li><li>Karran, E., Hardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critique+of+the+drug+discovery+and+phase+3+clinical+programs+targeting+the+amyloid+hypothesis+for+Alzheimer+disease.">A critique of the drug discovery and phase 3 clinical programs targeting the amyloid hypothesis for Alzheimer disease.</a> Annals of Neurology. 76 (2), 185-205 (2014).</li><li>Yoshikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+cerebral+blood+flow+in+Alzheimer+disease+and+vascular+dementia.">Heterogeneity of cerebral blood flow in Alzheimer disease and vascular dementia.</a> AJNR, American Journal of Neuroradiology. 24 (7), 1341-1347 (2003).</li><li>Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+will+out:+vascular+contributions+to+Alzheimer's+disease.">Blood will out: vascular contributions to Alzheimer's disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (2), 556-563 (2018).</li><li>Ahn, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease+peptide+beta-amyloid+interacts+with+fibrinogen+and+induces+its+oligomerization.">Alzheimer's disease peptide beta-amyloid interacts with fibrinogen and induces its oligomerization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21812-21817 (2010).</li><li>Zamolodchikov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+structural+analysis+of+the+interaction+between+beta-amyloid+and+fibrinogen.">Biochemical and structural analysis of the interaction between beta-amyloid and fibrinogen.</a> Blood. 128 (8), 1144-1151 (2016).</li><li>Cortes-Canteli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrinogen+and+beta-amyloid+association+alters+thrombosis+and+fibrinolysis:+a+possible+contributing+factor+to+Alzheimer's+disease.">Fibrinogen and beta-amyloid association alters thrombosis and fibrinolysis: a possible contributing factor to Alzheimer's disease.</a> Neuron. 66 (5), 695-709 (2010).</li><li>Cortes-Canteli, M., Mattei, L., Richards, A. T., Norris, E. H., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+deposited+in+the+Alzheimer's+disease+brain+promotes+neuronal+degeneration.">Fibrin deposited in the Alzheimer's disease brain promotes neuronal degeneration.</a> Neurobiology of Aging. 36 (2), 608-617 (2015).</li><li>Liao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+characterization+of+postmortem+amyloid+plaques+isolated+by+laser+capture+microdissection.">Proteomic characterization of postmortem amyloid plaques isolated by laser capture microdissection.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 37061-37068 (2004).</li><li>Zamolodchikov, D., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abeta+delays+fibrin+clot+lysis+by+altering+fibrin+structure+and+attenuating+plasminogen+binding+to+fibrin.">Abeta delays fibrin clot lysis by altering fibrin structure and attenuating plasminogen binding to fibrin.</a> Blood. 119 (14), 3342-3351 (2012).</li><li>Ahn, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Abeta-fibrinogen+interaction+inhibitor+rescues+altered+thrombosis+and+cognitive+decline+in+Alzheimer's+disease+mice.">A novel Abeta-fibrinogen interaction inhibitor rescues altered thrombosis and cognitive decline in Alzheimer's disease mice.</a> The Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1049-1062 (2014).</li><li>Singh, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminopyrimidine+Class+Aggregation+Inhibitor+Effectively+Blocks+Abeta-Fibrinogen+Interaction+and+Abeta-Induced+Contact+System+Activation.">Aminopyrimidine Class Aggregation Inhibitor Effectively Blocks Abeta-Fibrinogen Interaction and Abeta-Induced Contact System Activation.</a> Biochemistry. 57 (8), 1399-1409 (2018).</li><li>Pretorius, E., Mbotwe, S., Bester, J., Robinson, C. J., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+induction+of+anomalous+and+amyloidogenic+blood+clotting+by+molecular+amplification+of+highly+substoichiometric+levels+of+bacterial+lipopolysaccharide.">Acute induction of anomalous and amyloidogenic blood clotting by molecular amplification of highly substoichiometric levels of bacterial lipopolysaccharide.</a> Journal of the Royal Society Interface. 13 (122), (2016).</li><li>Veklich, Y., Francis, C. W., White, J., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+studies+of+fibrinolysis+by+electron+microscopy.">Structural studies of fibrinolysis by electron microscopy.</a> Blood. 92 (12), 4721-4729 (1998).</li><li>Weisel, J. W., Nagaswami, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+modeling+of+fibrin+polymerization+kinetics+correlated+with+electron+microscope+and+turbidity+observations:+clot+structure+and+assembly+are+kinetically+controlled.">Computer modeling of fibrin polymerization kinetics correlated with electron microscope and turbidity observations: clot structure and assembly are kinetically controlled.</a> Biophysical Journal. 63 (1), 111-128 (1992).</li><li>Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+clots+are+equilibrium+polymers+that+can+be+remodeled+without+proteolytic+digestion.">Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion.</a> Scientific Reports. 2, 879 (2012).</li><li>Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+amyloid+beta-peptide+(Abeta)+aggregation+using+the+Congo+red-Abeta+(CR-abeta)+spectrophotometric+assay.">Quantifying amyloid beta-peptide (Abeta) aggregation using the Congo red-Abeta (CR-abeta) spectrophotometric assay.</a> Analytical Biochemistry. 266 (1), 66-76 (1999).</li><li>Zhao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+amyloid+formation+by+turbidity+assay-seeing+through+the+cloud.">Measurement of amyloid formation by turbidity assay-seeing through the cloud.</a> Biophysical Reviews. 8 (4), 445-471 (2016).</li><li>Bester, J., Soma, P., Kell, D. B., Pretorius, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+and+ultrastructural+characteristics+of+whole+blood+and+plasma+in+Alzheimer-type+dementia,+and+the+possible+role+of+bacterial+lipopolysaccharides+(LPS).">Viscoelastic and ultrastructural characteristics of whole blood and plasma in Alzheimer-type dementia, and the possible role of bacterial lipopolysaccharides (LPS).</a> Oncotarget. 6 (34), 35284-35303 (2015).</li><li>Pretorius, E., Page, M. J., Mbotwe, S., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-binding+protein+(LBP)+can+reverse+the+amyloid+state+of+fibrin+seen+or+induced+in+Parkinson's+disease.">Lipopolysaccharide-binding protein (LBP) can reverse the amyloid state of fibrin seen or induced in Parkinson's disease.</a> PLoS One. 13 (3), e0192121 (2018).</li><li>Kell, D. B., Pretorius, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+behaving+badly.+Substoichiometric+molecular+control+and+amplification+of+the+initiation+and+nature+of+amyloid+fibril+formation:+lessons+from+and+for+blood+clotting.">Proteins behaving badly. Substoichiometric molecular control and amplification of the initiation and nature of amyloid fibril formation: lessons from and for blood clotting.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 123, 16-41 (2017).</li><li>Wolberg, A. S., Campbell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombin+generation,+fibrin+clot+formation+and+hemostasis.">Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis.</a> Transfusion and Apheresis Science. 38 (1), 15-23 (2008).</li><li>Soon, A. S., Lee, C. S., Barker, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+fibrin+matrix+properties+via+knob:hole+affinity+interactions+using+peptide-PEG+conjugates.">Modulation of fibrin matrix properties via knob:hole affinity interactions using peptide-PEG conjugates.</a> Biomaterials. 32 (19), 4406-4414 (2011).</li></ol>

Die hier beschriebenen Methoden bieten eine reproduzierbare und schnelles Mittel zur Bewertung der Fibrin Gerinnsel Bildung in Vitro. Darüber hinaus macht die Einfachheit des Systems die Interpretation der Auswirkungen Aβ die Bildung von Blutgerinnseln Fibrin und Struktur relativ geradlinig. In dieser Übungseinheit früheren Publikation zeigte sich, dass diese Tests verwendet werden, können um Verbindungen für ihre Fähigkeit, hemmen die Aβ-Fibrinogen Interaktion13,<sup c...

Alzheimer-Krankheit (AD), ergibt sich eine Neurodegenerative Erkrankung führt zu kognitiven Verfall bei älteren Patienten, überwiegend aus abnorme Beta-Amyloid (Aβ) Ausdruck, Aggregation und eingeschränkter Freiraum was zu Neurotoxizität1, 2. trotz der gut-gekennzeichneten Assoziation zwischen Aβ-Aggregate und AD3, sind die genauen Mechanismen der Krankheit-Pathologie nicht gut verstanden4. Erhöhung der Beweis schlägt vor, dass neurovaskuläre Defizite bei der Progression und Schweregrad der AD5, eine Rolle spielen wie Aβ direkt mit den Komponenten des Herz-Kreislauf-System6 interagiert. Aβ hat eine hohe Affinität Interaktion mit Fibrinogen7,8, die auch zu Aβ Ablagerungen bei Alzheimer-Patienten und Maus Modelle9,10,11lokalisiert. Darüber hinaus induziert die Aβ-Fibrinogen-Interaktion abnorme Fibrin-Klumpenbildung sowie Struktur und Widerstand gegen die Fibrinolyse9,12. Eine therapeutische Möglichkeit bei der Behandlung von AD, ist Kreislauf Defizite durch die Hemmung der Interaktion zwischen Aβ und Fibrinogen13,14Linderung. Wir, identifiziert daher mehrere kleine Verbindungen hemmen die Aβ-Fibrinogen-Interaktion mit Hochdurchsatz-Screening und medizinische Chemie Ansätze13,14. Um die Wirksamkeit von Aβ-Fibrinogen-Interaktion-Inhibitoren zu testen, haben wir zwei Methoden für die Analyse von in-vitro- Bildung von Blutgerinnseln Fibrin optimiert: Blutgerinnung Trübung Assay und Scannen Rasterelektronenmikroskopie (SEM)14.
Gerinnsel Trübung-Assay ist eine unkomplizierte und schnelle Methode zur Überwachung der Bildung von Blutgerinnseln Fibrin mit UV-VIS Spektroskopie. Als das Fibrin-Gerinnsel wird zunehmend Formen, Licht gestreut und die Trübung der Lösung erhöht. Umgekehrt, wenn Aβ vorhanden ist, die Struktur der das Fibrin-Gerinnsel wird geändert, und die Trübung des Gemisches wird reduziert (Abbildung 1). Die Wirkung von hemmenden Verbindungen kann das Potenzial Gerinnsel Trübung von Aβ-induzierte Anomalien wiederherstellen beurteilt werden. Während die Trübung Assay für die schnelle Analyse von mehreren Bedingungen ermöglicht, informiert es begrenzt auf die Gerinnsel Form und Struktur. SEM, in dem die Topographie von festen Körpern von Elektron Sonde offenbart, ermöglicht die Analyse der 3D-Architektur der Gerinnsel15,16,17,18 und die Bewertung wie das Vorhandensein von Aβ und und/oder hemmende Verbindungen verändert die Struktur9,14. Beide Spektrometrie und SEM sind klassische Labor-Techniken, die für verschiedene Zwecke verwendet wurden, z. B. Spektralphotometrie dient zur Überwachung von Amyloid Aggregation19,20. Ebenso dient SEM auch Fibrin Gerinnsel gebildet aus dem Plasma von Alzheimer, Parkinson und thromboembolische Schlaganfall Patienten21,22,23zu analysieren. Die hier vorgestellten Protokolle sind für die Beurteilung der Fibrin-Gerinnselbildung in einer reproduzierbaren und schnelle Art und Weise optimiert.
Das folgende Protokoll enthält die Anweisungen für die Zubereitung von einer in-Vitro Fibrin-Gerinnsel sowohl mit als auch ohne Aβ. Es beschreibt auch die Methoden, um die Wirkung von Aβ auf Bildung von Blutgerinnseln Fibrin und Struktur zu analysieren. Die Wirksamkeit dieser beiden Methoden für die Messung der Hemmung der Aβ-Fibrinogen Interaktion wird demonstriert mit TDI-2760, eine kleine hemmende Verbindung14. Diese Methoden können sowohl einzeln als auch gemeinsam, für schnelle und einfache Analyse von in-vitro- Bildung von Blutgerinnseln Fibrin.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fibriogen, Plasminogen-Depleted, Plasma</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>341578</td>
			<td>keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-Amyloid (1-42), Human</td>
			<td>Anaspec</td>
			<td>AS-20276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from human plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>105228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTERED</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>C70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Syringe, 0.2&#181;M, 25mm</td>
			<td>Pall</td>
			<td>4612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia.</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLVV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat Bottom</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>21377203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectramax Plus384</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>89212-396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, 5417R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 200 Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>15-337-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Rotator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>2314-1CEQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spare washers for cover slip holder</td>
			<td>Tousimis</td>
			<td>8766-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow Stem Pipets - Sedi-Pet</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>70967-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample holder for CPD (Cover slip holder)</td>
			<td>Tousimis</td>
			<td>8766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mount Holder Box, Pin Type</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>76610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round glass cover slides (12 mm)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>16120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Cacodylate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM Stubs, Tapered end pin.</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>75192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm OD</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16084-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosamdri-815 Critical Point Dryer with Gold/Palladium target</td>
			<td>Tousimis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denton Desk IV Coater</td>
			<td>Denton Vacuum</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leo 1550 FE-SEM</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smart SEM Software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of &#946;-amyloid-induced abnormalities on fibrin clot structure by spectroscopy and scanning electron microscopy

Dieser Artikel stellt Methoden zur Erzeugung von in Vitro Fibrin Gerinnsel und Analyse der Wirkung von Beta-Amyloid (Aβ)-Protein auf Bildung von Blutgerinnseln und Struktur durch Spektrometrie und Rasterelektronenmikroskopie (SEM). Aβ, die neurotoxischen Amyloid Aggregate bei der Alzheimer-Krankheit (AD) bildet, hat sich gezeigt, zur Interaktion mit Fibrinogen. Dieses Zusammenspiel von Aβ-Fibrinogen macht das Fibrin-Gerinnsel strukturell abnorme und Fibrinolyse. Aβ-induzierte Anomalien in Fibrin Blutgerinnung können auch dazu beitragen, zerebrovaskuläre Aspekte der AD Pathologie wie Microinfarcts, Entzündungen sowie zerebralen Amyloid-Angiopathie (CAA). Angesichts der potenziell kritische Rolle der neurovaskulären Defizite in der AD-Pathologie, hat Verbindungen hemmen oder vermindern die Aβ-Fibrinogen-Interaktion zu entwickeln vielversprechenden therapeutischen Wert. In-vitro- Methoden nach dem Fibrin Gerinnselbildung leicht und systematisch beurteilt werden kann sind potenziell nützliche Werkzeuge für die Entwicklung von therapeutischen Substanzen. Hier vorgestellten ist ein optimierte Protokoll für in-vitro- Erzeugung von Fibrin-Gerinnsel sowie Analyse der Wirkung von Aβ und Aβ-Fibrinogen-Interaktion-Inhibitoren. Die Gerinnsel Trübung Assay ist schnelle und hoch reproduzierbare und kann verwendet werden, um mehrere Bedingungen gleichzeitig testen, zulassend die Vorführung einer großen Zahl von Aβ-Fibrinogen-Inhibitoren. Hit-Verbindungen aus diesem Screening können weiter für ihre Fähigkeit, Aβ-induzierte strukturelle Anomalien der Fibrin-Gerinnsel-Architektur mit SEM verbessern ausgewertet werden Die Wirksamkeit dieser optimierte Protokolle ist hier demonstriert mit TDI-2760, eine neu identifizierte Aβ-Fibrinogen-Interaktion-Inhibitor.

In der in-vitro- Gerinnung (Trübung) Assay spaltet das Enzym Thrombin Fibrinogen, was zur Bildung von Fibrin Netzwerk24. Diese Bildung von Blutgerinnseln Fibrin verursacht Streuung des Lichtes durch die Lösung, was zu erhöhten Trübung (Abbildung 1), plateauing vor dem Ende der Lesung Periode (Abbildung 2, grün). Wenn die Fibrinogen in Anwesenheit von Aβ42 inkubiert wurde, die Trübung der L?...

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Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analyse der β-Amyloid-induzierte Anomalien auf Fibrin Gerinnsel Struktur von Spektroskopie und Rasterelektronenmikroskopie

Hier sind zwei Methoden, die einzeln oder in Kombination verwendet werden können, um die Wirkung von Beta-Amyloid auf Fibrin Gerinnsel Struktur zu analysieren. Enthalten ist ein Protokoll für die Schaffung einer in Vitro Fibrin Gerinnsel, gefolgt von Gerinnsel Trübung und Rasterelektronenmikroskopie Methoden.

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Der Hauptvorteil dieses plattenbasierten Trübungstests ist, dass er schnell ist und es ermöglicht, mehrere Amyloid-Beta-Fibrinogen-Wechselwirkungshemmer sofort ohne ausgeklügeltes Setup oder Anforderungen zu überprüfen. Die Kopfverbindungen, die sich im Fibrin-Trübungstest befinden, können weiter auf ihre Fähigkeit untersucht werden, A-Beta-induzierte strukturelle Anomalien in den fibrin-Gerinnseln wiederherzustellen, die durch Rasterelektronenmikroskopie analysiert werden. Die visuelle Demonstration der Gerinnselvorbereitung für die Rasterelektronenmikroskopie-Analyse ist von entscheidender Bedeutung, da Abweichungen in der Präparation zu Variationen innerhalb der experimentellen Ergebnisse beitragen können.Der Schwerpunkt dieser Demonstration liegt hier auf A-Beta-Fibrinogen-Wechselwirkungen. Dieses Protokoll kann leicht modifiziert werden, um andere Wechselwirkungen mit anderen Proteinen und den Verbindungen mit dem Fibringer zu analysieren. Beginnen Sie mit 1,5 Mikromolaren frisch zubereitetem Fibrinogen in 200 Mikroliter gerinnungsbildendem Puffer zu jedem A-beta-Negativ 42, das Brunnen enthält und kontrolliert, und brütedien Sie die Platte auf einer rotierenden Plattform bei Raumtemperatur.Nach 30 Minuten gleichzeitig 30 Mikroliter frisch zubereitete Thrombinlösung direkt in das Zentrum des fibrinogenhaltigen Brunnens geben, um die Gerinnselbildung zu initiieren und sofort die Absorption der In-vitro-Gerinnsel bei 350 Nanometern zu lesen, wobei die Messung im Laufe von 10 Minuten alle 30 bis 60 Sekunden wiederholt wird. Um die Wirkung von A-Beta-Fibrinogen-Wechselwirkungshemmern auf die Fibrin-Gerinnselstruktur zu bewerten, verwenden Sie zunächst Zangen, um saubere, 12 Millimeter silikonisierte Glaskreisabdeckung zu einzelnen Bohrungen einer 12-Well-Platte zu platzieren und 80 Mikroliter Fibrinogen auf jeden Deckelschlupf zu legen, wobei die Lösung sanft verteilt wird, so dass sie gleichmäßig verteilt werden. Fügen Sie 20 Mikroliter Thrombin-Lösung zu jedem Brunnen hinzufügen, um die Gerinnselbildung zu initiieren.Bedecken Sie die Platte für eine 30 bis 60 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur, dann tauchen Sie jedes Gerinnsel vorsichtig in zwei Milliliter eiskalten NatriumkokodilatPuffer für zwei Minuten, bedeckt, bei Raumtemperatur zwei Mal, mit einer Ein-Milliliter-Pipette, um vorsichtig den Puffer nach jeder Wäsche zu entfernen. Nach der letzten Wäsche den Status der Gerinnselbildung auf dem Decksschlupf überprüfen und die Gerinnsel 30 Minuten lang in zwei bis drei Milliliter eiskaltem 2%glutaraldehyd auf Eis fixieren. Am Ende der Inkubation das Glutaraldehyd aus jedem Brunnen vorsichtig entfernen und die Gerinnsel mit frischem Natriumkakodilatatpuffer waschen, wie auf Eis gezeigt.Hydratisieren der festen Gerinnsel in einer abgestuften Serie von fünfminütigen eiskalten Ethanol-Wassaufenthalten auf Eis, ohne das Ethanol zwischen den Wärteilen vollständig zu entfernen, um die Gerinnsel vor Luftexposition zu schützen. Während der letzten 100%Ethanol-Wäsche die Deckelschlupfin in einen kritischen Punkttrockner-Probenhalter übertragen, mindestens 1 Scheibe zwischen jedem Abdeckungsschlupf platzieren und den Halter in eine mit Ethanol gefüllte kritische Punkttrocknerkammer legen. Verwenden Sie nach einem 30-minütigen Trocknungszyklus Mit Kohleband die Deckelschlupfe an einzelnen Rasterelektronenmikroskopie-Stubs und übertragen Sie die Proben in die Sputter-Beschichtungskammer eines Vakuum-Sputterlackierers.Dann spritzen Sie weniger als 20 Nanometer Goldpalladium oder andere leitfähige Materialien für 25 Sekunden bei vier Angstroms pro Sekunde auf die Proben und stellen die Proben auf einem Rasterelektronenmikroskop ab, das mit einem Sekundärelektronendetektor Typ 2 bei vier Kilovolt ausgestattet ist. Die Fibrin-Gerinnselbildung bewirkt eine Streuung des Lichts, das durch die Lösung geht, was zu einer erhöhten Trübung führt, die am Ende der Leseperiode hochist. Wenn das Fibrinogen in Gegenwart von A-beta 42 inkubiert wird, nimmt die Trübung der Lösung ab, wobei die Kurve eine maximale Höhe von etwa der Hälfte der von Fibrinogen allein erreicht.In Gegenwart eines A-beta 42-Interaktionsblockers wird die Wirkung von Beta-Amyloid gemildert und die Trübung ist höher als bei A-beta allein. Die Wirkung des Blockers erscheint nicht aufgrund der Hintergrundtrübung, da die Verbindung die Trübung des Fibringerflecks nicht verändert, wenn A-beta fehlt. Darüber hinaus zeigt die Gerinnselbildung in Gegenwart von GPRP, einem Peptid, das bekanntermaßen die Fibrinpolymerisation stört, eine signifikant reduzierte Trübung im Vergleich zur Fibringerengerbildung in Abwesenheit des Inhibitors.Fibrinogen, das in Gegenwart von Thrombin und Calciumchlorid erzeugt wird, bildet nur ein Fibringewebe mit längenden und interkalierten Fibrinfäden sowie größeren Bündeln. Wenn A-beta vorhanden ist, wurden die Fibrinfäden dünner mit mehreren klebrigen Klumpen in Aggregaten, was auf A-Beta-induzierte strukturelle Anomalien hindeutet. In Übereinstimmung mit den Trübungs-Assay-Ergebnissen stellt die Gerinnselbildung in Gegenwart eines A-beta-Fibrinogen-Interaktionsblockers teilweise die Struktur des Fibringer aus den A-Beta-induzierten Veränderungen wieder her, da bei dieser Behandlung weniger Klumpen beobachtet werden.Die Analyseprotokolle "Gerinnseltrübungstest" und "Rasterelektronenmikroskop" wurden für die schnelle und reproduzierbare Bewertung mehrerer A-beta-Fibrinogen-Wechselwirkungshemmer optimiert. Und bald werden Daten wertvolle Informationen über die Bildung von Fibrin-Gerinnsel liefern, die sowohl in vitro als auch in vivo auf weitere Studien angewendet werden können.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Verfahren zum Visualisieren und Analysieren Membran interagierender Proteine ​​durch Transmissionselektronenmikroskopie

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Forschung

Biochemie

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Hochauflösende Einzelteilchenanalyse aus Elektronen-Kryomikroskopie-Bildern mit SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Halbautomatische Biopanning bakterielle Anzeige Bibliotheken für Peptid Affinität Reagenz Entdeckung und Analyse der daraus resultierenden Isolate

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems

Variationen auf negativ Färben Elektronenmikroskopie Methoden: Werkzeuge für die Bekämpfung der anspruchsvolle Systeme

Negative stain electron microscopy (EM) allows relatively simple and quick observation of macromolecules and macromolecular complexes through the use of ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

Analyse dynamischer Proteinkomplexe montiert auf und befreit Biolayer Interferometrie Biosensor mit Massenspektrometrie und Elektronenmikroskopie

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Mitochondrien und Endoplasmatische Retikulum-Bildgebung durch korrelative Licht- und Volumenelektronenmikroskopie

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Querschnitt von reifem Reis (Oryza sativa L.) Kerne für die Rasterelektronenmikroskopie-Bildgebung mit Pipettenspitzen als Immobilisierungsunterstützung

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Einzelzellanalyse transkriptionell aktiver Allele mittels Einzelmolekül FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie: Von der Probe zur Struktur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Mikrostrukturierung von Transmissionselektronenmikroskopie-Gittern zur direkten Zellpositionierung innerhalb von Ganzzell-Kryo-Elektronentomographie-Workflows

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...