Name: analysis of &#946;-amyloid-induced abnormalities on fibrin clot structure by spectroscopy and scanning electron microscopy
Uploaded: 2018-11-30T14:30:00
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著者は、川崎正憲、和義麻生とトライ機関治療薬探索研究所 (TDI)、a β フィブリノーゲン相互作用阻害剤の合成のためのニューヨークおよび彼らの貴重な提案からマイケル ・ フォーリーをありがとうございます。著者には、役に立つ議論のストリックランド研究室のメンバーもありがとうございました。この作業によって支えられた NIH グラント NS104386、アルツハイマー病の薬発見財団、ロバートソン治療開発基金内接、NIH を与える NS50537、トライ制度治療薬探索研究所アルツハイマー病の薬発見財団ルーディン財団と s. s. のジョン a. ハーマン

1. 分析のため Aβ42 とフィブリノーゲンの準備
<ol><li>凍結乾燥粉末から単量体 Aβ42 を準備します。<ol>
<li>30 1,500 × g で部屋の温度とスピンする Aβ42 パウダーを暖まる s。</li>
		<li>Aβ42 粉末 0.5 mg 当たり冷たい hexafluoroisopropanol (HFIP) の 100 μ L を追加し、氷で 30 分間インキュベートします。 注意: HFIP を処理するときに注意をして、化学のフードのすべての手順を実行します。</li>
		<li>20 μ L ?...

<ol>
	<li>Selkoe, D. J., Schenk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease:+molecular+understanding+predicts+amyloid-based+therapeutics.">Alzheimer's disease: molecular understanding predicts amyloid-based therapeutics.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 43, 545-584 (2003).</li><li>Kurz, A., Perneczky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+clearance+as+a+treatment+target+against+Alzheimer's+disease.">Amyloid clearance as a treatment target against Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 24, 61-73 (2011).</li><li>Benilova, I., Karran, E., De Strooper, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+toxic+Abeta+oligomer+and+Alzheimer's+disease:+an+emperor+in+need+of+clothes.">The toxic Abeta oligomer and Alzheimer's disease: an emperor in need of clothes.</a> Nature Neuroscience. 15 (3), 349-357 (2012).</li><li>Karran, E., Hardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critique+of+the+drug+discovery+and+phase+3+clinical+programs+targeting+the+amyloid+hypothesis+for+Alzheimer+disease.">A critique of the drug discovery and phase 3 clinical programs targeting the amyloid hypothesis for Alzheimer disease.</a> Annals of Neurology. 76 (2), 185-205 (2014).</li><li>Yoshikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+cerebral+blood+flow+in+Alzheimer+disease+and+vascular+dementia.">Heterogeneity of cerebral blood flow in Alzheimer disease and vascular dementia.</a> AJNR, American Journal of Neuroradiology. 24 (7), 1341-1347 (2003).</li><li>Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+will+out:+vascular+contributions+to+Alzheimer's+disease.">Blood will out: vascular contributions to Alzheimer's disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (2), 556-563 (2018).</li><li>Ahn, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease+peptide+beta-amyloid+interacts+with+fibrinogen+and+induces+its+oligomerization.">Alzheimer's disease peptide beta-amyloid interacts with fibrinogen and induces its oligomerization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21812-21817 (2010).</li><li>Zamolodchikov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+structural+analysis+of+the+interaction+between+beta-amyloid+and+fibrinogen.">Biochemical and structural analysis of the interaction between beta-amyloid and fibrinogen.</a> Blood. 128 (8), 1144-1151 (2016).</li><li>Cortes-Canteli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrinogen+and+beta-amyloid+association+alters+thrombosis+and+fibrinolysis:+a+possible+contributing+factor+to+Alzheimer's+disease.">Fibrinogen and beta-amyloid association alters thrombosis and fibrinolysis: a possible contributing factor to Alzheimer's disease.</a> Neuron. 66 (5), 695-709 (2010).</li><li>Cortes-Canteli, M., Mattei, L., Richards, A. T., Norris, E. H., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+deposited+in+the+Alzheimer's+disease+brain+promotes+neuronal+degeneration.">Fibrin deposited in the Alzheimer's disease brain promotes neuronal degeneration.</a> Neurobiology of Aging. 36 (2), 608-617 (2015).</li><li>Liao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+characterization+of+postmortem+amyloid+plaques+isolated+by+laser+capture+microdissection.">Proteomic characterization of postmortem amyloid plaques isolated by laser capture microdissection.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 37061-37068 (2004).</li><li>Zamolodchikov, D., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abeta+delays+fibrin+clot+lysis+by+altering+fibrin+structure+and+attenuating+plasminogen+binding+to+fibrin.">Abeta delays fibrin clot lysis by altering fibrin structure and attenuating plasminogen binding to fibrin.</a> Blood. 119 (14), 3342-3351 (2012).</li><li>Ahn, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Abeta-fibrinogen+interaction+inhibitor+rescues+altered+thrombosis+and+cognitive+decline+in+Alzheimer's+disease+mice.">A novel Abeta-fibrinogen interaction inhibitor rescues altered thrombosis and cognitive decline in Alzheimer's disease mice.</a> The Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1049-1062 (2014).</li><li>Singh, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminopyrimidine+Class+Aggregation+Inhibitor+Effectively+Blocks+Abeta-Fibrinogen+Interaction+and+Abeta-Induced+Contact+System+Activation.">Aminopyrimidine Class Aggregation Inhibitor Effectively Blocks Abeta-Fibrinogen Interaction and Abeta-Induced Contact System Activation.</a> Biochemistry. 57 (8), 1399-1409 (2018).</li><li>Pretorius, E., Mbotwe, S., Bester, J., Robinson, C. J., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+induction+of+anomalous+and+amyloidogenic+blood+clotting+by+molecular+amplification+of+highly+substoichiometric+levels+of+bacterial+lipopolysaccharide.">Acute induction of anomalous and amyloidogenic blood clotting by molecular amplification of highly substoichiometric levels of bacterial lipopolysaccharide.</a> Journal of the Royal Society Interface. 13 (122), (2016).</li><li>Veklich, Y., Francis, C. W., White, J., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+studies+of+fibrinolysis+by+electron+microscopy.">Structural studies of fibrinolysis by electron microscopy.</a> Blood. 92 (12), 4721-4729 (1998).</li><li>Weisel, J. W., Nagaswami, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+modeling+of+fibrin+polymerization+kinetics+correlated+with+electron+microscope+and+turbidity+observations:+clot+structure+and+assembly+are+kinetically+controlled.">Computer modeling of fibrin polymerization kinetics correlated with electron microscope and turbidity observations: clot structure and assembly are kinetically controlled.</a> Biophysical Journal. 63 (1), 111-128 (1992).</li><li>Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+clots+are+equilibrium+polymers+that+can+be+remodeled+without+proteolytic+digestion.">Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion.</a> Scientific Reports. 2, 879 (2012).</li><li>Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+amyloid+beta-peptide+(Abeta)+aggregation+using+the+Congo+red-Abeta+(CR-abeta)+spectrophotometric+assay.">Quantifying amyloid beta-peptide (Abeta) aggregation using the Congo red-Abeta (CR-abeta) spectrophotometric assay.</a> Analytical Biochemistry. 266 (1), 66-76 (1999).</li><li>Zhao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+amyloid+formation+by+turbidity+assay-seeing+through+the+cloud.">Measurement of amyloid formation by turbidity assay-seeing through the cloud.</a> Biophysical Reviews. 8 (4), 445-471 (2016).</li><li>Bester, J., Soma, P., Kell, D. B., Pretorius, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+and+ultrastructural+characteristics+of+whole+blood+and+plasma+in+Alzheimer-type+dementia,+and+the+possible+role+of+bacterial+lipopolysaccharides+(LPS).">Viscoelastic and ultrastructural characteristics of whole blood and plasma in Alzheimer-type dementia, and the possible role of bacterial lipopolysaccharides (LPS).</a> Oncotarget. 6 (34), 35284-35303 (2015).</li><li>Pretorius, E., Page, M. J., Mbotwe, S., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-binding+protein+(LBP)+can+reverse+the+amyloid+state+of+fibrin+seen+or+induced+in+Parkinson's+disease.">Lipopolysaccharide-binding protein (LBP) can reverse the amyloid state of fibrin seen or induced in Parkinson's disease.</a> PLoS One. 13 (3), e0192121 (2018).</li><li>Kell, D. B., Pretorius, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+behaving+badly.+Substoichiometric+molecular+control+and+amplification+of+the+initiation+and+nature+of+amyloid+fibril+formation:+lessons+from+and+for+blood+clotting.">Proteins behaving badly. Substoichiometric molecular control and amplification of the initiation and nature of amyloid fibril formation: lessons from and for blood clotting.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 123, 16-41 (2017).</li><li>Wolberg, A. S., Campbell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombin+generation,+fibrin+clot+formation+and+hemostasis.">Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis.</a> Transfusion and Apheresis Science. 38 (1), 15-23 (2008).</li><li>Soon, A. S., Lee, C. S., Barker, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+fibrin+matrix+properties+via+knob:hole+affinity+interactions+using+peptide-PEG+conjugates.">Modulation of fibrin matrix properties via knob:hole affinity interactions using peptide-PEG conjugates.</a> Biomaterials. 32 (19), 4406-4414 (2011).</li></ol>

ここで説明する方法は、フィブリン血栓形成の in vitro評価の再現性と迅速な手段を提供します。さらに、システムのシンプルさは、フィブリン血栓形成と構造比較的ストレートに a β がどのように影響するかの解釈です。この演習の前の文書で a β フィブリノーゲン相互作用13,14を禁じる機能のための化合物をテストするこれらの試金を使え...

アルツハイマー病 (AD)、高齢患者における認知機能の低下につながる神経変性疾患主に起こる異常な β アミロイド (a β) 式、集計および神経毒性1,の結果障害クリアランスから2。 a β の凝集体と広告3のよ特徴付けられた協会、にもかかわらず病の病理の基礎となる正確なメカニズムの理解4ではありません。証拠が増えている神経血管障害が進行と広告5の重症度の役割を果たすこと a β は直接循環システム6のコンポーネントと対話します。A β フィブリノーゲン7、は8、AD 患者でマウス モデル9,10,11a β 預金も鈍痛と高親和性の相互作用があります。さらに、線溶9,12への抵抗と同様、異常なフィブリン血栓形成と構造、a β フィブリノーゲンの相互作用を誘導します。循環障害、a β とフィブリノゲン13,14間の相互作用を阻害することによって広告の治療 1 つの治療可能性を軽減すること。我々 は、したがって、高スループット スクリーニングと医薬品化学アプローチ13,14a β フィブリノーゲンの相互作用を阻害するいくつかの小さな化合物を識別されます。A β フィブリノーゲン相互作用阻害剤の有効性をテストするためフィブリン血栓形成の in vitro解析の 2 つの方法を最適化: 濁度分析、走査電子顕微鏡 (SEM)14を凝固します。
血栓濁度測定は、紫外可視分光法を用いたフィブリン血栓形成を監視するための単純明快かつ迅速な方法です。フォーム、光はますますフィブリン血栓として散らばっているし、ソリューションの濁度を増加させます。逆に、a β が存在する場合フィブリン血栓の構造を変更すると、および混合物の濁度が減少 (図 1)。A β による異常から血栓の濁度を復元する潜在的な阻害物質の影響を評価できます。濁度測定は、複数の条件の迅速分析できますが、塊形状と構造に関する限定的な情報を提供します。血栓15,16,17,18 3 D アーキテクチャの方法の評価分析を SEM では、電子プローブによってソリッド オブジェクトの形状が明らかになる可能 a β の存在とあるいは阻害化合物は、その構造9,14を変更します。両方の様々 な目的のために使用されている古典的な実験技術は、SEM 分析法、吸光光度法をアミロイド凝集19,20を監視に使用するたとえば。同様に、SEM は、またパーキンソン病や血栓塞栓性脳卒中患者21,22,23アルツハイマー病のプラズマから形成されるフィブリン血栓を分析する使用されます。ここに示すプロトコルは、再現性と迅速な方法でフィブリン血栓形成の評価に最適です。
次のプロトコルは、体外フィブリン-血栓と a β なしの準備のための手順を提供します。また、フィブリン血栓形成と構造の a β の効果を分析する方法の詳細します。TDI-2760、小さな阻害化合物14を使用して a β フィブリノーゲンの相互作用の阻害を測定するためのこれらの 2 つの方法の有効性を示します。これらのメソッドを個別と一緒はフィブリン血栓形成の in vitroの迅速かつ簡単ですが解析できるように。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fibriogen, Plasminogen-Depleted, Plasma</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>341578</td>
			<td>keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-Amyloid (1-42), Human</td>
			<td>Anaspec</td>
			<td>AS-20276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from human plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>105228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTERED</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>C70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Syringe, 0.2&#181;M, 25mm</td>
			<td>Pall</td>
			<td>4612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia.</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLVV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat Bottom</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>21377203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectramax Plus384</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>89212-396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, 5417R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 200 Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>15-337-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Rotator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>2314-1CEQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spare washers for cover slip holder</td>
			<td>Tousimis</td>
			<td>8766-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow Stem Pipets - Sedi-Pet</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>70967-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample holder for CPD (Cover slip holder)</td>
			<td>Tousimis</td>
			<td>8766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mount Holder Box, Pin Type</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>76610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round glass cover slides (12 mm)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>16120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Cacodylate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM Stubs, Tapered end pin.</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>75192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm OD</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16084-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosamdri-815 Critical Point Dryer with Gold/Palladium target</td>
			<td>Tousimis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denton Desk IV Coater</td>
			<td>Denton Vacuum</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leo 1550 FE-SEM</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smart SEM Software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of &#946;-amyloid-induced abnormalities on fibrin clot structure by spectroscopy and scanning electron microscopy

この記事は、体外のフィブリン塊の生成と分光法による β アミロイド (a β) 蛋白が血栓形成と構造に及ぼす影響の分析走査電子顕微鏡 (SEM) の方法を紹介します。アルツハイマー病 (AD) における神経毒性アミロイド凝集体を形成、a β は、フィブリノゲンと対話する示されています。この a β フィブリノーゲン相互作用構造的異常および線溶に強いフィブリン血栓になります。A β によるフィブリン凝固異常などけばけば、AD 病理脳血管側面に貢献するかもしれないまた、炎症だけでなく、脳アミロイドアンギオパチー (CAA)。AD 病理脳血管障害の可能性のある重要な役割を与え、有望な治療上の価値は、抑制したり、a β フィブリノーゲン相互作用を軽減する化合物の開発。どのフィブリンによる血栓形成を簡単かつ体系的に評価する培養方法は、治療化合物の開発の潜在的に有用ツールです。ここに提示すると、a β と β フィブリノーゲンの相互作用阻害剤の効果の解析と同様にフィブリン血栓の生成体外に最適化されたプロトコルです。血栓の濁度測定は急速な再現性の高い、多数 a β フィブリノーゲン阻害剤のスクリーニングを可能にする同時に、複数の条件をテストする使用ことができます。A β による SEM. を使用してフィブリン血栓建築の構造的な異常を改善する能力をこのスクリーニングからヒット化合物をさらに評価できます。これらの最適化されたプロトコルの有効性を TDI-2760、最近同定された a β フィブリノーゲン相互作用阻害剤を使用してここで示します。

体外(濁度) アッセイを凝固、酵素トロンビンは、フィブリノゲン、フィブリン ネットワーク24の形成の結果を裂きます。このフィブリン血栓形成濁り (図 1)、(図 2緑) 読書期間の終わりの前に頭打ちで、その結果、ソリューションを通過する光の散乱が発生します。曲線の約半分の高さの最大値に達...

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Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Β アミロイド誘起分光と電子顕微鏡によるフィブリン血栓構造異常の解析

フィブリン凝固組織に及ぼす β-アミロイドを分析する個別にまたは組み合わせて使用することができます 2 つの方法は、ここで紹介します。続いて、体外フィブリン血栓を作成する血栓濁度及び走査電子顕微鏡法に含まれている、プロトコルです。

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

このプレートベースの濁度アッセイの主な利点は、迅速であり、洗練されたセットアップや要件なしに一度にスクリーニングされるいくつかのアミロイド-βフィブリノーゲン相互作用阻害剤を可能にすることです。フィブリン濁度アッセイにあるヘッド化合物は、走査型電子顕微鏡法で分析したフィブリン血栓中のA-β誘発構造異常を回復させる能力についてさらに評価することができる。スキャン電子顕微鏡分析のための血栓調製の視覚的実証は、製剤の変動が実験結果内の変動に寄与する可能性があるため、極めて重要である。ここでのデモの焦点は、A-ベータフィブリノーゲン相互作用です。このプロトコルは、他のタンパク質およびフィブリン凝固物との化合物との他の相互作用を分析するために容易に変更することができる。まず、200マイクロリットルの血栓形成バッファーに1.5マイクロモルの血栓形成バッファーを含み、制御ウェルを含み、室温で回転プラットフォーム上でプレートをインキュベートします。30分後に同時に30マイクロリットルの新しく調製したトロンビン溶液をフィブリノーゲン含有ウェルの中央に直接加えて血栓形成を開始し、350ナノメートルでインビトロ凝固の吸光度を直ちに読み取り、10分間にわたって30〜60秒ごとに測定を繰り返します。フィブリン血栓構造に対するA-βフィブリノーゲン相互作用阻害剤の効果を評価するために、最初に鉗子を使用して清潔に置き、12ミリメートルのシリコン化ガラスサークルカバーが12ウェルプレートの個々の井戸に滑り込み、各カバースリップに80マイクロリットルのフィブリノーゲンを加え、溶液を均等に広げます。血栓形成を開始するために各ウェルにトロンビン溶液の20マイクロリットルを追加します。プレートを室温で30〜60分間インキュベーションし、各血栓を2ミリリットルの氷冷ナトリウムカコチル酸緩衝液に2分間静かに浸し、室温で2回、1ミリリットルのピペットを使用して洗浄後に慎重にバッファーを取り除きます。最後の洗浄後、カバースリップの血栓形成の状態を確認し、氷冷2%グルタルアルデヒドを氷上で2〜3ミリリットルに30分間固定します。インキュベーションの終わりに、各ウェルからグルタルアルデヒドを静かに取り出し、氷上で実証したように新鮮なカコチル酸ナトリウム緩衝液で血栓を洗います。空気暴露から保護された血栓を維持するために、水の間のエタノールを完全に除去することなく氷上で5分間の氷冷エタノールの水を通して固定された血栓を水和する。最後の100%エタノール洗浄中に、カバースリップを臨界点乾燥機のサンプルホルダーに移し、各カバースリップの間に少なくとも1つの洗濯機を入れ、ホルダーをエタノールで満たされた臨界点乾燥機室に入れます。30分の乾燥サイクルの後、カーボンテープを使用してカバースリップを個々の走査型電子顕微鏡スタブに取り付け、サンプルを真空スパッタコーターのスパッタコーティング室に移します。その後、金パラジウムやその他の導電性材料の20ナノメートル未満のスパッタコートを毎秒4つのオングストロームで25秒間サンプルに塗布し、4キロボルトで2つの二次電子検出器を装備した走査型電子顕微鏡でサンプルを画像化します。フィブリン血栓形成は、溶液を通過する光の散乱を引き起こし、読み取り期間の終わりに高原が増加する濁度をもたらす。フィブリノーゲンがA-β42の存在下でインキュベートされると、溶液の濁度は、フィブリノーゲン単独の約半分の最大高さに達する曲線とともに減少する。A-β 42インタラクションブロッカーの存在下では、β-アミロイドの効果が改善され、濁度はA-β単独でそれよりも高い。化合物は、A-βが存在しない場合にフィブリン血栓濁度を変化しないので、ブロッカーの効果は背景濁りのために現れません。また、GPRPの存在下での血栓形成は、フィブリン重合を妨害することが知られているペプチドであり、阻害剤の不在下でのフィブリン血栓形成と比較して顕著に減少した濁度を示す。トロンビンと塩化カルシウムの存在下で生成されたフィブリノーゲンは、細長く、より大きな束と同様に、フィブリンの糸とインターカラットされた糸を有するフィブリンメッシュを形成するだけである。A-βが存在すると、フィブリン糸は凝集体に複数の粘着性のある塊を有して薄くなり、A-β誘発構造異常を示す。濁度アッセイ結果と一致して、A-βフィブリノーゲン相互作用ブロッカーの存在下での血塊形成は、この処置でより少ない塊が観察されるように、A-β誘発性変化からフィブリン凝固塊の構造を部分的に復元する。血栓濁度アッセイおよび走査型電子顕微鏡分析プロトコルは、いくつかのA-βフィブリノーゲン相互作用阻害剤を迅速かつ再現可能な方法で評価するために最適化されています。そしてすぐにデータは、インビトロとインビボの両方のさらなる研究に適用することができるフィブリン血栓形成に関する貴重な情報を提供します。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

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Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

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