Name: analysis of &#946;-amyloid-induced abnormalities on fibrin clot structure by spectroscopy and scanning electron microscopy
Uploaded: 2018-11-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of ÃŽÂ²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Авторы благодарят Masanori Кавасаки, Кадзуёси Асо и Майкл Фоли от Tri-институциональные терапии Discovery институт (TDI), Нью-Йорк для синтеза ингибиторов фибриноген значения взаимодействия и их ценные предложения. Авторы также поблагодарить членов Стрикленд лаборатории для полезной дискуссии. Эта работа была поддержана NIH Грант NS104386, Фонд обнаружения наркотиков Альцгеймера и Робертсон терапевтического фонда развития для Х.А., низ Грант NS50537, Tri-институциональные терапии Discovery институт, Фонд обнаружения наркотиков Альцгеймера, Фонд семьи Рудин и Джон а. Херрманна по с.с.

1. Подготовка Aβ42 и фибриногена для анализа
<ol><li>Подготовить мономерных Aβ42 от лиофилизированный порошок<ol>
<li>Теплый Aβ42 порошок до комнатной температуры и спин вниз на 1500 x g 30 s.</li>
		<li>100 мкл ледяной hexafluoroisopropanol (HFIP) на 0,5 мг порошка Aβ42 и Инкубируйте 30 мин на льду. Предупреждение: Следует с?...

<ol>
	<li>Selkoe, D. J., Schenk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease:+molecular+understanding+predicts+amyloid-based+therapeutics.">Alzheimer's disease: molecular understanding predicts amyloid-based therapeutics.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 43, 545-584 (2003).</li><li>Kurz, A., Perneczky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+clearance+as+a+treatment+target+against+Alzheimer's+disease.">Amyloid clearance as a treatment target against Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 24, 61-73 (2011).</li><li>Benilova, I., Karran, E., De Strooper, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+toxic+Abeta+oligomer+and+Alzheimer's+disease:+an+emperor+in+need+of+clothes.">The toxic Abeta oligomer and Alzheimer's disease: an emperor in need of clothes.</a> Nature Neuroscience. 15 (3), 349-357 (2012).</li><li>Karran, E., Hardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critique+of+the+drug+discovery+and+phase+3+clinical+programs+targeting+the+amyloid+hypothesis+for+Alzheimer+disease.">A critique of the drug discovery and phase 3 clinical programs targeting the amyloid hypothesis for Alzheimer disease.</a> Annals of Neurology. 76 (2), 185-205 (2014).</li><li>Yoshikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+cerebral+blood+flow+in+Alzheimer+disease+and+vascular+dementia.">Heterogeneity of cerebral blood flow in Alzheimer disease and vascular dementia.</a> AJNR, American Journal of Neuroradiology. 24 (7), 1341-1347 (2003).</li><li>Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+will+out:+vascular+contributions+to+Alzheimer's+disease.">Blood will out: vascular contributions to Alzheimer's disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (2), 556-563 (2018).</li><li>Ahn, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease+peptide+beta-amyloid+interacts+with+fibrinogen+and+induces+its+oligomerization.">Alzheimer's disease peptide beta-amyloid interacts with fibrinogen and induces its oligomerization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21812-21817 (2010).</li><li>Zamolodchikov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+structural+analysis+of+the+interaction+between+beta-amyloid+and+fibrinogen.">Biochemical and structural analysis of the interaction between beta-amyloid and fibrinogen.</a> Blood. 128 (8), 1144-1151 (2016).</li><li>Cortes-Canteli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrinogen+and+beta-amyloid+association+alters+thrombosis+and+fibrinolysis:+a+possible+contributing+factor+to+Alzheimer's+disease.">Fibrinogen and beta-amyloid association alters thrombosis and fibrinolysis: a possible contributing factor to Alzheimer's disease.</a> Neuron. 66 (5), 695-709 (2010).</li><li>Cortes-Canteli, M., Mattei, L., Richards, A. T., Norris, E. H., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+deposited+in+the+Alzheimer's+disease+brain+promotes+neuronal+degeneration.">Fibrin deposited in the Alzheimer's disease brain promotes neuronal degeneration.</a> Neurobiology of Aging. 36 (2), 608-617 (2015).</li><li>Liao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+characterization+of+postmortem+amyloid+plaques+isolated+by+laser+capture+microdissection.">Proteomic characterization of postmortem amyloid plaques isolated by laser capture microdissection.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 37061-37068 (2004).</li><li>Zamolodchikov, D., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abeta+delays+fibrin+clot+lysis+by+altering+fibrin+structure+and+attenuating+plasminogen+binding+to+fibrin.">Abeta delays fibrin clot lysis by altering fibrin structure and attenuating plasminogen binding to fibrin.</a> Blood. 119 (14), 3342-3351 (2012).</li><li>Ahn, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Abeta-fibrinogen+interaction+inhibitor+rescues+altered+thrombosis+and+cognitive+decline+in+Alzheimer's+disease+mice.">A novel Abeta-fibrinogen interaction inhibitor rescues altered thrombosis and cognitive decline in Alzheimer's disease mice.</a> The Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1049-1062 (2014).</li><li>Singh, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminopyrimidine+Class+Aggregation+Inhibitor+Effectively+Blocks+Abeta-Fibrinogen+Interaction+and+Abeta-Induced+Contact+System+Activation.">Aminopyrimidine Class Aggregation Inhibitor Effectively Blocks Abeta-Fibrinogen Interaction and Abeta-Induced Contact System Activation.</a> Biochemistry. 57 (8), 1399-1409 (2018).</li><li>Pretorius, E., Mbotwe, S., Bester, J., Robinson, C. J., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+induction+of+anomalous+and+amyloidogenic+blood+clotting+by+molecular+amplification+of+highly+substoichiometric+levels+of+bacterial+lipopolysaccharide.">Acute induction of anomalous and amyloidogenic blood clotting by molecular amplification of highly substoichiometric levels of bacterial lipopolysaccharide.</a> Journal of the Royal Society Interface. 13 (122), (2016).</li><li>Veklich, Y., Francis, C. W., White, J., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+studies+of+fibrinolysis+by+electron+microscopy.">Structural studies of fibrinolysis by electron microscopy.</a> Blood. 92 (12), 4721-4729 (1998).</li><li>Weisel, J. W., Nagaswami, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+modeling+of+fibrin+polymerization+kinetics+correlated+with+electron+microscope+and+turbidity+observations:+clot+structure+and+assembly+are+kinetically+controlled.">Computer modeling of fibrin polymerization kinetics correlated with electron microscope and turbidity observations: clot structure and assembly are kinetically controlled.</a> Biophysical Journal. 63 (1), 111-128 (1992).</li><li>Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+clots+are+equilibrium+polymers+that+can+be+remodeled+without+proteolytic+digestion.">Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion.</a> Scientific Reports. 2, 879 (2012).</li><li>Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+amyloid+beta-peptide+(Abeta)+aggregation+using+the+Congo+red-Abeta+(CR-abeta)+spectrophotometric+assay.">Quantifying amyloid beta-peptide (Abeta) aggregation using the Congo red-Abeta (CR-abeta) spectrophotometric assay.</a> Analytical Biochemistry. 266 (1), 66-76 (1999).</li><li>Zhao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+amyloid+formation+by+turbidity+assay-seeing+through+the+cloud.">Measurement of amyloid formation by turbidity assay-seeing through the cloud.</a> Biophysical Reviews. 8 (4), 445-471 (2016).</li><li>Bester, J., Soma, P., Kell, D. B., Pretorius, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+and+ultrastructural+characteristics+of+whole+blood+and+plasma+in+Alzheimer-type+dementia,+and+the+possible+role+of+bacterial+lipopolysaccharides+(LPS).">Viscoelastic and ultrastructural characteristics of whole blood and plasma in Alzheimer-type dementia, and the possible role of bacterial lipopolysaccharides (LPS).</a> Oncotarget. 6 (34), 35284-35303 (2015).</li><li>Pretorius, E., Page, M. J., Mbotwe, S., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-binding+protein+(LBP)+can+reverse+the+amyloid+state+of+fibrin+seen+or+induced+in+Parkinson's+disease.">Lipopolysaccharide-binding protein (LBP) can reverse the amyloid state of fibrin seen or induced in Parkinson's disease.</a> PLoS One. 13 (3), e0192121 (2018).</li><li>Kell, D. B., Pretorius, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+behaving+badly.+Substoichiometric+molecular+control+and+amplification+of+the+initiation+and+nature+of+amyloid+fibril+formation:+lessons+from+and+for+blood+clotting.">Proteins behaving badly. Substoichiometric molecular control and amplification of the initiation and nature of amyloid fibril formation: lessons from and for blood clotting.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 123, 16-41 (2017).</li><li>Wolberg, A. S., Campbell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombin+generation,+fibrin+clot+formation+and+hemostasis.">Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis.</a> Transfusion and Apheresis Science. 38 (1), 15-23 (2008).</li><li>Soon, A. S., Lee, C. S., Barker, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+fibrin+matrix+properties+via+knob:hole+affinity+interactions+using+peptide-PEG+conjugates.">Modulation of fibrin matrix properties via knob:hole affinity interactions using peptide-PEG conjugates.</a> Biomaterials. 32 (19), 4406-4414 (2011).</li></ol>

Описанные здесь методы обеспечить воспроизводимость и быстрым средством оценки фибринового сгустка формирования в пробирке. Кроме того простота системы делает толкование как значения влияет на сгустков фибрина и структура довольно прямо вперед. В предыдущей публикации этой лаб...

Болезнь Альцгеймера (AD), нейродегенеративных заболеваний, ведущих к когнитивным снижением пожилых пациентов, преимущественно возникает из ненормальное бета амилоида (значения) выражение, агрегирование и нарушением Распродажа результате нейротоксичность1, 2. Несмотря на хорошо изученных связь между значения агрегатов и объявление3, точные механизмы, лежащие в основе заболевания патология не являются хорошо понимали4. Все больше фактов предполагает нервно-сосудистого дефицита играть роль в прогрессии и тяжести AD5, как значения непосредственно взаимодействует с компонентами системы кровообращения6. Значения есть высокоспецифичных взаимодействие с фибриноген7,8, который также локализует значения вкладов в AD пациентов и мыши модели9,10,11. Кроме того значения фибриноген взаимодействия вызывает аномальные фибрин-сгустков и структура, а также сопротивление фибринолиза9,12. Один терапевтические возможности в лечении AD, облегчение кровообращения дефицита путем ингибирования взаимодействие между Aβ и фибриногена13,14. Мы, таким образом, определены несколько небольших соединений, ингибирующих значения фибриноген взаимодействия с помощью скрининга высокую пропускную способность и фармацевтическая химия подходы13,14. Чтобы проверить эффективность ингибиторов фибриноген значения взаимодействия, мы оптимизировали два метода для анализа в vitro сгустков фибрина: сгусток мутность пробирного и сканирование электронная микроскопия (SEM)14.
Сгусток мутность пробирного является прямой и быстрый метод для мониторинга сгустков фибрина с помощью УФ видимые спектроскопии. Как сгусток фибрина чаще рассеивается формы, света и помутнение раствора увеличивается. И наоборот, когда значения присутствует, изменяется структура фибринового сгустка, и помутнения смеси снижается (рис. 1). Эффект ингибирующее соединений можно оценить потенциал для восстановления сгусток мутности от значения индуцированной аномалии. Хотя мутность assay позволяет для быстрого анализа нескольких условий, предоставляет ограниченные сведения о сгусток формы и структуры. SEM, в котором топографии твердых объектов раскрывается зондом электрона, позволяет для анализа 3D архитектура сгусток15,16,17,18 и оценки как наличие значения и ингибирующее соединений или изменяет что структура9,14. Оба-спектрометрии и SEM классических лабораторных методов, используемых для различных целей, например, спектрофотометрия используется для мониторинга амилоида агрегации19,20. Аналогичным образом SEM также используется для анализа фибринового сгустка, образуются из плазмы Альцгеймера, Паркинсона и тромбоэмболических инсульт пациентов21,,22-23. Здесь представлены протоколы оптимизированы для оценки сгустков фибрина воспроизводимость и быстрым образом.
Следующий протокол содержит инструкции для подготовки в vitro фибрин сгусток с и без значения. В нем также подробно методы для анализа влияния значения на сгустков фибрина и структуры. Эффективность этих двух методов для измерения ингибирование значения фибриноген взаимодействия подтверждается с помощью TDI-2760, небольшой тормозящий составные14. Эти методы, как индивидуально, так и вместе, позволяют для быстрой и простой анализ формирования в vitro фибринового сгустка.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fibriogen, Plasminogen-Depleted, Plasma</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>341578</td>
			<td>keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-Amyloid (1-42), Human</td>
			<td>Anaspec</td>
			<td>AS-20276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from human plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>105228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTERED</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>C70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Syringe, 0.2&#181;M, 25mm</td>
			<td>Pall</td>
			<td>4612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia.</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLVV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat Bottom</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>21377203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectramax Plus384</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>89212-396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, 5417R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 200 Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>15-337-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Rotator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>2314-1CEQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spare washers for cover slip holder</td>
			<td>Tousimis</td>
			<td>8766-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow Stem Pipets - Sedi-Pet</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>70967-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample holder for CPD (Cover slip holder)</td>
			<td>Tousimis</td>
			<td>8766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mount Holder Box, Pin Type</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>76610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round glass cover slides (12 mm)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>16120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Cacodylate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM Stubs, Tapered end pin.</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>75192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm OD</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16084-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosamdri-815 Critical Point Dryer with Gold/Palladium target</td>
			<td>Tousimis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denton Desk IV Coater</td>
			<td>Denton Vacuum</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leo 1550 FE-SEM</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smart SEM Software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of &#946;-amyloid-induced abnormalities on fibrin clot structure by spectroscopy and scanning electron microscopy

Эта статья представляет методы для генерации в сгустков фибрина in vitro и анализируя эффект бета амилоида (значения) белка на сгустков и структура спектрометрическим методом и растровая электронная микроскопия (SEM). Было показано, что значения, который образует нейротоксическое амилоидных агрегатов в болезни Альцгеймера (AD), взаимодействовать с фибриногена. Это значения фибриноген взаимодействие делает сгусток фибрина структурно ненормальное и устойчивы к фибринолиза. Значения индуцированной аномалии в фибрин свертывания может также способствовать цереброваскулярные аспекты AD патологии как квадрантной, воспаления, а так же, Церебральный амилоидные ангиопатии (УГА). Учитывая потенциально решающую роль нервно-сосудистого дефицита в AD патологии, разработке соединений, которые могут препятствовать или уменьшить значения фибриноген взаимодействия имеет многообещающие терапевтическую ценность. В vitro методы, которые фибрина сгустков можно легко и систематически оценивать являются потенциально полезными инструментами для разработки терапевтических соединений. Представленные здесь является оптимизированный протокол в vitro поколения фибринового сгустка, а также анализ влияния значения и значения фибриноген взаимодействие ингибиторов. Сгусток мутность быстрое, высокую воспроизводимость и может использоваться для проверки нескольких условий одновременно, позволяя для скрининга большого числа ингибиторов фибриноген значения. Хит соединений из этой проверки может оцениваться дальнейшие за их способность улучшить значения индуцированные структурные аномалии фибринового сгустка архитектуры с использованием SEM. Эффективность этих оптимизированных протоколов свидетельствует здесь с помощью TDI-2760, ингибитор взаимодействия недавно выявленных значения фибриногена.

В в vitro свертывания пробирного (мутность) фермент тромбин расщепляет фибриноген, что приводит к образованию фибринового сети24. Это образование сгустка фибрина вызывает рассеяния света, проходящего через решение, что приводит к увеличению мутность (<st...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of ÃŽÂ²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Анализ отклонений β-амилоид индуцированной фибринового сгустка структуры спектроскопии и растровая электронная микроскопия

Здесь представлены два метода, которые могут использоваться отдельно или в сочетании для анализа воздействия бета амилоида на структуру сгусток фибрина. Включено — это протокол для создания фибрина в vitro сгусток, следуют сгусток мутность и растровая электронная микроскопия методы.

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Основным преимуществом этого анализа мутности на основе пластины является то, что он быстр и позволяет проверять сразу несколько ингибиторов взаимодействия амилоидно-бета фибриногена без сложной настройки или требований. Головные соединения, которые находятся в анализе мутности фибрина, могут быть дополнительно оценены за их способность восстановить А-бета-индуцированной структурной аномалии в сгустках фибрина, проанализированных путем сканирования электронной микроскопии. Визуальная демонстрация подготовки сгустка для сканирования анализа электронной микроскопии имеет решающее значение, поскольку любые изменения в препарате могут способствовать вариациям в экспериментальных результатах.Основное внимание в этой демонстрации здесь уделяется A-бета фибриноген взаимодействий. Этот протокол можно легко модифицировать для анализа других взаимодействий с другими белками и соединениями с сгустком фибрина. Начните с добавления 1,5 микромолара свежеприготовленного фибриногена в 200 микролитров буфера образования тромбов к каждому A-бета отрицательному 42, содержащем и контролю скважин и инкубировать пластину на вращающейся платформе при комнатной температуре.Через 30 минут одновременно добавьте 30 микролитров свежеприготовленного раствора тромбина непосредственно в центр фибриногенсодержащего хорошо, чтобы инициировать образование тромба и сразу же прочитайте поглощение тромбов in vitro на 350 нанометров, повторяя измерение каждые 30-60 секунд в течение 10 минут. Для оценки влияния ингибиторов взаимодействия A-beta fibrinogen на структуру сгустка фибрина, сначала используйте типсы, чтобы поместить чистый, 12-миллиметровый силиконовый стеклянный круг крышка скользит к отдельным скважинам 12 пластины скважины и добавить 80 микролитров фибриногена на каждой крышке скольжения, мягко распространяя раствор так, что они равномерно распределены. Добавьте 20 микролитров раствора тромбина в каждую колодец, чтобы инициировать образование тромбов.Обложка пластины в течение 30 до 60 минут инкубации при комнатной температуре, а затем осторожно погрузить каждый сгусток в два миллилитров ледяного буфера какодилата натрия в течение двух минут, покрытые, при комнатной температуре в два раза, используя один миллилитр пипетки тщательно удалить буфер после каждой стирки. После последней стирки проверьте состояние образования сгустка на крышке скольжения и исправить сгустки в два-три миллилитров ледяной 2%glutaraldehyde на льду в течение 30 минут. В конце инкубации аккуратно удалите глутаралдегид из каждого хорошо и мыть сгустки со свежим буфером какодилата натрия, как попродемонстрировано на льду.Для увлажнения фиксированных сгустков в градуированной серии из пяти минут ледяного этанола моет на льду, не полностью удаляя этанол между моет держать сгустки защищены от воздействия воздуха. Во время последнего 100%ethanol мыть, передача крышка скользит в критической точке сушилки образца держателя, размещение по крайней мере 1 шайба между каждой крышкой скольжения и место держателя в критическую точку сушилки камеры заполнены этанолом. После 30-минутного цикла сушки используйте углеродную ленту для установки крышки скользит по отдельным сканирующей электронной микроскопии заглушек и передачи образцов в камеру покрытия распыления вакуумного распылитель.Затем распыление пальто менее 20 нанометров золотого палладия или других проводящих материалов на образцы в течение 25 секунд при четырех ангстремах в секунду и изображение образцов на сканирующем электронном микроскопе, оборудованном детектором вторичных электронов типа два на четыре киловольты. Образование сгустка Фибрина вызывает рассеяние света, проходящего через раствор, что приводит к повышенной мутности, что плато в конце периода чтения. Когда фибриноген инкубируется в присутствии A-beta 42 мутность раствора уменьшается с кривой, достигаемой максимальной высоты примерно в два раза, что фибриногена в одиночку.При наличии блокатора взаимодействия A-beta 42 эффект бета-амилоида омлеяется, а мутность выше, чем при одной только А-бета. Эффект блокатора не появляется из-за фоновой мутности, так как соединение не меняет мутность сгустка фибрина, когда отсутствует A-бета. Кроме того, образование тромбов в присутствии GPRP, пептида, который, как известно, мешает полимеризации фибрина, демонстрирует значительно сниженную мутность по сравнению с образованием сгустка фибрина в отсутствие ингибитора.Фибриноген, генерируемый при наличии тромбина и хлорида кальция, образуют только фибриновую сетку с удлиненными и интеркалированными нитями фибрина, а также более крупными пучками. Когда A-бета присутствует, нити фибрина стали тоньше с несколькими липкими сгустками в агрегатах, что указывает на А-бета индуцированных структурных аномалий. В соответствии с результатами анализа мутности, образование тромба в присутствии блокатора взаимодействия A-beta fibrinogen частично восстанавливает структуру сгустка фибрина от изменений, вызванных А-бета, поскольку с помощью этого лечения наблюдается меньше комков.Анализ мутности сгустка и протоколы анализа электронного микроскопа были оптимизированы для оценки нескольких ингибиторов взаимодействия фибриногена A-бета быстрым и воспроизводимым образом. И вскоре данные предоставят ценную информацию о образовании сгустка фибрина, которая может быть применена к дальнейшим исследованиям как in vitro, так и in vivo.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Метод визуализации и анализа Мембранные белков, взаимодействующих с помощью просвечивающей электронной микроскопии

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Анализ одиночных частиц с высокой разрешающей способностью при электронно-микроскопической микроскопии Изображения с использованием SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Полуавтоматическая Biopanning бактериальной отображения библиотек пептид сродство реагент обнаружения и анализа результате изолятов

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems

Вариации на отрицательной пятно методы электронной микроскопии: инструменты для решения сложных систем

Negative stain electron microscopy (EM) allows relatively simple and quick observation of macromolecules and macromolecular complexes through the use of ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

Анализ динамических белковых комплексов монтируется на и освобождены от Biolayer интерферометрии биосенсора с использованием масс-спектрометрии и электронной микроскопии

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Митохондрии и эндоплазмические ретикулами imaging коррелятийным светом и объемной электронной микроскопией

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Поперечное секционирование зрелого риса (Oryza sativa L.) Ядра для сканирующей электронной микроскопии с использованием наконечников пипеток в качестве поддержки иммобилизации

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Одноклеточный анализ транскрипционно активных аллелей одной молекулой FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Криоэлектронная микроскопия с одной частицей: от образца к структуре

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Микроструктурирование просвечивающих электронных микроскопических сеток для прямого позиционирования клеток в рабочих процессах криоэлектронной томографии цельноклеточной криоэлектронной томографии

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...