Name: analysis of &#946;-amyloid-induced abnormalities on fibrin clot structure by spectroscopy and scanning electron microscopy
Uploaded: 2018-11-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of ÃŽÂ²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

저자 마사 노리 가와사키가 즈 요 시 아소, 그리고 마이클 폴 리 트라이 기관 치료제 발견 연구소 (TDI), Aβ-fibrinogen 상호 작용 억제제의 합성에 대 한 뉴욕 및 그들의 귀중 한 제안에서 감사합니다. 저자는 또한 유용한 토론에 대 한 스 트 릭 랜드 연구소의 회원을 감사합니다. 이 작품에 의해 지원 되었다 NIH 그랜트 NS104386, 질병의 약물 발견 재단, 그리고 로버트 슨 치료 개발 기금 랭에 대 한 NIH 부여 NS50537, 트라이 기관 치료제 디스커버리 연구소 Alzheimer 약물 발견 재단, Rudin 가족 재단과 S.S.의 존 A. 에르난데스

1. 분석을 위한 Aβ42 및 Fibrinogen의 준비
<ol><li>동결 건조 된 분말에서 단위체 Aβ42 준비<ol>
<li>1500 x g 30에 내려 실내 온도와 회전 Aβ42 분말을 따뜻한 s.</li>
		<li>Aβ42 분말의 0.5 밀리 그램 당 100 µ L의 얼음 hexafluoroisopropanol (HFIP)를 추가 하 고 얼음에 30 분 동안 품 어. 주의: HFIP을 처리할 때 주의 사용 하 고 화학 후드에 있는 모든 단계를 수행.</li>
		<li>20 µ L aliquots 고 영화 공기 건조에 2-3 헤 영화에 ?...

<ol>
	<li>Selkoe, D. J., Schenk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease:+molecular+understanding+predicts+amyloid-based+therapeutics.">Alzheimer's disease: molecular understanding predicts amyloid-based therapeutics.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 43, 545-584 (2003).</li><li>Kurz, A., Perneczky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+clearance+as+a+treatment+target+against+Alzheimer's+disease.">Amyloid clearance as a treatment target against Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 24, 61-73 (2011).</li><li>Benilova, I., Karran, E., De Strooper, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+toxic+Abeta+oligomer+and+Alzheimer's+disease:+an+emperor+in+need+of+clothes.">The toxic Abeta oligomer and Alzheimer's disease: an emperor in need of clothes.</a> Nature Neuroscience. 15 (3), 349-357 (2012).</li><li>Karran, E., Hardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critique+of+the+drug+discovery+and+phase+3+clinical+programs+targeting+the+amyloid+hypothesis+for+Alzheimer+disease.">A critique of the drug discovery and phase 3 clinical programs targeting the amyloid hypothesis for Alzheimer disease.</a> Annals of Neurology. 76 (2), 185-205 (2014).</li><li>Yoshikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+cerebral+blood+flow+in+Alzheimer+disease+and+vascular+dementia.">Heterogeneity of cerebral blood flow in Alzheimer disease and vascular dementia.</a> AJNR, American Journal of Neuroradiology. 24 (7), 1341-1347 (2003).</li><li>Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+will+out:+vascular+contributions+to+Alzheimer's+disease.">Blood will out: vascular contributions to Alzheimer's disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (2), 556-563 (2018).</li><li>Ahn, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease+peptide+beta-amyloid+interacts+with+fibrinogen+and+induces+its+oligomerization.">Alzheimer's disease peptide beta-amyloid interacts with fibrinogen and induces its oligomerization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21812-21817 (2010).</li><li>Zamolodchikov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+structural+analysis+of+the+interaction+between+beta-amyloid+and+fibrinogen.">Biochemical and structural analysis of the interaction between beta-amyloid and fibrinogen.</a> Blood. 128 (8), 1144-1151 (2016).</li><li>Cortes-Canteli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrinogen+and+beta-amyloid+association+alters+thrombosis+and+fibrinolysis:+a+possible+contributing+factor+to+Alzheimer's+disease.">Fibrinogen and beta-amyloid association alters thrombosis and fibrinolysis: a possible contributing factor to Alzheimer's disease.</a> Neuron. 66 (5), 695-709 (2010).</li><li>Cortes-Canteli, M., Mattei, L., Richards, A. T., Norris, E. H., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+deposited+in+the+Alzheimer's+disease+brain+promotes+neuronal+degeneration.">Fibrin deposited in the Alzheimer's disease brain promotes neuronal degeneration.</a> Neurobiology of Aging. 36 (2), 608-617 (2015).</li><li>Liao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+characterization+of+postmortem+amyloid+plaques+isolated+by+laser+capture+microdissection.">Proteomic characterization of postmortem amyloid plaques isolated by laser capture microdissection.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 37061-37068 (2004).</li><li>Zamolodchikov, D., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abeta+delays+fibrin+clot+lysis+by+altering+fibrin+structure+and+attenuating+plasminogen+binding+to+fibrin.">Abeta delays fibrin clot lysis by altering fibrin structure and attenuating plasminogen binding to fibrin.</a> Blood. 119 (14), 3342-3351 (2012).</li><li>Ahn, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Abeta-fibrinogen+interaction+inhibitor+rescues+altered+thrombosis+and+cognitive+decline+in+Alzheimer's+disease+mice.">A novel Abeta-fibrinogen interaction inhibitor rescues altered thrombosis and cognitive decline in Alzheimer's disease mice.</a> The Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1049-1062 (2014).</li><li>Singh, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminopyrimidine+Class+Aggregation+Inhibitor+Effectively+Blocks+Abeta-Fibrinogen+Interaction+and+Abeta-Induced+Contact+System+Activation.">Aminopyrimidine Class Aggregation Inhibitor Effectively Blocks Abeta-Fibrinogen Interaction and Abeta-Induced Contact System Activation.</a> Biochemistry. 57 (8), 1399-1409 (2018).</li><li>Pretorius, E., Mbotwe, S., Bester, J., Robinson, C. J., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+induction+of+anomalous+and+amyloidogenic+blood+clotting+by+molecular+amplification+of+highly+substoichiometric+levels+of+bacterial+lipopolysaccharide.">Acute induction of anomalous and amyloidogenic blood clotting by molecular amplification of highly substoichiometric levels of bacterial lipopolysaccharide.</a> Journal of the Royal Society Interface. 13 (122), (2016).</li><li>Veklich, Y., Francis, C. W., White, J., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+studies+of+fibrinolysis+by+electron+microscopy.">Structural studies of fibrinolysis by electron microscopy.</a> Blood. 92 (12), 4721-4729 (1998).</li><li>Weisel, J. W., Nagaswami, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+modeling+of+fibrin+polymerization+kinetics+correlated+with+electron+microscope+and+turbidity+observations:+clot+structure+and+assembly+are+kinetically+controlled.">Computer modeling of fibrin polymerization kinetics correlated with electron microscope and turbidity observations: clot structure and assembly are kinetically controlled.</a> Biophysical Journal. 63 (1), 111-128 (1992).</li><li>Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+clots+are+equilibrium+polymers+that+can+be+remodeled+without+proteolytic+digestion.">Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion.</a> Scientific Reports. 2, 879 (2012).</li><li>Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+amyloid+beta-peptide+(Abeta)+aggregation+using+the+Congo+red-Abeta+(CR-abeta)+spectrophotometric+assay.">Quantifying amyloid beta-peptide (Abeta) aggregation using the Congo red-Abeta (CR-abeta) spectrophotometric assay.</a> Analytical Biochemistry. 266 (1), 66-76 (1999).</li><li>Zhao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+amyloid+formation+by+turbidity+assay-seeing+through+the+cloud.">Measurement of amyloid formation by turbidity assay-seeing through the cloud.</a> Biophysical Reviews. 8 (4), 445-471 (2016).</li><li>Bester, J., Soma, P., Kell, D. B., Pretorius, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+and+ultrastructural+characteristics+of+whole+blood+and+plasma+in+Alzheimer-type+dementia,+and+the+possible+role+of+bacterial+lipopolysaccharides+(LPS).">Viscoelastic and ultrastructural characteristics of whole blood and plasma in Alzheimer-type dementia, and the possible role of bacterial lipopolysaccharides (LPS).</a> Oncotarget. 6 (34), 35284-35303 (2015).</li><li>Pretorius, E., Page, M. J., Mbotwe, S., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-binding+protein+(LBP)+can+reverse+the+amyloid+state+of+fibrin+seen+or+induced+in+Parkinson's+disease.">Lipopolysaccharide-binding protein (LBP) can reverse the amyloid state of fibrin seen or induced in Parkinson's disease.</a> PLoS One. 13 (3), e0192121 (2018).</li><li>Kell, D. B., Pretorius, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+behaving+badly.+Substoichiometric+molecular+control+and+amplification+of+the+initiation+and+nature+of+amyloid+fibril+formation:+lessons+from+and+for+blood+clotting.">Proteins behaving badly. Substoichiometric molecular control and amplification of the initiation and nature of amyloid fibril formation: lessons from and for blood clotting.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 123, 16-41 (2017).</li><li>Wolberg, A. S., Campbell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombin+generation,+fibrin+clot+formation+and+hemostasis.">Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis.</a> Transfusion and Apheresis Science. 38 (1), 15-23 (2008).</li><li>Soon, A. S., Lee, C. S., Barker, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+fibrin+matrix+properties+via+knob:hole+affinity+interactions+using+peptide-PEG+conjugates.">Modulation of fibrin matrix properties via knob:hole affinity interactions using peptide-PEG conjugates.</a> Biomaterials. 32 (19), 4406-4414 (2011).</li></ol>

여기에 설명 된 방법을 섬유 소 혈전 형성에서 체 외에서평가의 재현성 및 빠른 수단을 제공 합니다. 또한, 시스템의 단순은 섬유 소 혈전 형성 및 구조 상대적으로 곧장 앞으로 미치는 Aβ의 해석. 이 연구소의 이전 게시, 그것은 화합물 Aβ fibrinogen 상호 작용13,14을 억제 하기 위해 그들의 능력에 대 한 테스트를 이러한 분석을 사용할 수 있는 표시 ...

Alzheimer의 질병 (광고), 신경 질환 노인 환자에서 인지 감소에 이어지는 주로 비정상적인 베타-아 밀 로이드 (Aβ) 식, 집계 및 장애인된 클리어런스 neurotoxicity1, 의 결과에서 발생 2. Aβ 집계 및 광고3사이 잘 특징이 협회에도 불구 하 고 근본적인 질병 병 리 정확한 메커니즘은 잘 이해4. 증거를 증가 제안 Aβ6순환 시스템 구성 요소와 직접 상호 작용으로 neurovascular 적자 진행 및 광고5, 심각도에 역할을 재생 합니다. Aβ는 fibrinogen7,8, 또한 광고 환자 및 마우스 모델9,,1011Aβ 예금 localizes와 높은 선호도 상호 작용. 또한, Aβ fibrinogen 상호 작용 fibrinolysis9,12저항 뿐만 아니라 비정상적인 섬유 소 혈전 형성 및 구조, 유도합니다. 광고, 치료 한 치료 가능성 Aβ 및 fibrinogen13,14사이 상호 작용을 억제 함으로써 순환 적자 경감 이다. 우리는, 그러므로, 높은 처리량 검열 및의 약 화학 접근13,14를 사용 하 여 Aβ fibrinogen 상호 작용을 억제 하는 여러 작은 화합물 확인. Aβ-fibrinogen 상호 작용 억제제의 효능을 테스트 하려면 우리 섬유 소 혈전 형성 체 외에서 의 분석을 위한 두 가지 방법을 최적화: 응고 탁도 분석 결과 및 스캐닝 전자 현미경 (SEM)14.
병 탁도 분석 결과 섬유 소 혈전 형성 UV 보이는 분광학을 사용 하 여 모니터링을 위한 스트레이트-앞으로 및 빠른 방법입니다. 섬유 소 혈전으로 형태, 빛은 점점 더 흩어져 하 고 솔루션의 탁도 증가 한다. 반대로, Aβ 있으면, 섬유 소 혈전의 구조 변경 및 혼합물의 탁도 감소 된다 (그림 1). 억제 화합물의 효과 병 탁 Aβ 유도 이상에서 복원 가능성에 대 한 평가 될 수 있습니다. 탁도 분석 결과 여러 조건의 신속한 분석에 대 한 수 있으며, 병 모양 및 구조에 제한 된 정보를 제공 합니다. SEM, 솔리드 객체의 지형 전자 조사에 의해 밝혀 수 응고15,16,,1718 의 3 차원 구조 분석 방법의 평가 대 한 Aβ의 존재와 또는 억제 화합물 그 구조9,14변경 합니다. 두 분석 및 SEM는 다양 한 목적을 위해 사용 된 고전적인 실험실 기술, 예, 분 광 광도 법 녹말 체 집계19,20모니터링을 위해 사용 됩니다. 마찬가지로, SEM 분석 파 킨 슨 병 및 thromboembolic 치기 환자21,,2223Alzheimer, 플라즈마에서 형성 된 섬유 소 병 하도 사용 됩니다. 여기에 제시 된 프로토콜은 재현 하 고 빠른 방식으로 섬유 소 혈전 형성 평가 적합 합니다.
다음 프로토콜 생체 외에서 섬유 소-응고를 모두와 함께 Aβ 없이 준비에 대 한 지침을 제공합니다. 그것은 또한 섬유 소 혈전 형성과 구조에 Aβ의 효과 분석 하는 방법을 자세히 설명 합니다. Aβ-fibrinogen 상호 작용의 억제를 측정 하기 위한이 두 가지 방법의 효과 TDI-2760, 작은 억제 화합물14를 사용 하 여 보여 줍니다. 이 방법을 개별적으로 함께, 섬유 소 혈전 형성 체 외에서 의 신속 하 고 간단 분석 허용.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fibriogen, Plasminogen-Depleted, Plasma</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>341578</td>
			<td>keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-Amyloid (1-42), Human</td>
			<td>Anaspec</td>
			<td>AS-20276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from human plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>105228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTERED</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>C70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Syringe, 0.2&#181;M, 25mm</td>
			<td>Pall</td>
			<td>4612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia.</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLVV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat Bottom</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>21377203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectramax Plus384</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>89212-396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, 5417R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 200 Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>15-337-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Rotator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>2314-1CEQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spare washers for cover slip holder</td>
			<td>Tousimis</td>
			<td>8766-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow Stem Pipets - Sedi-Pet</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>70967-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample holder for CPD (Cover slip holder)</td>
			<td>Tousimis</td>
			<td>8766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mount Holder Box, Pin Type</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>76610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round glass cover slides (12 mm)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>16120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Cacodylate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM Stubs, Tapered end pin.</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>75192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm OD</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16084-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosamdri-815 Critical Point Dryer with Gold/Palladium target</td>
			<td>Tousimis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denton Desk IV Coater</td>
			<td>Denton Vacuum</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leo 1550 FE-SEM</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smart SEM Software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of &#946;-amyloid-induced abnormalities on fibrin clot structure by spectroscopy and scanning electron microscopy

이 문서는 체 외 섬유 소 혈전 생성 및 분석 하 여 응고 형성 및 구조에 베타-아 밀 로이드 (Aβ) 단백질의 효과 분석 하 고 스캐닝 전자 현미경 (SEM)에 대 한 방법을 선물 한다. Aβ, Alzheimer의 질병 (광고)에서 신경 녹말 체 집계를 형성, fibrinogen 상호 작용을 보였다. 이 Aβ fibrinogen 상호 작용 구조적으로 비정상적인 fibrinolysis에 저항 하 고 섬유 소 혈전을 만든다. 섬유 소는 혈액 응고에 이상이 Aβ 유도 또한 microinfarcts, 같은 광고 병 리의 뇌혈관 측면에 기여할 수 있습니다 염증, 뿐만 아니라, 대뇌 아 밀 로이드 angiopathy (CAA). 광고 병리학 neurovascular 적자의 잠재적으로 중요 한 역할을 감안할 때, 유망한 치료 가치는 억제 또는 Aβ fibrinogen 상호 작용을 줄일 수 있는 화합물을 개발. 생체 외에서 메서드는 섬유 소에 의해 응고 형성 평가 될 수 있다 쉽고 체계적으로 치료 화합물 개발을 위한 잠재적으로 유용한 도구입니다. 여기는 섬유 소 혈전의 생성 생체 외에서 Aβ 및 Aβ fibrinogen 상호 작용 억제제의 효과의 분석에 대 한 최적화 된 프로토콜이입니다. 병 탁도 분석 결과 신속 하 고 매우 재현 이며 Aβ fibrinogen 억제제의 다 수의 심사에 대 한 수 있도록 여러 조건을 동시에, 테스트를 사용할 수 있습니다. 이 심사에서 히트 화합물 더 SEM.를 사용 하 여 섬유 소 혈전 아키텍처의 구조 이상 Aβ 유도 개량 하는 능력에 대 한 평가 이러한 최적화 된 프로토콜의 효과 TDI-2760, 최근 확인 된 Aβ fibrinogen 상호 작용 억제제를 사용 하 여 여기 보여 줍니다.

시험관에 응고 (탁도) 분석 결과, 효소 트 롬 빈 섬유 소 네트워크24의 형성의 결과로 fibrinogen 앞. 이 섬유 소 혈전 형성 증가 탁도 (그림 1), (그림 2, 그린) 독서 기간의 끝 전에 頭 打 ち 상태에 따른 해결책을 통과 하는 빛의 산란을 발생 합니다. fibrinogen Aβ42의 알을 품는, 솔루션의 탁도 감소, 약 절반의 ?...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of ÃŽÂ²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

분광학 그리고 스캐닝 전자 현미경 검사 법에 의해 섬유 소 혈전 구조에 β 아 밀 로이드 유도 비정상의 분석

여기에 제시 된 분석 섬유 소 혈전 구조에 베타-아 밀 로이드의 효과 개별적으로 또는 조합에서 사용할 수 있는 두 가지 방법이 있습니다. 생체 외에서 섬유 소 혈전, 만드는 뒤에 병 탁도 및 스캐닝 전자 현미경 검사 법 방법 포함 된 프로토콜이입니다.

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

이 플레이트 기반 탁도 분석의 주요 장점은 빠르며 정교한 설정이나 요구 사항없이 여러 아밀로이드 베타 피브리노겐 상호 작용 억제제를 한 번에 선별 할 수 있다는 것입니다. 피브린 탁도 분석에 있는 헤드 화합물은 전자 현미경 검사를 스캔하여 분석된 피브린 혈전에서 A-베타 유도 된 구조적 이상을 복원하는 능력에 대해 더욱 평가될 수 있다. 전자 현미경 분석을 스캔하기 위한 혈전 제제의 시각적 데모는 제제의 모든 변화가 실험 결과 내의 변화에 기여할 수 있기 때문에 매우 중요합니다.이 데모의 초점은 A-베타 피브리노겐 상호 작용에 있습니다. 이 프로토콜은 다른 단백질및 피브린 응고와의 화합물과의 다른 상호 작용을 분석하기 위해 쉽게 변형될 수 있다. 먼저 200마이크로리터의 응고 형성 버퍼에 갓 준비된 피브리노겐 1.5 마이크로몰라를 각 A-베타 네거티브(42)에 첨가하여 우물을 포함하고 제어하고 실온에서 회전 플랫폼에서 플레이트를 배양한다.30분 후, 30분 동안 새로 준비된 트롬빈 용액 30마이크로리터를 피브리노겐 함유 의 중앙에 직접 추가하여 혈전 형성을 시작하고 즉시 350나노미터에서 체외 혈전의 흡수를 판독하여 10분 동안 30~60초마다 측정을 반복합니다. 피브린 응고 구조에 대한 A-베타 피브리노겐 상호 작용 억제제의 효과를 평가하기 위해 먼저 집게를 사용하여 12웰 플레이트의 개별 우물에 12mm 실리콘 유리 원 덮개 를 넣고 80 마이크로리터의 피브리노겐을 각 커버 슬립에 부드럽게 추가하여 용액을 균등하게 분산시합니다. 혈전 형성을 시작하기 위해 각 웰에 20 마이크로리터의 혈전 용액을 추가합니다.실온에서 30~60분 동안 배양한 다음, 각 응고를 2밀리리터의 얼음냉나트륨 소염 버퍼에 2밀리리터로 부드럽게 담근 다음, 실온에서 두 번, 1밀리리터 파이펫을 사용하여 각 세척 후 버퍼를 조심스럽게 제거합니다. 마지막 세척 후, 커버 슬립에 응고 형성의 상태를 확인하고 30 분 동안 얼음에 얼음 차가운 2 % 글루타랄데히드의 2 ~ 3 밀리리터에 혈전을 수정합니다. 인큐베이션이 끝나면 각 우물에서 글루타랄데히드를 부드럽게 제거하고 얼음위에서 보여준 것처럼 신선한 나트륨 캐코디레이트 버퍼로 혈전을 씻습니다.공기 노출로부터 응고를 보호하기 위해 워시 사이에 에탄올을 완전히 제거하지 않고 얼음 에탄올을 완전히 제거하지 않고 얼음에 5분 짜리 얼음 차가운 에탄올 의 등급 시리즈에서 고정 된 혈전을 수화한다. 마지막 100% 에탄올 세척 중에 커버 슬립을 임계 점 건조기 샘플 홀더로 옮기고 각 커버 슬립 사이에 적어도 1 개의 와셔를 배치하고 홀더를 에탄올로 채워진 임계 점 건조기 챔버에 놓습니다. 30분간의 건조 주기 후에는 카본 테이프를 사용하여 개별 스캐닝 전자 현미경 스텁에 커버 슬립을 장착하고 샘플을 진공 스퍼터 코팅 소터의 스퍼터 코팅 챔버로 옮기십시오.그런 다음 초당 4개의 협스트롬에서 25초 동안 20나노미터 미만의 금 팔라듐 또는 기타 전도성 물질에 스퍼터 코트를 코팅하고 4킬로볼트에서 2형 이차 전자 검출기를 장착한 스캐닝 전자 현미경의 샘플을 이미지화한다. 피브린 응고 형성은 용액을 통과하는 빛의 산란을 일으켜 판독 기간이 끝날 때 고원도가 증가합니다. Fibrinogen이 A-베타(42)의 존재에서 배양되면 용액의 탁도가 감소하며 곡선은 피브리노겐의 약 절반높이에 도달한다.A-베타 42 상호 작용 차단제의 존재에서 베타 아밀로이드의 효과는 개량되고 탁도는 혼자 A-베타와 그보다 높다. 차단기의 효과는 A-베타가 없을 때 화합물이 피브린 응고 탁도를 변경하지 않기 때문에 배경 탁도로 인해 나타나지 않습니다. 또한, 피브린 중합화를 방해하는 것으로 알려진 펩티드인 GPRP의 존재내 응고 형성은 억제제의 부재 시 피브린 응고 형성에 비해 현저히 감소된 탁도를 나타낸다.혈전과 염화칼슘이 존재하여 생성된 피브리노겐은 피브린의 길쭉하고 상호 연관된 실과 더 큰 번들로만 피브린 메쉬를 형성합니다. A-베타가 존재할 때, 피브린 스레드는 골재에 여러 끈적끈적한 덩어리로 얇아졌고, 이는 A-베타 유도된 구조적 이상을 나타냅니다. 탁도 분석 결과와 일치하여, A-베타 피브리노겐 상호 작용 차단제의 존재내 응고 형성은 이 치료법으로 더 적은 덩어리가 관찰됨에 따라 A-베타 유도 된 변화로부터 피브린 응고의 구조를 부분적으로 복원한다.응고 탁도 분석 및 스캐닝 전자 현미경 분석 프로토콜은 여러 A-베타 피브리노겐 상호 작용 억제제를 빠르고 재현 가능한 방식으로 평가하기 위해 최적화되었습니다. 그리고 곧 데이터는 시험관 내 및 생체 내 의 추가 연구에 적용 될 수있는 피브린 응고 형성에 대한 귀중한 정보를 제공 할 것입니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

방법은 시각화 및 투과 전자 현미경에 의해 막 상호 작용하는 단백질을 분석하는

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

연구

생화학

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

SPHIRE를 사용한 전자 저온 현미경 이미지의 고해상도 단일 입자 분석

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

펩 티 드 선호도 시 약 검색 및 분석 결과 분리의 세균성 디스플레이 라이브러리의 반자동된 Biopanning

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems

유사에 부정적인 얼룩 전자 현미경 검사 법 방법: 시스템에 도전 하는 태 클을 위한 도구

Negative stain electron microscopy (EM) allows relatively simple and quick observation of macromolecules and macromolecular complexes through the use of ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

동적 단백질 복합물 분석에 조립 하 고 질량 분석 및 전자 현미경을 사용 하 여 Biolayer 간섭계 바이오 센서에서 발표

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

미토콘드리아 및 코피포지티컬 라이트 및 부피 전자 현미경에 의한 산후성 망상 이미징

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

성숙한 쌀의 횡단 단면(오리자 사티 라 L.) 파이펫 팁을 사용하여 전자 현미경 이미징을 스캐닝하기 위한 커널

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

단일 분자 물고기에 의한 전사 활성 알레일의 단일 세포 분석

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

단일 입자 저온 전자 현미경 검사법: 샘플에서 구조로

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

전세포 극저온-전자 단층 촬영 워크플로우 내의 직접 세포 위치지정에 마이크로패턴 전송 전자 현미경 검사기 그리드

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...