Name: analysis of &#946;-amyloid-induced abnormalities on fibrin clot structure by spectroscopy and scanning electron microscopy
Uploaded: 2018-11-30T14:30:00
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लेखक Masanori कावासाकी, Kazuyoshi Aso, और माइकल Foley त्रिकोणीय संस्थागत चिकित्सकीय खोज संस्थान (TDI), Aβ के संश्लेषण के लिए ंयूयॉर्क-फाइब्रिनोजेन संपर्क अवरोधकों और उनके बहुमूल्य सुझावों से धंयवाद । लेखक भी सहायक चर्चा के लिए Strickland लैब के सदस्यों को धंयवाद । यह काम NIH ग्रांट NS104386, अल्जाइमर ड्रग डिस्कवरी फाउंडेशन, और Robertson चिकित्सीय विकास निधि के लिए H.A., NIH ग्रांट NS50537, त्रि-संस्थागत चिकित्सकीय खोज संस्थान, अल्जाइमर्स ड्रग डिस्कवरी फाउंडेशन, के द्वारा समर्थित था ऩुदीन परिवार फाउंडेशन, और जॉन ए Herrmann एस॰एस॰ के लिए

1. aβ ४२ और फाइब्रिनोजेन के विश्लेषण के लिए तैयार करना
<ol><li>lyophilized पाउडर से तैयार monomeric aβ ४२<ol>
<li>गर्म aβ ४२ पाउडर कमरे के तापमान के लिए और 30 एस के लिए १,५०० x g पर नीचे स्पिन ।</li>
		<li>बर्फ के १०० µ एल जोड़ें ठंडा hexafluoroisopropanol (HFIP) ...

<ol>
	<li>Selkoe, D. J., Schenk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease:+molecular+understanding+predicts+amyloid-based+therapeutics.">Alzheimer's disease: molecular understanding predicts amyloid-based therapeutics.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 43, 545-584 (2003).</li><li>Kurz, A., Perneczky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+clearance+as+a+treatment+target+against+Alzheimer's+disease.">Amyloid clearance as a treatment target against Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 24, 61-73 (2011).</li><li>Benilova, I., Karran, E., De Strooper, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+toxic+Abeta+oligomer+and+Alzheimer's+disease:+an+emperor+in+need+of+clothes.">The toxic Abeta oligomer and Alzheimer's disease: an emperor in need of clothes.</a> Nature Neuroscience. 15 (3), 349-357 (2012).</li><li>Karran, E., Hardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critique+of+the+drug+discovery+and+phase+3+clinical+programs+targeting+the+amyloid+hypothesis+for+Alzheimer+disease.">A critique of the drug discovery and phase 3 clinical programs targeting the amyloid hypothesis for Alzheimer disease.</a> Annals of Neurology. 76 (2), 185-205 (2014).</li><li>Yoshikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+cerebral+blood+flow+in+Alzheimer+disease+and+vascular+dementia.">Heterogeneity of cerebral blood flow in Alzheimer disease and vascular dementia.</a> AJNR, American Journal of Neuroradiology. 24 (7), 1341-1347 (2003).</li><li>Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+will+out:+vascular+contributions+to+Alzheimer's+disease.">Blood will out: vascular contributions to Alzheimer's disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (2), 556-563 (2018).</li><li>Ahn, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease+peptide+beta-amyloid+interacts+with+fibrinogen+and+induces+its+oligomerization.">Alzheimer's disease peptide beta-amyloid interacts with fibrinogen and induces its oligomerization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21812-21817 (2010).</li><li>Zamolodchikov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+structural+analysis+of+the+interaction+between+beta-amyloid+and+fibrinogen.">Biochemical and structural analysis of the interaction between beta-amyloid and fibrinogen.</a> Blood. 128 (8), 1144-1151 (2016).</li><li>Cortes-Canteli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrinogen+and+beta-amyloid+association+alters+thrombosis+and+fibrinolysis:+a+possible+contributing+factor+to+Alzheimer's+disease.">Fibrinogen and beta-amyloid association alters thrombosis and fibrinolysis: a possible contributing factor to Alzheimer's disease.</a> Neuron. 66 (5), 695-709 (2010).</li><li>Cortes-Canteli, M., Mattei, L., Richards, A. T., Norris, E. H., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+deposited+in+the+Alzheimer's+disease+brain+promotes+neuronal+degeneration.">Fibrin deposited in the Alzheimer's disease brain promotes neuronal degeneration.</a> Neurobiology of Aging. 36 (2), 608-617 (2015).</li><li>Liao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+characterization+of+postmortem+amyloid+plaques+isolated+by+laser+capture+microdissection.">Proteomic characterization of postmortem amyloid plaques isolated by laser capture microdissection.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 37061-37068 (2004).</li><li>Zamolodchikov, D., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abeta+delays+fibrin+clot+lysis+by+altering+fibrin+structure+and+attenuating+plasminogen+binding+to+fibrin.">Abeta delays fibrin clot lysis by altering fibrin structure and attenuating plasminogen binding to fibrin.</a> Blood. 119 (14), 3342-3351 (2012).</li><li>Ahn, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Abeta-fibrinogen+interaction+inhibitor+rescues+altered+thrombosis+and+cognitive+decline+in+Alzheimer's+disease+mice.">A novel Abeta-fibrinogen interaction inhibitor rescues altered thrombosis and cognitive decline in Alzheimer's disease mice.</a> The Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1049-1062 (2014).</li><li>Singh, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminopyrimidine+Class+Aggregation+Inhibitor+Effectively+Blocks+Abeta-Fibrinogen+Interaction+and+Abeta-Induced+Contact+System+Activation.">Aminopyrimidine Class Aggregation Inhibitor Effectively Blocks Abeta-Fibrinogen Interaction and Abeta-Induced Contact System Activation.</a> Biochemistry. 57 (8), 1399-1409 (2018).</li><li>Pretorius, E., Mbotwe, S., Bester, J., Robinson, C. J., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+induction+of+anomalous+and+amyloidogenic+blood+clotting+by+molecular+amplification+of+highly+substoichiometric+levels+of+bacterial+lipopolysaccharide.">Acute induction of anomalous and amyloidogenic blood clotting by molecular amplification of highly substoichiometric levels of bacterial lipopolysaccharide.</a> Journal of the Royal Society Interface. 13 (122), (2016).</li><li>Veklich, Y., Francis, C. W., White, J., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+studies+of+fibrinolysis+by+electron+microscopy.">Structural studies of fibrinolysis by electron microscopy.</a> Blood. 92 (12), 4721-4729 (1998).</li><li>Weisel, J. W., Nagaswami, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+modeling+of+fibrin+polymerization+kinetics+correlated+with+electron+microscope+and+turbidity+observations:+clot+structure+and+assembly+are+kinetically+controlled.">Computer modeling of fibrin polymerization kinetics correlated with electron microscope and turbidity observations: clot structure and assembly are kinetically controlled.</a> Biophysical Journal. 63 (1), 111-128 (1992).</li><li>Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+clots+are+equilibrium+polymers+that+can+be+remodeled+without+proteolytic+digestion.">Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion.</a> Scientific Reports. 2, 879 (2012).</li><li>Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+amyloid+beta-peptide+(Abeta)+aggregation+using+the+Congo+red-Abeta+(CR-abeta)+spectrophotometric+assay.">Quantifying amyloid beta-peptide (Abeta) aggregation using the Congo red-Abeta (CR-abeta) spectrophotometric assay.</a> Analytical Biochemistry. 266 (1), 66-76 (1999).</li><li>Zhao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+amyloid+formation+by+turbidity+assay-seeing+through+the+cloud.">Measurement of amyloid formation by turbidity assay-seeing through the cloud.</a> Biophysical Reviews. 8 (4), 445-471 (2016).</li><li>Bester, J., Soma, P., Kell, D. B., Pretorius, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+and+ultrastructural+characteristics+of+whole+blood+and+plasma+in+Alzheimer-type+dementia,+and+the+possible+role+of+bacterial+lipopolysaccharides+(LPS).">Viscoelastic and ultrastructural characteristics of whole blood and plasma in Alzheimer-type dementia, and the possible role of bacterial lipopolysaccharides (LPS).</a> Oncotarget. 6 (34), 35284-35303 (2015).</li><li>Pretorius, E., Page, M. J., Mbotwe, S., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-binding+protein+(LBP)+can+reverse+the+amyloid+state+of+fibrin+seen+or+induced+in+Parkinson's+disease.">Lipopolysaccharide-binding protein (LBP) can reverse the amyloid state of fibrin seen or induced in Parkinson's disease.</a> PLoS One. 13 (3), e0192121 (2018).</li><li>Kell, D. B., Pretorius, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+behaving+badly.+Substoichiometric+molecular+control+and+amplification+of+the+initiation+and+nature+of+amyloid+fibril+formation:+lessons+from+and+for+blood+clotting.">Proteins behaving badly. Substoichiometric molecular control and amplification of the initiation and nature of amyloid fibril formation: lessons from and for blood clotting.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 123, 16-41 (2017).</li><li>Wolberg, A. S., Campbell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombin+generation,+fibrin+clot+formation+and+hemostasis.">Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis.</a> Transfusion and Apheresis Science. 38 (1), 15-23 (2008).</li><li>Soon, A. S., Lee, C. S., Barker, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+fibrin+matrix+properties+via+knob:hole+affinity+interactions+using+peptide-PEG+conjugates.">Modulation of fibrin matrix properties via knob:hole affinity interactions using peptide-PEG conjugates.</a> Biomaterials. 32 (19), 4406-4414 (2011).</li></ol>

तरीकों यहां वर्णित एक reproducible और तेजी से फाइब्रिन थक्का गठन का आकलन करने का मतलब है इन विट्रो मेंप्रदान करते हैं । इसके अलावा, प्रणाली की सादगी कैसे Aβ फाइब्रिन थक्का गठन और अपेक्षाकृत सीधे आगे की संरचन?...

अल्जाइमर रोग (AD), एक neurodegenerative बुजुर्ग रोगियों में संज्ञानात्मक गिरावट के लिए अग्रणी रोग, predominately असामान्य बीटा से उठता है-amyloid (Aβ) अभिव्यक्ति, एकत्रीकरण और ख़राब मंजूरी neurotoxicity 1 में जिसके परिणामस्वरूप, 2. Aβ समुच्चय और विज्ञापन3, सटीक रोग विकृति अंतर्निहित तंत्र के बीच अच्छी तरह से जुड़ाव के बावजूद4अच्छी तरह से समझ नहीं रहे हैं । सबूत बढ़ाने से पता चलता है कि neurovascular घाटे प्रगति और5विज्ञापन की गंभीरता में एक भूमिका निभाते हैं, के रूप में Aβ सीधे संचार प्रणाली6के घटकों के साथ सूचना का आदान प्रदान । Aβ फाइब्रिनोजेन7,8, जो भी दोनों विज्ञापन रोगियों और माउस मॉडल9,10,11में Aβ जमा करने के लिए स्थानीयकरण के साथ एक उच्च संबंध बातचीत की है । इसके अलावा, Aβ-फाइब्रिनोजेन बातचीत असामान्य फाइब्रिन-थक्का गठन और संरचना, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से fibrinolysis9,12के लिए प्रतिरोध लाती है । एक विज्ञापन के इलाज में चिकित्सकीय संभावना है, Aβ और फाइब्रिनोजेन13,14के बीच बातचीत बाधा द्वारा संचार घाटे को समाप्त । हम इसलिए, कई छोटे उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग और औषधीय रसायन विज्ञान13,14के दृष्टिकोण का उपयोग कर Aβ-फाइब्रिनोजेन बातचीत बाधा यौगिकों की पहचान की । Aβ-फाइब्रिनोजेन संपर्क अवरोधकों की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए, हम इन विट्रो फाइब्रिन थक्का गठन: थक्का turbidity परख और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM)14के विश्लेषण के लिए दो तरीकों अनुकूलित ।
थक्का turbidity परख यूवी दिखाई स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग कर फाइब्रिन थक्का गठन की निगरानी के लिए एक सीधे आगे और तेजी से विधि है । फाइब्रिन थक्का रूपों के रूप में, प्रकाश तेजी से बिखरा हुआ है और समाधान के turbidity बढ़ जाती है । इसके विपरीत जब Aβ मौजूद होता है तो फाइब्रिन का थक्का की संरचना बदल जाती है, और मिश्रण की turbidity कम हो जाती है (चित्रा १). Aβ-प्रेरित विषमताओं से थक्का turbidity को बहाल करने की क्षमता के लिए निरोधात्मक यौगिकों के प्रभाव का आकलन किया जा सकता है । जबकि turbidity परख कई शर्तों के तेजी से विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, यह थक्का आकार और संरचना पर सीमित जानकारी प्रदान करता है । SEM, जिसमें ठोस वस्तुओं की स्थलाकृति इलेक्ट्रॉन जांच से पता चला है, थक्का15,16,17,18 और के आकलन के 3 डी वास्तुकला के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है कैसे Aβ की उपस्थिति और /या निरोधात्मक यौगिकों कि संरचना9,14बदल । दोनों स्पेक्ट्रोमेट्री और SEM शास्त्रीय प्रयोगशाला तकनीक है कि विभिंन प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल किया गया है, उदाहरण के लिए, spectrophotometry amyloid एकत्रीकरण19,20की निगरानी के लिए प्रयोग किया जाता है । इसी तरह, SEM भी अल्जाइमर के प्लाज्मा से गठित फाइब्रिन थक्का का विश्लेषण करने के लिए प्रयोग किया जाता है, पार्किंसंस और thromboembolic स्ट्रोक रोगियों21,22,23. यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक reproducible और तेजी से तरीके से फाइब्रिन-थक्का गठन का आकलन करने के लिए अनुकूलित कर रहे हैं ।
निम्नलिखित प्रोटोकॉल की तैयारी के लिए निर्देश प्रदान करता है एक इन विट्रो फाइब्रिन-थक्का दोनों के साथ और बिना Aβ. यह भी फाइब्रिन थक्का गठन और संरचना पर Aβ के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए तरीकों का विवरण । Aβ-फाइब्रिनोजेन बातचीत के निषेध को मापने के लिए इन दो तरीकों की प्रभावशीलता TDI-२७६०, एक छोटे निरोधात्मक यौगिक14का उपयोग कर प्रदर्शित किया जाता है । इन तरीकों, दोनों व्यक्तिगत और एक साथ, की अनुमति के लिए तेजी से और सीधा विश्लेषण इन विट्रो फाइब्रिन थक्का गठन.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fibriogen, Plasminogen-Depleted, Plasma</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>341578</td>
			<td>keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-Amyloid (1-42), Human</td>
			<td>Anaspec</td>
			<td>AS-20276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from human plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>105228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTERED</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>C70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Syringe, 0.2&#181;M, 25mm</td>
			<td>Pall</td>
			<td>4612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia.</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLVV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat Bottom</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>21377203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectramax Plus384</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>89212-396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, 5417R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 200 Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>15-337-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Rotator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>2314-1CEQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spare washers for cover slip holder</td>
			<td>Tousimis</td>
			<td>8766-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow Stem Pipets - Sedi-Pet</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>70967-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample holder for CPD (Cover slip holder)</td>
			<td>Tousimis</td>
			<td>8766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mount Holder Box, Pin Type</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>76610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round glass cover slides (12 mm)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>16120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Cacodylate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM Stubs, Tapered end pin.</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>75192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm OD</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16084-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosamdri-815 Critical Point Dryer with Gold/Palladium target</td>
			<td>Tousimis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denton Desk IV Coater</td>
			<td>Denton Vacuum</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leo 1550 FE-SEM</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smart SEM Software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of &#946;-amyloid-induced abnormalities on fibrin clot structure by spectroscopy and scanning electron microscopy

यह लेख इन विट्रो फाइब्रिन थक्के में पैदा करने के लिए तरीके प्रस्तुत करता है और स्पेक्ट्रोमेट्री और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) द्वारा थक्का गठन और संरचना पर बीटा-amyloid (Aβ) प्रोटीन के प्रभाव का विश्लेषण । Aβ, जो अल्जाइमर रोग (AD) में amyloid समुच्चय neurotoxic रूपों, फाइब्रिनोजेन के साथ बातचीत करने के लिए दिखाया गया है । इस Aβ-फाइब्रिनोजेन बातचीत फाइब्रिन थक्का संरचनात्मक रूप से असामान्य और fibrinolysis के लिए प्रतिरोधी बनाता है. फाइब्रिन थक्के में Aβ-प्रेरित असामान्यताओं microinfarcts, सूजन, साथ ही साथ, सेरेब्रल amyloid angiopathy (CAA) के रूप में विज्ञापन विकृति के मस्तिष्कवाहिकीय पहलुओं के लिए भी योगदान कर सकते हैं । विज्ञापन विकृति में neurovascular घाटे की संभावित महत्वपूर्ण भूमिका को देखते हुए, यौगिकों जो बाधित कर सकते है या कम Aβ-फाइब्रिनोजेन बातचीत चिकित्सकीय मूल्य का वादा किया है विकासशील । इन विट्रो विधियों द्वारा फाइब्रिन थक्का गठन आसानी से किया जा सकता है और व्यवस्थित रूप से मूल्यांकन चिकित्सकीय यौगिकों के विकास के लिए संभावित रूप से उपयोगी उपकरण हैं. यहां प्रस्तुत फाइब्रिन थक्का के इन विट्रो पीढ़ी के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल है, साथ ही Aβ और Aβ-फाइब्रिनोजेन बातचीत अवरोधकों के प्रभाव का विश्लेषण । थक्का turbidity परख तेजी से है, अत्यधिक reproducible और एक साथ कई शर्तों का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता, Aβ-फाइब्रिनोजेन अवरोधकों की बड़ी संख्या की स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देता है । इस स्क्रीनिंग से हिट यौगिकों और उनके फाइब्रिन थक्का वास्तुकला SEM का उपयोग करने के Aβ प्रेरित संरचनात्मक विषमताओं को सुधारने की क्षमता के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है । इन अनुकूलित प्रोटोकॉल की प्रभावशीलता यहां TDI-२७६०, एक हाल ही में पहचान Aβ-फाइब्रिनोजेन बातचीत अवरोध करनेवाला का उपयोग कर प्रदर्शन किया है ।

इन विट्रो थक्के (turbidity) परख में, एंजाइम thrombin सट फाइब्रिनोजेन, जिसके परिणामस्वरूप फाइब्रिन नेटवर्क24के गठन में । इस फाइब्रिन थक्का गठन समाधान के माध्यम से गुजर प्रकाश के बिखरने का क?...

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Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

स्पेक्ट्रोस्कोपी और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा फाइब्रिन थक्का संरचना पर β-Amyloid-प्रेरित विषमता का विश्लेषण

यहां प्रस्तुत दो तरीकों कि व्यक्तिगत रूप से या संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है फाइब्रिन थक्का संरचना पर बीटा-amyloid के प्रभाव का विश्लेषण कर रहे हैं । शामिल एक इन विट्रो फाइब्रिन थक्का, थक्का turbidity और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तरीकों के बाद बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल है ।

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

इस प्लेट-आधारित टर्बिडिटी परख का मुख्य लाभ यह है कि यह त्वरित है और कई एमिलॉयड-बीटा फिब्रिनोजेन इंटरैक्शन अवरोधकों को परिष्कृत सेटअप या आवश्यकताओं के बिना एक बार में जांच करने की अनुमति देता है। सिर यौगिकों कि फाइब्रिन टर्बिडिटी परख में है आगे इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग द्वारा विश्लेषण फाइब्रिन थक्के में एक बीटा प्रेरित संरचनात्मक असामान्यता को बहाल करने की क्षमता के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है । इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विश्लेषण को स्कैन करने के लिए थक्का तैयारी का दृश्य प्रदर्शन महत्वपूर्ण है क्योंकि तैयारी में कोई भी भिन्नता प्रायोगिक परिणामों के भीतर विविधताओं में योगदान दे सकती है।यहां इस प्रदर्शन का फोकस ए-बीटा फिब्रिनोजेन इंटरैक्शन पर है । इस प्रोटोकॉल को अन्य प्रोटीन और फाइब्रिन क्लॉट के साथ यौगिकों के साथ अन्य बातचीत का विश्लेषण करने के लिए आसानी से संशोधित किया जा सकता है। प्रत्येक ए-बीटा नकारात्मक 42 युक्त और नियंत्रण कुओं के लिए थक्का गठन बफर के 200 माइक्रोलीटर में ताजा तैयार फाइब्रिनोजन के 1.5 माइक्रोमोलर जोड़कर शुरू करें और कमरे के तापमान पर एक घूर्णन मंच पर प्लेट को इनक्यूबेट करें।30 मिनट के बाद एक साथ ताजा तैयार थ्रोम्बिन समाधान के 30 माइक्रोलीटर सीधे फाइब्रिनोजेन युक्त के केंद्र में थक्का गठन शुरू करने के लिए और तुरंत 350 नैनोमीटर पर इन विट्रो थक्के के अवशोषण को पढ़ने के लिए, 10 मिनट के दौरान हर 30 से 60 सेकंड माप दोहराते हैं। फाइब्रिन क्लॉट संरचना पर ए-बीटा फिब्रिनोजेन इंटरैक्शन अवरोधकों के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, पहले उपयोग से साफ रखने के लिए संदंश, 12 मिलीमीटर सिलिकॉनाइज्ड ग्लास सर्कल कवर स्लिप को 12 अच्छी प्लेट के व्यक्तिगत कुओं में और प्रत्येक कवर स्लिप पर फाइब्रिनोजन के 80 माइक्रोलीटर जोड़ें, धीरे-धीरे समाधान फैलाएं ताकि वे समान रूप से वितरित हों। थक्का गठन शुरू करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से थ्रोम्बिन समाधान के 20 माइक्रोलीटर जोड़ें।कमरे के तापमान पर एक 30 से ६० मिनट इनक्यूबेशन के लिए थाली को कवर करें, फिर धीरे से दो मिनट के लिए बर्फ ठंडे सोडियम cacodylate बफर के दो मिलीलीटर में प्रत्येक थक्का जलमग्न, कवर, कमरे के तापमान पर दो बार, एक मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करने के लिए ध्यान से प्रत्येक धोने के बाद बफर को दूर । आखिरी धोने के बाद कवर स्लिप पर क्लॉट फॉर्मेशन की स्थिति की जांच करें और 30 मिनट के लिए बर्फ पर दो से तीन मिलीलीटर बर्फ-ठंड 2% ग्लूटारल्डिहाइड में थक्के को ठीक करें । इनक्यूबेशन के अंत में, धीरे-धीरे प्रत्येक कुएं से ग्लूटाराल्डिहाइड को हटा दें और बर्फ पर प्रदर्शन के अनुसार ताजा सोडियम कैकोडिलेट बफर के साथ थक्के धोएं।पांच मिनट बर्फ की एक वर्गीकृत श्रृंखला में तय थक्के हाइड्रेट करने के लिए ठंड इथेनॉल पूरी तरह से हवा जोखिम से संरक्षित थक्के रखने के लिए वॉश के बीच इथेनॉल को हटाने के बिना बर्फ पर धोता है । पिछले 100% इथेनॉल धोने के दौरान, कवर स्लिप को एक महत्वपूर्ण बिंदु ड्रायर नमूना धारक में स्थानांतरित करें, प्रत्येक कवर स्लिप के बीच कम से कम 1 वॉशर रखें और धारक को इथेनॉल से भरे एक महत्वपूर्ण बिंदु ड्रायर कक्ष में रखें। एक 30 मिनट सुखाने चक्र के बाद, कार्बन टेप का उपयोग करने के लिए व्यक्तिगत स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्टब्स पर कवर फिसल जाता है माउंट और एक वैक्यूम स्पटर कोटर के स्पटर कोटिंग चैंबर में नमूनों हस्तांतरण ।फिर चार एंग्स्ट्रॉम प्रति सेकंड पर 25 सेकंड के लिए नमूनों पर सोने पैलेडियम या अन्य प्रवाहकीय सामग्री के 20 नैनोमीटर से कम स्पटर कोट और चार किलोवोल्ट में एक प्रकार दो माध्यमिक इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर से लैस एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप पर नमूनों की छवि । फिब्रिन क्लॉट गठन समाधान से गुजरने वाले प्रकाश के बिखरने का कारण बनता है, जिसके परिणामस्वरूप पढ़ने की अवधि के अंत में पठारों में वृद्धि होती है। जब फाइब्रिनोजेन को ए-बीटा 42 की उपस्थिति में इनक्यूबेटेड किया जाता है, तो समाधान की टर्बिडिटी कम हो जाती है जिससे अकेले फाइब्रिनोजेन की लगभग आधी की अधिकतम ऊंचाई तक पहुंच जाती है।ए-बीटा 42 इंटरैक्शन ब्लॉकर की उपस्थिति में बीटा-एमिलॉयड का प्रभाव आमी-लाइमेट होता है और टर्बिडिटी अकेले ए-बीटा के साथ उससे अधिक है। ब्लॉकर का प्रभाव पृष्ठभूमि टर्बिडिटी के कारण दिखाई नहीं देता है क्योंकि ए-बीटा अनुपस्थित होने पर यौगिक फाइब्रिन क्लॉट टर्बिडिटी को नहीं बदलता है। इसके अलावा, जीपीआरपी की उपस्थिति में थक्का गठन, फाइब्रिन बहुलीकरण में हस्तक्षेप करने के लिए जाना जाने वाला पेप्टाइड, अवरोधक की अनुपस्थिति में फाइब्रिन क्लॉट गठन की तुलना में काफी कम टर्बिडिटी को दर्शाता है।थ्रोम्बिन और कैल्शियम क्लोराइड की उपस्थिति में उत्पन्न फाइब्रिनोजेन केवल फाइब्रिन के विस्तारित और इंटरकैलेटेड धागे के साथ-साथ बड़े बंडलों के साथ एक फाइब्रिन जाल बनाते हैं। जब ए-बीटा मौजूद होता है, तो फाइब्रिन धागे समुच्चय में कई चिपचिपा झुरमुट के साथ पतले हो जाते हैं, जो ए-बीटा प्रेरित संरचनात्मक असामान्यताओं का संकेत देते हैं। टर्बिडिटी परख परिणामों के अनुरूप, ए-बीटा फिब्रिनोजेन इंटरैक्शन अवरोधक की उपस्थिति में थक्का गठन आंशिक रूप से ए-बीटा-प्रेरित परिवर्तनों से फाइब्रिन क्लॉट की संरचना को पुनर्स्थापित करता है क्योंकि इस उपचार के साथ कम झुरमुट देखे जाते हैं।क्लॉट टर्बिडिटी परख और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप विश्लेषण प्रोटोकॉल को त्वरित और प्रजनन तरीके से कई ए-बीटा फिब्रिनोजेन इंटरैक्शन अवरोधकों का मूल्यांकन करने के लिए अनुकूलित किया गया है। और जल्द ही डेटा फाइब्रिन क्लॉट गठन के बारे में मूल्यवान जानकारी प्रदान करेगा जिसे विट्रो और वीवो दोनों में आगे के अध्ययनों के लिए लागू किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

विधि कल्पना और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा झिल्ली बातचीत प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

उच्च-रिज़ॉल्यूशन एकल कण विश्लेषण, इलेक्ट्रॉन क्रायो-माइक्रोस्कोपी इमेजिंग स्पैयर का उपयोग करना

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

सेमी स्वचालित के लिए बैक्टीरियल प्रदर्शन पुस्तकालयों के साथ पेप्टाइड समानता एजेंट खोज और परिणामस्वरूप अलग करने का विश्लेषण

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Negative stain electron microscopy (EM) allows relatively simple and quick observation of macromolecules and macromolecular complexes through the use of ...

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गतिशील प्रोटीन परिसरों का विश्लेषण पर इकट्ठे हुए और बायोमास स्पेक्ट्रोमेट्री और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर परत Interferometry से जारी

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Mitochondria और Endoplasmic Reticulum इमेजिंग द्वारा सहसंबंधी प्रकाश और मात्रा इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

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परिपक्व चावल के अनुप्रस्थ विभाजन(Oryza sativa एल.) स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए कर्नेल्स स्थिरीकरण समर्थन के रूप में पिपेट युक्तियाँ का उपयोग कर

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

एकल अणु मछली द्वारा ट्रांसक्रिप्शनल एक्टिव एलील्स का एकल सेल विश्लेषण

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

एकल कण क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी: नमूना से संरचना तक

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Micropatterning ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड पूरे सेल क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी वर्कफ़्लो के भीतर प्रत्यक्ष सेल पोजिशनिंग के लिए

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...