Name: analysis of &#946;-amyloid-induced abnormalities on fibrin clot structure by spectroscopy and scanning electron microscopy
Uploaded: 2018-11-30T14:30:00
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Autores agradecer Masanori Kawasaki, Kazuyoshi Aso e Michael Foley de Tri-institucional Therapeutics Discovery Institute (TDI), Nova York para a síntese dos inibidores de interação Aβ-fibrinogênio e suas valiosas sugestões. Os autores também agradecer membros do laboratório Strickland para discussão útil. Este trabalho foi financiado pelo NIH grant NS104386, Drug Discovery Foundation do Alzheimer e fundo de desenvolvimento terapêutico Robertson para H.A., NIH conceder NS50537, Tri-institucional Therapeutics Discovery Institute, Alzheimer Drug Discovery Foundation, Fundação da família de Rudin e John A. Herrmann para S.S.

1. preparação de Aβ42 e fibrinogênio para análise
<ol><li>Preparar Aβ42 monomérica de pó liofilizado<ol>
<li>Aquecer Aβ42 pó a temperatura ambiente e rotação para baixo a 1.500 x g, durante 30 s.</li>
		<li>Adicionar 100 µ l de gelado hexafluoroisopropanol (HFIP) por 0,5 mg de pó de Aβ42 e incube por 30 min no gelo. Cuidado: Tenha cuidado ao manusear HFIP e executar todas as etapas em uma capa de química.</li>
		<li>Preparar 20 alíquotas µ l e deixe o que ar seco em uma capa química para 2-3 h. fi...

<ol>
	<li>Selkoe, D. J., Schenk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease:+molecular+understanding+predicts+amyloid-based+therapeutics.">Alzheimer's disease: molecular understanding predicts amyloid-based therapeutics.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 43, 545-584 (2003).</li><li>Kurz, A., Perneczky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+clearance+as+a+treatment+target+against+Alzheimer's+disease.">Amyloid clearance as a treatment target against Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 24, 61-73 (2011).</li><li>Benilova, I., Karran, E., De Strooper, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+toxic+Abeta+oligomer+and+Alzheimer's+disease:+an+emperor+in+need+of+clothes.">The toxic Abeta oligomer and Alzheimer's disease: an emperor in need of clothes.</a> Nature Neuroscience. 15 (3), 349-357 (2012).</li><li>Karran, E., Hardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critique+of+the+drug+discovery+and+phase+3+clinical+programs+targeting+the+amyloid+hypothesis+for+Alzheimer+disease.">A critique of the drug discovery and phase 3 clinical programs targeting the amyloid hypothesis for Alzheimer disease.</a> Annals of Neurology. 76 (2), 185-205 (2014).</li><li>Yoshikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+cerebral+blood+flow+in+Alzheimer+disease+and+vascular+dementia.">Heterogeneity of cerebral blood flow in Alzheimer disease and vascular dementia.</a> AJNR, American Journal of Neuroradiology. 24 (7), 1341-1347 (2003).</li><li>Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+will+out:+vascular+contributions+to+Alzheimer's+disease.">Blood will out: vascular contributions to Alzheimer's disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (2), 556-563 (2018).</li><li>Ahn, H. 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T., Norris, E. H., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+deposited+in+the+Alzheimer's+disease+brain+promotes+neuronal+degeneration.">Fibrin deposited in the Alzheimer's disease brain promotes neuronal degeneration.</a> Neurobiology of Aging. 36 (2), 608-617 (2015).</li><li>Liao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+characterization+of+postmortem+amyloid+plaques+isolated+by+laser+capture+microdissection.">Proteomic characterization of postmortem amyloid plaques isolated by laser capture microdissection.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 37061-37068 (2004).</li><li>Zamolodchikov, D., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abeta+delays+fibrin+clot+lysis+by+altering+fibrin+structure+and+attenuating+plasminogen+binding+to+fibrin.">Abeta delays fibrin clot lysis by altering fibrin structure and attenuating plasminogen binding to fibrin.</a> Blood. 119 (14), 3342-3351 (2012).</li><li>Ahn, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Abeta-fibrinogen+interaction+inhibitor+rescues+altered+thrombosis+and+cognitive+decline+in+Alzheimer's+disease+mice.">A novel Abeta-fibrinogen interaction inhibitor rescues altered thrombosis and cognitive decline in Alzheimer's disease mice.</a> The Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1049-1062 (2014).</li><li>Singh, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminopyrimidine+Class+Aggregation+Inhibitor+Effectively+Blocks+Abeta-Fibrinogen+Interaction+and+Abeta-Induced+Contact+System+Activation.">Aminopyrimidine Class Aggregation Inhibitor Effectively Blocks Abeta-Fibrinogen Interaction and Abeta-Induced Contact System Activation.</a> Biochemistry. 57 (8), 1399-1409 (2018).</li><li>Pretorius, E., Mbotwe, S., Bester, J., Robinson, C. J., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+induction+of+anomalous+and+amyloidogenic+blood+clotting+by+molecular+amplification+of+highly+substoichiometric+levels+of+bacterial+lipopolysaccharide.">Acute induction of anomalous and amyloidogenic blood clotting by molecular amplification of highly substoichiometric levels of bacterial lipopolysaccharide.</a> Journal of the Royal Society Interface. 13 (122), (2016).</li><li>Veklich, Y., Francis, C. W., White, J., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+studies+of+fibrinolysis+by+electron+microscopy.">Structural studies of fibrinolysis by electron microscopy.</a> Blood. 92 (12), 4721-4729 (1998).</li><li>Weisel, J. W., Nagaswami, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+modeling+of+fibrin+polymerization+kinetics+correlated+with+electron+microscope+and+turbidity+observations:+clot+structure+and+assembly+are+kinetically+controlled.">Computer modeling of fibrin polymerization kinetics correlated with electron microscope and turbidity observations: clot structure and assembly are kinetically controlled.</a> Biophysical Journal. 63 (1), 111-128 (1992).</li><li>Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+clots+are+equilibrium+polymers+that+can+be+remodeled+without+proteolytic+digestion.">Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion.</a> Scientific Reports. 2, 879 (2012).</li><li>Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+amyloid+beta-peptide+(Abeta)+aggregation+using+the+Congo+red-Abeta+(CR-abeta)+spectrophotometric+assay.">Quantifying amyloid beta-peptide (Abeta) aggregation using the Congo red-Abeta (CR-abeta) spectrophotometric assay.</a> Analytical Biochemistry. 266 (1), 66-76 (1999).</li><li>Zhao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+amyloid+formation+by+turbidity+assay-seeing+through+the+cloud.">Measurement of amyloid formation by turbidity assay-seeing through the cloud.</a> Biophysical Reviews. 8 (4), 445-471 (2016).</li><li>Bester, J., Soma, P., Kell, D. B., Pretorius, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+and+ultrastructural+characteristics+of+whole+blood+and+plasma+in+Alzheimer-type+dementia,+and+the+possible+role+of+bacterial+lipopolysaccharides+(LPS).">Viscoelastic and ultrastructural characteristics of whole blood and plasma in Alzheimer-type dementia, and the possible role of bacterial lipopolysaccharides (LPS).</a> Oncotarget. 6 (34), 35284-35303 (2015).</li><li>Pretorius, E., Page, M. J., Mbotwe, S., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-binding+protein+(LBP)+can+reverse+the+amyloid+state+of+fibrin+seen+or+induced+in+Parkinson's+disease.">Lipopolysaccharide-binding protein (LBP) can reverse the amyloid state of fibrin seen or induced in Parkinson's disease.</a> PLoS One. 13 (3), e0192121 (2018).</li><li>Kell, D. B., Pretorius, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+behaving+badly.+Substoichiometric+molecular+control+and+amplification+of+the+initiation+and+nature+of+amyloid+fibril+formation:+lessons+from+and+for+blood+clotting.">Proteins behaving badly. Substoichiometric molecular control and amplification of the initiation and nature of amyloid fibril formation: lessons from and for blood clotting.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 123, 16-41 (2017).</li><li>Wolberg, A. S., Campbell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombin+generation,+fibrin+clot+formation+and+hemostasis.">Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis.</a> Transfusion and Apheresis Science. 38 (1), 15-23 (2008).</li><li>Soon, A. S., Lee, C. S., Barker, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+fibrin+matrix+properties+via+knob:hole+affinity+interactions+using+peptide-PEG+conjugates.">Modulation of fibrin matrix properties via knob:hole affinity interactions using peptide-PEG conjugates.</a> Biomaterials. 32 (19), 4406-4414 (2011).</li></ol>

Os métodos descritos aqui fornecem um meio rápido e reprodutível de avaliação fibrina coágulo formação em vitro. Além disso, a simplicidade do sistema torna a interpretação de como Aβ afeta a formação do coágulo de fibrina e estrutura relativamente simples e direta. Na publicação anterior deste laboratório, foi mostrado que estes ensaios podem ser usados para testar compostos por sua capacidade de inibir a interação de Aβ-fibrinogênio13,1...

A doença de Alzheimer (AD), uma doença neurodegenerativa, levando ao declínio cognitivo em pacientes idosos, predominantemente decorre anormal expressão de beta-amiloide (Aβ), agregação e liberação prejudicada, resultando em neurotoxicidade1, 2. apesar da associação bem caracterizada entre agregados Aβ e AD3, os mecanismos precisos subjacentes a patologia da doença não são bem compreendidas4. Aumentando a evidência sugere que os défices neurovascular desempenham um papel na progressão e gravidade da AD5, como Aβ interage diretamente com os componentes do sistema circulatório6. Aβ tem uma interação de alta afinidade com fibrinogênio7,8, que localiza também aos depósitos Aβ em pacientes AD e rato modelos9,10,11. Além disso, a interação de Aβ-fibrinogênio induz a formação do coágulo de fibrina anormal e estrutura, bem como resistência a fibrinólise9,12. Uma possibilidade terapêutica no tratamento de AD, está aliviando o déficit circulatório, inibindo a interação entre Aβ e fibrinogênio13,14. Nós, portanto, identificamos vários pequenos compostos, inibindo a interação de Aβ-fibrinogênio usando alto throughput triagem e química medicinal abordagens13,14. Para testar a eficácia de inibidores de interação Aβ-fibrinogênio, nós aperfeiçoamos a dois métodos de análise de em vitro formação de coágulos de fibrina: coagular ensaio de turbidez e digitalização de microscopia eletrônica de varredura (MEV)14.
Ensaio de turbidez de coágulo é um método direto e rápido para monitorar a formação de coágulos de fibrina usando espectroscopia UV-visível. Como o coágulo de fibrina, formas, luz é cada vez mais dispersos e a turbidez da solução aumenta. Inversamente, quando Aβ está presente, a estrutura do coágulo de fibrina é alterada, e a turvação da mistura é reduzida (Figura 1). O efeito inibitório compostos pode ser avaliado para o potencial de restaurar o coágulo turbidez de anormalidades Aβ-induzida. Enquanto o ensaio de turbidez permite análise rápida de várias condições, fornece informações limitadas sobre a forma de coágulo e estrutura. SEM, em que a topografia de objetos sólidos é revelada pela sonda de elétron, permite a análise da arquitetura 3D do coágulo16,15,17,18 e a avaliação de como a presença de Aβ e / ou compostos inibitórios altera essa estrutura9,14. Tanto espectrometria e SEM são técnicas clássicas de laboratório que foram usadas para diversos fins, por exemplo, espectrofotometria usada para monitorar a agregação amiloide19,20. Da mesma forma, SEM também é usado para analisar o coágulo de fibrina formado a partir do plasma do Alzheimer, Parkinson e AVC tromboembólico pacientes21,22,23. Os protocolos aqui apresentados são otimizados para avaliar a formação do coágulo de fibrina de forma rápida e reprodutível.
O protocolo seguinte fornece as instruções para a preparação de um em vitro -coágulo de fibrina com e sem Aβ. Ele também detalha os métodos para analisar o efeito de Aβ na formação do coágulo de fibrina e estrutura. A eficácia destes dois métodos para medir a inibição da interação Aβ-fibrinogênio é demonstrada usando TDI-2760, um pequeno compostos inibitórios14. Esses métodos, tanto individualmente e em conjunto, permitem uma análise rápida e simples de em vitro formação de coágulos de fibrina.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fibriogen, Plasminogen-Depleted, Plasma</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>341578</td>
			<td>keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-Amyloid (1-42), Human</td>
			<td>Anaspec</td>
			<td>AS-20276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from human plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>105228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTERED</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>C70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Syringe, 0.2&#181;M, 25mm</td>
			<td>Pall</td>
			<td>4612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia.</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLVV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat Bottom</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>21377203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectramax Plus384</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>89212-396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, 5417R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 200 Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>15-337-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Rotator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>2314-1CEQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spare washers for cover slip holder</td>
			<td>Tousimis</td>
			<td>8766-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow Stem Pipets - Sedi-Pet</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>70967-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample holder for CPD (Cover slip holder)</td>
			<td>Tousimis</td>
			<td>8766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mount Holder Box, Pin Type</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>76610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round glass cover slides (12 mm)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>16120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Cacodylate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM Stubs, Tapered end pin.</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>75192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm OD</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16084-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosamdri-815 Critical Point Dryer with Gold/Palladium target</td>
			<td>Tousimis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denton Desk IV Coater</td>
			<td>Denton Vacuum</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leo 1550 FE-SEM</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smart SEM Software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of &#946;-amyloid-induced abnormalities on fibrin clot structure by spectroscopy and scanning electron microscopy

Este artigo apresenta métodos para gerar coágulos de fibrina em vitro e analisando o efeito da proteína de beta-amiloide (Aβ) na formação de coágulos e estrutura por espectrometria e microscopia eletrônica (SEM). Aβ, que forma neurotóxicos agregados amiloides na doença de Alzheimer (AD), foi mostrado para interagir com o fibrinogênio. Essa interação de Aβ-fibrinogênio faz o coágulo de fibrina estruturalmente anormal e resistente a fibrinólise. Induzida por aβ anormalidades na coagulação fibrina também podem contribuir para aspectos cerebrovasculares da patologia AD tais como microinfarcts, inflamação, bem como, Angiopatia amiloide cerebral (CAA). Dado o papel potencialmente crítico dos défices neurovasculares na patologia AD, desenvolvimento de compostos que podem inibir ou diminuir a interação de Aβ-fibrinogênio tem valor terapêutico promissor. Métodos in vitro pelo qual fibrina formação do coágulo pode ser facilmente e sistematicamente avaliada são potencialmente úteis ferramentas para o desenvolvimento de compostos terapêuticos. Apresentado aqui é um protocolo otimizado para in vitro geração do coágulo de fibrina, bem como a análise do efeito dos inibidores de interação Aβ e Aβ-fibrinogênio. O ensaio de turbidez do coágulo é rápida, altamente reprodutível e pode ser usado para testar várias condições simultaneamente, permitindo a seleção de um grande número de inibidores de Aβ-fibrinogênio. Sucesso compostos desta seleção podem ser mais avaliados por sua capacidade de amenizar induzida por Aβ anormalidades estruturais da arquitetura do coágulo de fibrina usando SEM. A eficácia destes protocolos otimizado é demonstrada aqui usando TDI-2760, um inibidor de interação de Aβ-fibrinogênio recentemente identificado.

No em vitro ensaio (turbidez) de coagulação, a trombina enzima cliva fibrinogênio, resultando na formação do fibrina rede24. Esta formação do coágulo de fibrina provoca a dispersão da luz que passa através da solução, resultando em maior turbidez (Figura 1), platô antes do final do período de leitura (Figura 2, verde). Quando o fibrinogênio foi incubado na presença de Aβ42, diminu...

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Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Análise de β-amiloide-induzida de anormalidades na estrutura do coágulo de fibrina por espectroscopia e microscopia eletrônica

Aqui apresentados são dois métodos que podem ser usados individualmente ou em combinação para analisar o efeito da beta-amiloide na estrutura do coágulo de fibrina. Incluído é um protocolo para criar um em vitro coágulo de fibrina, seguido pelo coágulo turbidez e microscopia eletrônica métodos.

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

A principal vantagem deste ensaio de turbidez à base de placa é que ele é rápido e permite que vários inibidores de interação fibrinogen amilóide-beta sejam examinados de uma só vez sem configuração ou requisitos sofisticados. Os compostos da cabeça que estão no ensaio de turbidez fibrina podem ser ainda mais avaliados por sua capacidade de restaurar a anormalidade estrutural induzida por A-beta nos coágulos fibrinos analisados pela microscopia eletrônica de varredura. A demonstração visual da preparação do coágulo para a análise de microscopia eletrônica de varredura é fundamental, pois quaisquer variações na preparação podem contribuir para variações dentro dos resultados experimentais.O foco desta demonstração aqui é nas interações de fibrinogênio A-beta. Este protocolo pode ser facilmente modificado para analisar outras interações com outras proteínas e os compostos com o coágulo de fibrina. Comece adicionando 1,5 micromolar de fibrinogênio recém-preparado em 200 microliters de buffer de formação de coágulos a cada A-beta negativo 42 contendo e controlando poços e incubando a placa em uma plataforma rotativa à temperatura ambiente.Após 30 minutos, adicione simultaneamente 30 microliters de solução de trombina recém-preparada diretamente no centro do poço contendo fibrinogênio para iniciar a formação de coágulos e leia imediatamente a absorvência dos coágulos in vitro em 350 nanômetros, repetindo a medição a cada 30 a 60 segundos ao longo de 10 minutos. Para avaliar o efeito dos inibidores de interação fibrinogênio A-beta na estrutura do coágulo de fibrina, primeiro use fórceps para colocar a tampa limpa e de 12 milímetros do círculo de vidro siliconado desliza para poços individuais de uma placa de 12 poços e adicione 80 microlitros de fibrinogênio em cada deslizamento de cobertura, espalhando suavemente a solução para que sejam distribuídos uniformemente. Adicione 20 microliters de solução de trombina a cada poço para iniciar a formação de coágulos.Cubra a placa para uma incubação de 30 a 60 minutos à temperatura ambiente, em seguida, submerga suavemente cada coágulo em dois mililitros de tampão de cacodilato de sódio gelado por dois minutos, coberto, à temperatura ambiente duas vezes, usando uma pipeta de um mililitro para remover cuidadosamente o tampão após cada lavagem. Após a última lavagem, verifique o estado da formação do coágulo no deslizamento da tampa e fixe os coágulos em dois a três mililitros de glutaraldeído gelado de 2%no gelo por 30 minutos. No final da incubação, remova suavemente o glutaraldeído de cada poço e lave os coágulos com tampão de cacodilato de sódio fresco, como demonstrado no gelo.Para hidratar os coágulos fixos em uma série de cinco minutos de etanol gelado lava no gelo sem remover completamente o etanol entre as lavagens para manter os coágulos protegidos da exposição ao ar. Durante a última lavagem de 100% do etanol, transfira a tampa para um suporte de amostra de secador de ponto crítico, colocando pelo menos 1 arruela entre cada deslizamento de cobertura e coloque o suporte em uma câmara de secador de ponto crítico cheia de etanol. Após um ciclo de secagem de 30 minutos, use fita de carbono para montar os deslizamentos de cobertura em microscopia eletrônica de varredura individual e transfira as amostras para a câmara de revestimento de sputter de um revestimento de sputter a vácuo.Em seguida, sputter casaco menos de 20 nanômetros de paládio de ouro ou outros materiais condutores nas amostras por 25 segundos a quatro angstroms por segundo e imagem as amostras em um microscópio eletrônico de varredura equipado com um detector de elétrons secundário tipo dois em quatro quilovolts. A formação de coágulos fibrinos causa dispersão da luz que passa pela solução, resultando em um aumento da turbidez que se nivela no final do período de leitura. Quando o fibrinogênio é incubado na presença de A-beta 42 a turbidez da solução diminui com a curva atingindo uma altura máxima de aproximadamente metade da de fibrinogênio sozinho.Na presença de um bloqueador de interação A-beta 42 o efeito do beta-amilóide é amenizado e a turbidez é maior do que a do A-beta sozinho. O efeito do bloqueador não aparece devido à turbidez de fundo, pois o composto não altera a turbidez do coágulo fibrino quando o A-beta está ausente. Além disso, a formação de coágulos na presença de GPRP, um peptídeo conhecido por interferir na polimerização de fibrinas, demonstra uma turbidez significativamente reduzida em comparação com a formação de coágulos de fibrina na ausência do inibidor.Fibrinogen gerado na presença de trombina e cloreto de cálcio formam apenas uma malha de fibrina com fios alongados e intercalados de fibrina, bem como feixes maiores. Quando a A-beta está presente, os fios de fibrina ficaram mais finos com vários aglomerados pegajosos nos agregados, indicando anormalidades estruturais induzidas por A-beta. Consistente com os resultados do ensaio de turbidez, a formação de coágulos na presença de um bloqueador de interação fibrinogênio A-beta restaura parcialmente a estrutura do coágulo de fibrina a partir das alterações induzidas por A-beta à medida que menos aglomerados são observados com este tratamento.Os protocolos de análise de microscópio eletrônico de turbidez do coágulo foram otimizados para avaliar vários inibidores de interação fibrinogênio A-beta de forma rápida e reprodutível. E em breve os dados fornecerão informações valiosas sobre a formação de coágulos fibrinos que podem ser aplicadas a estudos posteriores tanto in vitro quanto in vivo.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

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Método para visualizar e analisar proteínas de interação de membrana por microscopia eletrônica de transmissão

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Bioquímica

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Análise de uma única partícula de alta resolução a partir de imagens de crio-microscopia de elétrons usando SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

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Analisando a dinâmica da proteína montada sobre e libertado da interferometria Biolayer Biosensor usando espectrometria de massa e de microscopia eletrônica

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Secção Transversa de Arroz Maduro (Oryza sativa L.) Kernels para digitalização de imagens de microscopia eletrônica usando dicas de pipeta como suporte à imobilização

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