Name: analysis of &#946;-amyloid-induced abnormalities on fibrin clot structure by spectroscopy and scanning electron microscopy
Uploaded: 2018-11-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of ÃŽÂ²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

מחברים תודה מסאנורי קוואסקי Kazuyoshi אסו, מייקל פולי מ מכון דיסקברי הרפוי Tri-מוסדית (TDI), ניו-יורק של סינתזה של מעכבי האינטראקציה Aβ-פיברינוגן והצעות ערך שלהם. מחברים תודה גם חברי המעבדה סטריקלנד לדיון מועיל. עבודה זו נתמכה על ידי מענק-NIH NS104386 האלצהיימר קרן גילוי סמים, רוברטסון טיפולית הקרן עבור ה, NIH הענק NS50537, מכון דיסקברי הרפוי Tri-מוסדית, אלצהיימר סמים גילוי קרן, קרן משפחת רודין, ג'ון הרמן א עבור אס

1. הכנת Aβ42, פיברינוגן לניתוח
<ol><li>להכין Aβ42 monomeric של אבקת lyophilized<ol>
<li>לחמם Aβ42 אבקת בטמפרטורת החדר, ספין למטה ב g x 1,500 ל 30 s.</li>
		<li>הוספת µL 100 של קרח hexafluoroisopropanol (HFIP) לפי 0.5 מ ג של אבקת Aβ42, תקופת דגירה של 30 דקות על קרח. התראה: נקוט משנה זהירות בעת טיפול HFIP ולבצע כל השלבים בשכונה כימי.</li>
		<li>להכין 20 µL ...

<ol>
	<li>Selkoe, D. J., Schenk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease:+molecular+understanding+predicts+amyloid-based+therapeutics.">Alzheimer's disease: molecular understanding predicts amyloid-based therapeutics.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 43, 545-584 (2003).</li><li>Kurz, A., Perneczky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+clearance+as+a+treatment+target+against+Alzheimer's+disease.">Amyloid clearance as a treatment target against Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 24, 61-73 (2011).</li><li>Benilova, I., Karran, E., De Strooper, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+toxic+Abeta+oligomer+and+Alzheimer's+disease:+an+emperor+in+need+of+clothes.">The toxic Abeta oligomer and Alzheimer's disease: an emperor in need of clothes.</a> Nature Neuroscience. 15 (3), 349-357 (2012).</li><li>Karran, E., Hardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critique+of+the+drug+discovery+and+phase+3+clinical+programs+targeting+the+amyloid+hypothesis+for+Alzheimer+disease.">A critique of the drug discovery and phase 3 clinical programs targeting the amyloid hypothesis for Alzheimer disease.</a> Annals of Neurology. 76 (2), 185-205 (2014).</li><li>Yoshikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+cerebral+blood+flow+in+Alzheimer+disease+and+vascular+dementia.">Heterogeneity of cerebral blood flow in Alzheimer disease and vascular dementia.</a> AJNR, American Journal of Neuroradiology. 24 (7), 1341-1347 (2003).</li><li>Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+will+out:+vascular+contributions+to+Alzheimer's+disease.">Blood will out: vascular contributions to Alzheimer's disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (2), 556-563 (2018).</li><li>Ahn, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease+peptide+beta-amyloid+interacts+with+fibrinogen+and+induces+its+oligomerization.">Alzheimer's disease peptide beta-amyloid interacts with fibrinogen and induces its oligomerization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21812-21817 (2010).</li><li>Zamolodchikov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+structural+analysis+of+the+interaction+between+beta-amyloid+and+fibrinogen.">Biochemical and structural analysis of the interaction between beta-amyloid and fibrinogen.</a> Blood. 128 (8), 1144-1151 (2016).</li><li>Cortes-Canteli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrinogen+and+beta-amyloid+association+alters+thrombosis+and+fibrinolysis:+a+possible+contributing+factor+to+Alzheimer's+disease.">Fibrinogen and beta-amyloid association alters thrombosis and fibrinolysis: a possible contributing factor to Alzheimer's disease.</a> Neuron. 66 (5), 695-709 (2010).</li><li>Cortes-Canteli, M., Mattei, L., Richards, A. T., Norris, E. H., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+deposited+in+the+Alzheimer's+disease+brain+promotes+neuronal+degeneration.">Fibrin deposited in the Alzheimer's disease brain promotes neuronal degeneration.</a> Neurobiology of Aging. 36 (2), 608-617 (2015).</li><li>Liao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+characterization+of+postmortem+amyloid+plaques+isolated+by+laser+capture+microdissection.">Proteomic characterization of postmortem amyloid plaques isolated by laser capture microdissection.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 37061-37068 (2004).</li><li>Zamolodchikov, D., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abeta+delays+fibrin+clot+lysis+by+altering+fibrin+structure+and+attenuating+plasminogen+binding+to+fibrin.">Abeta delays fibrin clot lysis by altering fibrin structure and attenuating plasminogen binding to fibrin.</a> Blood. 119 (14), 3342-3351 (2012).</li><li>Ahn, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Abeta-fibrinogen+interaction+inhibitor+rescues+altered+thrombosis+and+cognitive+decline+in+Alzheimer's+disease+mice.">A novel Abeta-fibrinogen interaction inhibitor rescues altered thrombosis and cognitive decline in Alzheimer's disease mice.</a> The Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1049-1062 (2014).</li><li>Singh, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminopyrimidine+Class+Aggregation+Inhibitor+Effectively+Blocks+Abeta-Fibrinogen+Interaction+and+Abeta-Induced+Contact+System+Activation.">Aminopyrimidine Class Aggregation Inhibitor Effectively Blocks Abeta-Fibrinogen Interaction and Abeta-Induced Contact System Activation.</a> Biochemistry. 57 (8), 1399-1409 (2018).</li><li>Pretorius, E., Mbotwe, S., Bester, J., Robinson, C. J., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+induction+of+anomalous+and+amyloidogenic+blood+clotting+by+molecular+amplification+of+highly+substoichiometric+levels+of+bacterial+lipopolysaccharide.">Acute induction of anomalous and amyloidogenic blood clotting by molecular amplification of highly substoichiometric levels of bacterial lipopolysaccharide.</a> Journal of the Royal Society Interface. 13 (122), (2016).</li><li>Veklich, Y., Francis, C. W., White, J., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+studies+of+fibrinolysis+by+electron+microscopy.">Structural studies of fibrinolysis by electron microscopy.</a> Blood. 92 (12), 4721-4729 (1998).</li><li>Weisel, J. W., Nagaswami, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+modeling+of+fibrin+polymerization+kinetics+correlated+with+electron+microscope+and+turbidity+observations:+clot+structure+and+assembly+are+kinetically+controlled.">Computer modeling of fibrin polymerization kinetics correlated with electron microscope and turbidity observations: clot structure and assembly are kinetically controlled.</a> Biophysical Journal. 63 (1), 111-128 (1992).</li><li>Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+clots+are+equilibrium+polymers+that+can+be+remodeled+without+proteolytic+digestion.">Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion.</a> Scientific Reports. 2, 879 (2012).</li><li>Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+amyloid+beta-peptide+(Abeta)+aggregation+using+the+Congo+red-Abeta+(CR-abeta)+spectrophotometric+assay.">Quantifying amyloid beta-peptide (Abeta) aggregation using the Congo red-Abeta (CR-abeta) spectrophotometric assay.</a> Analytical Biochemistry. 266 (1), 66-76 (1999).</li><li>Zhao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+amyloid+formation+by+turbidity+assay-seeing+through+the+cloud.">Measurement of amyloid formation by turbidity assay-seeing through the cloud.</a> Biophysical Reviews. 8 (4), 445-471 (2016).</li><li>Bester, J., Soma, P., Kell, D. B., Pretorius, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+and+ultrastructural+characteristics+of+whole+blood+and+plasma+in+Alzheimer-type+dementia,+and+the+possible+role+of+bacterial+lipopolysaccharides+(LPS).">Viscoelastic and ultrastructural characteristics of whole blood and plasma in Alzheimer-type dementia, and the possible role of bacterial lipopolysaccharides (LPS).</a> Oncotarget. 6 (34), 35284-35303 (2015).</li><li>Pretorius, E., Page, M. J., Mbotwe, S., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-binding+protein+(LBP)+can+reverse+the+amyloid+state+of+fibrin+seen+or+induced+in+Parkinson's+disease.">Lipopolysaccharide-binding protein (LBP) can reverse the amyloid state of fibrin seen or induced in Parkinson's disease.</a> PLoS One. 13 (3), e0192121 (2018).</li><li>Kell, D. B., Pretorius, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+behaving+badly.+Substoichiometric+molecular+control+and+amplification+of+the+initiation+and+nature+of+amyloid+fibril+formation:+lessons+from+and+for+blood+clotting.">Proteins behaving badly. Substoichiometric molecular control and amplification of the initiation and nature of amyloid fibril formation: lessons from and for blood clotting.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 123, 16-41 (2017).</li><li>Wolberg, A. S., Campbell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombin+generation,+fibrin+clot+formation+and+hemostasis.">Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis.</a> Transfusion and Apheresis Science. 38 (1), 15-23 (2008).</li><li>Soon, A. S., Lee, C. S., Barker, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+fibrin+matrix+properties+via+knob:hole+affinity+interactions+using+peptide-PEG+conjugates.">Modulation of fibrin matrix properties via knob:hole affinity interactions using peptide-PEG conjugates.</a> Biomaterials. 32 (19), 4406-4414 (2011).</li></ol>

השיטות המתוארות כאן מספקים אמצעי מהיר הדירים הערכת פיברין קריש היווצרות במבחנה. יתר על כן, הפשטות של המערכת הופכת את הפרשנות של מה Aβ משפיע על היווצרות קרישי פיברין ועל מבנה יחסית ישר קדימה. בפרסום הקודם של המעבדה הזאת, זה הוצג כי מבחני אלה יכול לשמש לבדיקת תרכובות על יכולתם לעכב את האי...

מחלת אלצהיימר (AD), מחלת ניוון עצבי מוביל לירידה קוגניטיבית בחולים קשישים, יוכפל לאחר המרתו נובע חריג בטא עמילואיד (Aβ), צבירת וביטוי סיווג לקוי וכתוצאה מכך neurotoxicity1, 2. למרות האגודה מאופיין היטב בין Aβ אגרגטים לספירה3, המנגנונים מדויק המחלה פתולוגיה אינם מובנים היטב4. הוכחה גוברת מרמז כי הגירעונות נוירו-וסקולריים לשחק תפקיד התקדמות וחומרת של המודעה5, כפי Aβ ישירות אינטראקציה עם הרכיבים של מערכת הדם6. Aβ יש אינטראקציה גבוהה-זיקה עם פיברינוגן7,8, אשר רגישה גם על פיקדונות Aβ חולי אלצהיימר והן העכבר מודלים9,10,11. יתר על כן, האינטראקציה Aβ-פיברינוגן גורם היווצרות חריגה של clot פיברין, מבנה, כמו גם התנגדות ופיברינוליזה9,12. אפשרות טיפולית אחת בטיפול לספירה, היא שיכוך גירעונות הדם על ידי עיכוב האינטראקציה בין13,Aβ, פיברינוגן14. לכן, זיהינו מספר תרכובות קטן מעכבות את האינטראקציה Aβ-פיברינוגן באמצעות הקרנה תפוקה גבוהה וכימיה מרפא גישות13,14. כדי לבדוק את היעילות של מעכבי האינטראקציה Aβ-פיברינוגן, אנחנו ממוטב שתי שיטות לניתוח של במבחנה היווצרות קרישי פיברין: ייקרש עכירות assay וסריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM)14.
קריש דם עכירות וזמינותו היא שיטה ישר קדימה ומהירה לניטור היווצרות קרישי פיברין באמצעות ספקטרוסקופית UV-גלוי. כמו קריש פיברין טפסים, תאורה מפוזרת יותר ויותר ומגביר עכירות של הפתרון. לעומת זאת, כאשר Aβ קיים, המבנה של קריש פיברין היא שונה, עכירות של התערובת מצטמצם (איור 1). יכול להיות שקובעת את ההשפעה של תרכובות מעכבות היכולת לשחזר עכירות קריש דם Aβ-induced הפרעות. בעוד וזמינותו עכירות מאפשר לניתוח מהיר של תנאים מרובים, הוא מספק מידע מוגבל על צורתו קריש דם. SEM, שבו לטופוגרפיה של חפצים מוצקים מתגלה על ידי אלקטרון הגישוש, מאפשר הניתוח של הארכיטקטורה תלת-ממד של17,18 16,15,קריש דם, את ההערכה של איך הנוכחות של Aβ, תרכובות מעכבות/או משנה את מבנה9,14. הן ספקטרומטר SEM הם וטכניקות מעבדה קלאסית כי שימשו למטרות שונות, לדוגמה, ספקטרופוטומטר משמש לניטור צבירת עמילואיד19,20. באופן דומה, SEM משמש גם כדי לנתח clot פיברין נוצר הפלזמה של אלצהיימר, פרקינסון, שבץ תרומבואמבוליים חולים21,22,23. הפרוטוקולים המובאים כאן הם אופטימיזציה עבור הערכת היווצרות קרישי פיברין בצורה מהירה הדירים.
פרוטוקול הבאים מספק את ההוראות להכנת במבחנה -clot פיברין עם ובלי Aβ. זה גם מפרט את שיטות כדי לנתח את השפעת Aβ על היווצרות קרישי פיברין ומבנה. היעילות של שתי השיטות למדידת עיכוב של האינטראקציה Aβ-פיברינוגן הוכח באמצעות TDI-2760, מתחם מעכבות14קטן. שיטות אלו, הן כיחידים והן יחד, מאפשרים ניתוח מהירה וישירה של במבחנה היווצרות קרישי פיברין.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fibriogen, Plasminogen-Depleted, Plasma</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>341578</td>
			<td>keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-Amyloid (1-42), Human</td>
			<td>Anaspec</td>
			<td>AS-20276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from human plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>105228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTERED</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>C70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Syringe, 0.2&#181;M, 25mm</td>
			<td>Pall</td>
			<td>4612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia.</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLVV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat Bottom</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>21377203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectramax Plus384</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>89212-396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, 5417R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 200 Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>15-337-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Rotator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>2314-1CEQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spare washers for cover slip holder</td>
			<td>Tousimis</td>
			<td>8766-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow Stem Pipets - Sedi-Pet</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>70967-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample holder for CPD (Cover slip holder)</td>
			<td>Tousimis</td>
			<td>8766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mount Holder Box, Pin Type</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>76610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round glass cover slides (12 mm)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>16120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Cacodylate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM Stubs, Tapered end pin.</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>75192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm OD</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16084-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosamdri-815 Critical Point Dryer with Gold/Palladium target</td>
			<td>Tousimis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denton Desk IV Coater</td>
			<td>Denton Vacuum</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leo 1550 FE-SEM</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smart SEM Software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of &#946;-amyloid-induced abnormalities on fibrin clot structure by spectroscopy and scanning electron microscopy

מאמר זה מציג שיטות ליצירת קרישי פיברין ב חוץ גופית ו ניתוח ההשפעה של חלבון (Aβ) בטא עמילואיד על היווצרות קרישי ומבנה באמצעות ספקטרומטר וסריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM). Aβ, המהווה אגרגטים עמילואיד העצבים של מחלת אלצהיימר (AD), הוכח לקיים אינטראקציה עם פיברינוגן. אינטראקציה זו Aβ-פיברינוגן הופך קריש פיברין חריגות מבנית ועמיד בפני ופיברינוליזה. Aβ-induced העיוותים פיברין קרישת עשוי גם לתרום היבטים כשאבדן של פתולוגיה לספירה כגון microinfarcts, דלקת, וכן, angiopathy עמילואיד במוח (סי). בהתחשב בתפקיד הגירעונות נוירו-וסקולריים שעשוי להיות קריטי בפתולוגיה לספירה, פיתוח תרכובות אשר יכול לעכב או להפחית את האינטראקציה Aβ-פיברינוגן יש ערך טיפולי מבטיח. במבחנה שיטות מאת אילו פיברין היווצרות קריש דם יכול בקלות ובאופן שיטתי להידרש הן כלים שימושיים פוטנציאל לפיתוח תרכובות טיפולית. המוצג כאן הוא פרוטוקול אופטימיזציה עבור הדור במבחנה של קריש פיברין, כמו גם ניתוח ההשפעה של מעכבי האינטראקציה Aβ ו- Aβ-פיברינוגן. וזמינותו עכירות קריש דם מהירה, לשחזור מאוד והוא יכול לשמש כדי לבדוק תנאים מרובים בו זמנית, המאפשר הקרנת הסרט מספר גדול של מעכבי Aβ-פיברינוגן. תרכובות פגע ההקרנה הזאת ניתן להעריך עוד יותר בשל יכולתן דהוא Aβ-induced מומים מבניים של האדריכלות קריש פיברין תוך שימוש ב- SEM. היעילות של פרוטוקולים ממוטבת אלה הפגינו כאן באמצעות TDI-2760, מעכב האינטראקציה Aβ-פיברינוגן שזוהו לאחרונה.

במבחנה קרישת assay (עכירות), תרומבין אנזים cleaves פיברינוגן, וכתוצאה מכך להיווצרות רשת פיברין24. המשקע קריש פיברין גורמת פיזור של האור עובר דרך הפתרון, וכתוצאה מכך גדל עכירות (איור 1), דיו לפני סוף תקופת הקריאה (איור 2, ירוק). כאשר ?...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of ÃŽÂ²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

ניתוח של β-עמילואיד-induced הפרעות על מבנה קריש פיברין על ידי ספקטרוסקופיה וסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים

להלן מוצגות שתי שיטות שבהן ניתן להשתמש בנפרד או במשולב כדי לנתח את השפעת בטא עמילואיד על מבנה קריש פיברין. כלול הוא פרוטוקול עבור יצירה של במבחנה clot פיברין, ואחריו קריש עכירות ואלקטרון סריקה שיטות.

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

היתרון העיקרי של זה צלחת מבוססי עגימות מבחן הוא שזה מהיר ומאפשר כמה מעכבי אינטראקציה עמילואיד-בטא פיברינוגן להיות מוקרן בבת אחת ללא התקנה מתוחכמת או דרישות. ניתן להעריך עוד יותר את תרכובות הראש נמצאות בבדיקה של עיסת פיברין על יכולתן לשחזר חריגות מבניות הנגרמות על-ידי A-beta בקרישי הפיברין שנותחו על-ידי סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים. הדגמה חזותית של הכנת קריש לסריקת ניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים היא קריטית כמו כל וריאציות בהכנה יכול לתרום וריאציות בתוך התוצאות הניסוי.המוקד של ההדגמה הזאת כאן הוא על אינטראקציות פיברינוגן A-בטא. פרוטוקול זה ניתן לשנות בקלות כדי לנתח אינטראקציות אחרות עם חלבונים אחרים ואת התרכובות עם קריש פיברין. התחל על ידי הוספת 1.5 micromolar של פיברינוגן מוכן טרי ב 200 microliters של חיץ היווצרות קריש לכל A-בטא שלילי 42 המכיל ולשלוט בארות דגירה את הצלחת על פלטפורמה מסתובבת בטמפרטורת החדר.לאחר 30 דקות בו זמנית להוסיף 30 microliters של פתרון תרומבין מוכן טרי ישירות למרכז של היטב המכיל פיברינוגן ליזום היווצרות קריש ומיד לקרוא את הספיגה של קרישי במבחנה ב 350 ננומטר, חוזר על המדידה כל 30 עד 60 שניות במהלך 10 דקות. כדי להעריך את ההשפעה של מעכבי אינטראקציה פיברינוגן A-בטא על מבנה קריש פיברין, תחילה להשתמש במלקחיים כדי למקם נקי, 12 מילימטר סיליקון עיגול זכוכית מכסה מחליק ל בארות בודדות של צלחת 12 היטב ולהוסיף 80 microliters של פיברינוגן על כל להחליק כיסוי, בעדינות להפיץ את הפתרון, כך שהם מופצים באופן שווה. הוסף 20 microliters של פתרון תרומבין לכל באר ליזום היווצרות קריש.מכסים את הצלחת במשך 30 עד 60 דקות דגירה בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן בעדינות להטביע כל קריש בשני מיליליטר של חיץ קסודילאט נתרן קר כקרח במשך שתי דקות, מכוסה, בטמפרטורת החדר פעמיים, באמצעות פיפטה מיליליטר אחד כדי להסיר בזהירות את החיץ לאחר כל שטיפה. לאחר הכביסה האחרונה, לבדוק את המצב של היווצרות קריש על להחליק את הכיסוי ולתקן את הקרישים לשניים עד שלושה מיליליטר של קרח קר 2% glutaraldehyde על הקרח במשך 30 דקות. בסוף הדגירה, להסיר בעדינות את glutaraldehyde מכל באר ולשטוף את הקרישים עם חיץ ק קוריקט נתרן טרי כפי שהוכח על קרח.כדי לחות את הקרישים הקבועים בסדרה מדורגת של חמש דקות קרות קרח אתנול שוטף על קרח מבלי להסיר לחלוטין את האתנול בין לשטוף כדי לשמור על קרישי הדם מוגנים מפני חשיפה לאוויר. במהלך 100% שטיפת האתנול האחרונה, מעבירים את החלקות הכיסוי למחזיק דגימת מייבש נקודה קריטי, ומניחים לפחות מכונת כביסה אחת בין כל החלקת כיסוי ומניחים את המחזיק בתא מייבש נקודה קריטי מלא באתנול. לאחר מחזור ייבוש של 30 דקות, השתמש בקלטת פחמן כדי להרכיב את מחליקי הכיסוי על ספלים בודדים של מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה ולהעביר את הדגימות לתא הציפוי של מעיל sputter ואקום.ואז מעיל sputter פחות מ 20 ננומטר של פלדיום זהב או חומרים מוליך אחרים על הדגימות במשך 25 שניות בארבע אנגסטרום לשנייה ותמונה הדגימות על מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה מצויד בסוג שני גלאי אלקטרונים משניים בארבעה קילו-וולט. היווצרות קריש פיברין גורמת לפיזור האור העובר דרך הפתרון, וכתוצאה מכך מערבולת מוגברת כי מישורים בסוף תקופת הקריאה. כאשר פיברינוגן הוא דגירה בנוכחות A-beta 42 העכור של הפתרון פוחתת עם העקומה להגיע לגובה מרבי של כמחצית מזה של פיברינוגן בלבד.בנוכחות חוסם אינטראקציה A-beta 42 ההשפעה של בטא עמילואיד הוא ameliorated ואת עכור הוא גבוה יותר מזה עם A-בטא לבד. ההשפעה של החוסם אינה מופיעה בשל מערבולת רקע כמו המתחם אינו משנה את מערבולת קריש פיברין כאשר A-בטא נעדר. כמו כן, היווצרות קריש בנוכחות GPRP, פפטיד ידוע להפריע פילמור פיברין, מדגים כורכום מופחת באופן משמעותי לעומת היווצרות קריש פיברין בהיעדר המעכב.פיברינוגן שנוצר בנוכחות טרומבין וסידן כלורי רק יוצרים רשת פיברין עם חוטים מוארכים ומזורכים של פיברין, כמו גם חבילות גדולות יותר. כאשר A-בטא קיים, חוטי פיברין הפך דק יותר עם כמה גושים דביקים אגרגטים, המציין A-בטא המושרה מומים מבניים. עולה בקנה אחד עם תוצאות הבדיקה מערבולת, היווצרות קריש בנוכחות חוסם אינטראקציה פיברינוגן A-בטא משחזר חלקית את המבנה של קריש פיברין מן השינויים הנגרמים על ידי A-בטא כמו גושים פחות נצפו עם טיפול זה.בדיקת מערבולת קריש וסריקת פרוטוקולי ניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים כבר אופטימיזציה להערכת מספר מעכבי אינטראקציה פיברינוגן A-בטא בצורה מהירה לשחזור. ובקרוב נתונים יספקו מידע רב ערך על היווצרות קריש פיברין שניתן ליישם למחקרים נוספים הן במבחנה והן ב- vivo.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

השיטה לחזות ולנתח חלבוני אינטראקצית ממברנה ידי הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

ברזולוציה גבוהה ניתוח החלקיקים יחיד מאת אלקטרונים Cryo-microscopy תמונות באמצעות SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Biopanning חצי אוטומטי של התצוגה חיידקי ספריות פפטיד זיקה ריאגנט גילוי וניתוח של מבודד וכתוצאה מכך

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems

וריאציות על שלילי כתם מיקרוסקופ אלקטרונים שיטות: כלים בהתמודדות עם אתגר מערכות

Negative stain electron microscopy (EM) allows relatively simple and quick observation of macromolecules and macromolecular complexes through the use of ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

ניתוח דינאמי חלבון מתחמי נאסף בנושא ושוחרר מן Biolayer אינטרפרומטריה ביוסנסור באמצעות ספקטרומטר מסה ואלקטרון

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

הדמיה של מיקרוסקופיה ואנדופלזמית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים באור ונפח

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

חתך רוחבי של אורז בוגר (Oryza sativa L.) גרעינים לסריקת הדמיית מיקרוסקופיה אלקטרונית באמצעות טיפים פיפטה כתמיכה ללא תנועה

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

ניתוח תא יחיד של אללים פעילים בתעתיק על ידי מולקולה אחת FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית חלקיקית בודדת: מדגם למבנה

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

רשתות מיקרוסקופיות אלקטרוניות של שידור מיקרו-מפזרנינג למיקום תאים ישירים בתהליכי עבודה של טומוגרפיה קריו-אלקטרונים של תאים שלמים

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...