Name: analysis of &#946;-amyloid-induced abnormalities on fibrin clot structure by spectroscopy and scanning electron microscopy
Uploaded: 2018-11-30T14:30:00
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Autores agradecen Masanori Kawasaki, Kazuyoshi Aso y Michael Foley de Tri-institucional Therapeutics Discovery Institute (TDI), Nueva York para la síntesis de inhibidores de la interacción de fibrinógeno de Aß y sus valiosas sugerencias. Autores también agradecen a los miembros del laboratorio de Strickland para el debate útil. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de NIH NS104386 de Alzheimer Drug Discovery Foundation y fondo de desarrollo terapéutico de Robertson para H.A., NIH grant NS50537, el Tri-institucional Therapeutics Discovery Institute, Alzheimer Drug Discovery Foundation, Fundación de la familia Rudin y John A. Herrmann de S.S.

1. preparación de Aβ42 y fibrinógeno para análisis
<ol><li>Preparar Aβ42 monomérica de polvo liofilizado<ol>
<li>Caliente Aβ42 en polvo a temperatura ambiente y de la vuelta abajo a 1.500 x g por 30 s.</li>
		<li>Añada 100 μl de helada hexafluoroisopropanol (HFIP) por 0,5 mg de polvo de Aβ42 e incubar durante 30 min en hielo. PRECAUCIÓN: Tenga cuidado al manejar HFIP y realizar todos los pasos en una campana química.</li>
		<li>Preparar 20 alícuotas μl y deje que el aire de películas secado en una cam...

<ol>
	<li>Selkoe, D. J., Schenk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease:+molecular+understanding+predicts+amyloid-based+therapeutics.">Alzheimer's disease: molecular understanding predicts amyloid-based therapeutics.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 43, 545-584 (2003).</li><li>Kurz, A., Perneczky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+clearance+as+a+treatment+target+against+Alzheimer's+disease.">Amyloid clearance as a treatment target against Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 24, 61-73 (2011).</li><li>Benilova, I., Karran, E., De Strooper, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+toxic+Abeta+oligomer+and+Alzheimer's+disease:+an+emperor+in+need+of+clothes.">The toxic Abeta oligomer and Alzheimer's disease: an emperor in need of clothes.</a> Nature Neuroscience. 15 (3), 349-357 (2012).</li><li>Karran, E., Hardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critique+of+the+drug+discovery+and+phase+3+clinical+programs+targeting+the+amyloid+hypothesis+for+Alzheimer+disease.">A critique of the drug discovery and phase 3 clinical programs targeting the amyloid hypothesis for Alzheimer disease.</a> Annals of Neurology. 76 (2), 185-205 (2014).</li><li>Yoshikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+cerebral+blood+flow+in+Alzheimer+disease+and+vascular+dementia.">Heterogeneity of cerebral blood flow in Alzheimer disease and vascular dementia.</a> AJNR, American Journal of Neuroradiology. 24 (7), 1341-1347 (2003).</li><li>Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+will+out:+vascular+contributions+to+Alzheimer's+disease.">Blood will out: vascular contributions to Alzheimer's disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (2), 556-563 (2018).</li><li>Ahn, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease+peptide+beta-amyloid+interacts+with+fibrinogen+and+induces+its+oligomerization.">Alzheimer's disease peptide beta-amyloid interacts with fibrinogen and induces its oligomerization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21812-21817 (2010).</li><li>Zamolodchikov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+structural+analysis+of+the+interaction+between+beta-amyloid+and+fibrinogen.">Biochemical and structural analysis of the interaction between beta-amyloid and fibrinogen.</a> Blood. 128 (8), 1144-1151 (2016).</li><li>Cortes-Canteli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrinogen+and+beta-amyloid+association+alters+thrombosis+and+fibrinolysis:+a+possible+contributing+factor+to+Alzheimer's+disease.">Fibrinogen and beta-amyloid association alters thrombosis and fibrinolysis: a possible contributing factor to Alzheimer's disease.</a> Neuron. 66 (5), 695-709 (2010).</li><li>Cortes-Canteli, M., Mattei, L., Richards, A. T., Norris, E. H., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+deposited+in+the+Alzheimer's+disease+brain+promotes+neuronal+degeneration.">Fibrin deposited in the Alzheimer's disease brain promotes neuronal degeneration.</a> Neurobiology of Aging. 36 (2), 608-617 (2015).</li><li>Liao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+characterization+of+postmortem+amyloid+plaques+isolated+by+laser+capture+microdissection.">Proteomic characterization of postmortem amyloid plaques isolated by laser capture microdissection.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 37061-37068 (2004).</li><li>Zamolodchikov, D., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abeta+delays+fibrin+clot+lysis+by+altering+fibrin+structure+and+attenuating+plasminogen+binding+to+fibrin.">Abeta delays fibrin clot lysis by altering fibrin structure and attenuating plasminogen binding to fibrin.</a> Blood. 119 (14), 3342-3351 (2012).</li><li>Ahn, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Abeta-fibrinogen+interaction+inhibitor+rescues+altered+thrombosis+and+cognitive+decline+in+Alzheimer's+disease+mice.">A novel Abeta-fibrinogen interaction inhibitor rescues altered thrombosis and cognitive decline in Alzheimer's disease mice.</a> The Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1049-1062 (2014).</li><li>Singh, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminopyrimidine+Class+Aggregation+Inhibitor+Effectively+Blocks+Abeta-Fibrinogen+Interaction+and+Abeta-Induced+Contact+System+Activation.">Aminopyrimidine Class Aggregation Inhibitor Effectively Blocks Abeta-Fibrinogen Interaction and Abeta-Induced Contact System Activation.</a> Biochemistry. 57 (8), 1399-1409 (2018).</li><li>Pretorius, E., Mbotwe, S., Bester, J., Robinson, C. J., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+induction+of+anomalous+and+amyloidogenic+blood+clotting+by+molecular+amplification+of+highly+substoichiometric+levels+of+bacterial+lipopolysaccharide.">Acute induction of anomalous and amyloidogenic blood clotting by molecular amplification of highly substoichiometric levels of bacterial lipopolysaccharide.</a> Journal of the Royal Society Interface. 13 (122), (2016).</li><li>Veklich, Y., Francis, C. W., White, J., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+studies+of+fibrinolysis+by+electron+microscopy.">Structural studies of fibrinolysis by electron microscopy.</a> Blood. 92 (12), 4721-4729 (1998).</li><li>Weisel, J. W., Nagaswami, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+modeling+of+fibrin+polymerization+kinetics+correlated+with+electron+microscope+and+turbidity+observations:+clot+structure+and+assembly+are+kinetically+controlled.">Computer modeling of fibrin polymerization kinetics correlated with electron microscope and turbidity observations: clot structure and assembly are kinetically controlled.</a> Biophysical Journal. 63 (1), 111-128 (1992).</li><li>Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+clots+are+equilibrium+polymers+that+can+be+remodeled+without+proteolytic+digestion.">Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion.</a> Scientific Reports. 2, 879 (2012).</li><li>Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+amyloid+beta-peptide+(Abeta)+aggregation+using+the+Congo+red-Abeta+(CR-abeta)+spectrophotometric+assay.">Quantifying amyloid beta-peptide (Abeta) aggregation using the Congo red-Abeta (CR-abeta) spectrophotometric assay.</a> Analytical Biochemistry. 266 (1), 66-76 (1999).</li><li>Zhao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+amyloid+formation+by+turbidity+assay-seeing+through+the+cloud.">Measurement of amyloid formation by turbidity assay-seeing through the cloud.</a> Biophysical Reviews. 8 (4), 445-471 (2016).</li><li>Bester, J., Soma, P., Kell, D. B., Pretorius, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+and+ultrastructural+characteristics+of+whole+blood+and+plasma+in+Alzheimer-type+dementia,+and+the+possible+role+of+bacterial+lipopolysaccharides+(LPS).">Viscoelastic and ultrastructural characteristics of whole blood and plasma in Alzheimer-type dementia, and the possible role of bacterial lipopolysaccharides (LPS).</a> Oncotarget. 6 (34), 35284-35303 (2015).</li><li>Pretorius, E., Page, M. J., Mbotwe, S., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-binding+protein+(LBP)+can+reverse+the+amyloid+state+of+fibrin+seen+or+induced+in+Parkinson's+disease.">Lipopolysaccharide-binding protein (LBP) can reverse the amyloid state of fibrin seen or induced in Parkinson's disease.</a> PLoS One. 13 (3), e0192121 (2018).</li><li>Kell, D. B., Pretorius, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+behaving+badly.+Substoichiometric+molecular+control+and+amplification+of+the+initiation+and+nature+of+amyloid+fibril+formation:+lessons+from+and+for+blood+clotting.">Proteins behaving badly. Substoichiometric molecular control and amplification of the initiation and nature of amyloid fibril formation: lessons from and for blood clotting.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 123, 16-41 (2017).</li><li>Wolberg, A. S., Campbell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombin+generation,+fibrin+clot+formation+and+hemostasis.">Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis.</a> Transfusion and Apheresis Science. 38 (1), 15-23 (2008).</li><li>Soon, A. S., Lee, C. S., Barker, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+fibrin+matrix+properties+via+knob:hole+affinity+interactions+using+peptide-PEG+conjugates.">Modulation of fibrin matrix properties via knob:hole affinity interactions using peptide-PEG conjugates.</a> Biomaterials. 32 (19), 4406-4414 (2011).</li></ol>

Los métodos descritos aquí proporcionan un medio rápido y reproducible de evaluación fibrina coágulo formación en vitro. Además, la simplicidad del sistema hace que la interpretación de cómo Aß afecta la formación de coágulos de fibrina y la estructura relativamente sencilla. En publicación anterior de este laboratorio, se comprobó que estos ensayos pueden utilizarse para probar compuestos por su capacidad para inhibir la interacción de fibrinógeno Aβ13,<sup cl...

La enfermedad de Alzheimer (AD), una enfermedad neurodegenerativa que lleva a deterioro cognitivo en pacientes ancianos, predominantemente surge de la expresión anormal beta-amiloide (Aβ), agregación y separación deteriorada, dando lugar a neurotoxicidad1, 2. a pesar de la Asociación bien caracterizada entre agregados de Aß y AD3, los mecanismos precisos subyacentes a la patología de la enfermedad no son bien entendidos4. Creciente evidencia sugiere que déficit neurovascular desempeñan un papel en la progresión y severidad de AD5, Aβ interactúa directamente con los componentes del sistema circulatorio6. Aβ tiene una interacción de alta afinidad con el fibrinógeno7,8, que también se localiza a los depósitos Aβ en pacientes con EA y ratón modelos9,10,11. Además, la interacción de fibrinógeno Aβ induce la formación anormal de coágulos de fibrina y estructura, así como resistencia a la fibrinolisis9,12. Una posibilidad terapéutica en el tratamiento de AD, es aliviar el déficit circulatorio mediante la inhibición de la interacción de Aß y fibrinógeno13,14. Por lo tanto, identificamos varios pequeños compuestos inhiben la interacción de fibrinógeno Aβ con proyección de alto rendimiento y química medicinal enfoques13,14. Para probar la eficacia de los inhibidores de la interacción de fibrinógeno de Aβ, hemos optimizado dos métodos para el análisis de en vitro la formación de coágulos de fibrina: coágulo turbidez análisis y exploración de la microscopia electrónica (SEM)14.
Análisis de turbidez de coágulo es un método sencillo y rápido para el seguimiento de la formación del coágulo de fibrina mediante espectroscopia UV-visible. Como el coágulo de fibrina se dispersa cada vez más formas, luz y aumenta la turbidez de la solución. Por el contrario, cuando Aß está presente, se altera la estructura del coágulo de fibrina, y se reduce la turbiedad de la mezcla (figura 1). El efecto de compuestos inhibitorios puede evaluarse el potencial restaurar coágulo turbidez de anormalidades inducidas por Aβ. Mientras que el análisis de turbidez permite un análisis rápido de varias condiciones, proporciona información limitada sobre el coágulo forma y estructura. SEM, en el que se revela la topografía de objetos sólidos por sonda de electrones, permite el análisis de la arquitectura 3D del coágulo15,16,17,18 y la evaluación de cómo la presencia de Aß y compuestos inhibitorios y/o altera esa estructura9,14. Tanto espectrometría y SEM son técnicas de laboratorio clásicas que se han utilizado para los varios propósitos, por ejemplo, espectrofotometría se utiliza para el control de la agregación amiloide19,20. Del mismo modo, SEM también se utiliza para analizar el coágulo de fibrina formado por el plasma de la enfermedad de Alzheimer, Parkinson y accidente cerebrovascular tromboembólico pacientes21,22,23. Los protocolos aquí presentados están optimizados para evaluar la formación del coágulo de fibrina de forma rápida y reproducible.
El siguiente protocolo proporciona las instrucciones para la preparación de una en vitro -coágulo de fibrina con o sin Aβ. También detalla los métodos para analizar el efecto de Aß en la formación de coágulos de fibrina y estructura. La eficacia de estos dos métodos para medir la inhibición de la interacción de fibrinógeno Aβ se demuestra usando TDI-2760, un compuesto inhibitorio pequeño14. Estos métodos, tanto individualmente como en conjunto, permiten análisis rápido y sencillo de en vitro la formación de coágulos de fibrina.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fibriogen, Plasminogen-Depleted, Plasma</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>341578</td>
			<td>keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-Amyloid (1-42), Human</td>
			<td>Anaspec</td>
			<td>AS-20276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from human plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>105228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTERED</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>C70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Syringe, 0.2&#181;M, 25mm</td>
			<td>Pall</td>
			<td>4612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia.</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLVV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat Bottom</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>21377203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectramax Plus384</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>89212-396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, 5417R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 200 Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>15-337-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Rotator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>2314-1CEQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spare washers for cover slip holder</td>
			<td>Tousimis</td>
			<td>8766-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow Stem Pipets - Sedi-Pet</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>70967-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample holder for CPD (Cover slip holder)</td>
			<td>Tousimis</td>
			<td>8766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mount Holder Box, Pin Type</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>76610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round glass cover slides (12 mm)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>16120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Cacodylate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM Stubs, Tapered end pin.</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>75192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm OD</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16084-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosamdri-815 Critical Point Dryer with Gold/Palladium target</td>
			<td>Tousimis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denton Desk IV Coater</td>
			<td>Denton Vacuum</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leo 1550 FE-SEM</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smart SEM Software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of &#946;-amyloid-induced abnormalities on fibrin clot structure by spectroscopy and scanning electron microscopy

Este artículo presenta métodos para la generación de coágulos de fibrina vitro y analizar el efecto de la proteína de amiloide beta (Aβ) en estructura y formación de coágulos por espectrometría y microscopía electrónica de barrido (SEM). Aβ, que forma agregados de amiloide neurotóxicos en enfermedad de Alzheimer (EA), se ha demostrado para interactuar con el fibrinógeno. Esta interacción de Aβ-fibrinógeno hace el coágulo de fibrina estructuralmente anormales y resistentes a la fibrinólisis. Inducida por Aß anormalidades en la coagulación de fibrina también pueden contribuir a aspectos cerebrovasculares de la patología de AD como microinfartos, inflamación, así como, angiopathy amiloideo cerebral (CAA). Dado el papel potencialmente crítico de déficit neurovascular en patología AD, desarrollo de compuestos que pueden inhibir o reducir la interacción de fibrinógeno Aβ tiene valor terapéutico prometedor. In vitro métodos por que fibrina formación de coágulos puede ser fácil y sistemáticamente evaluada son herramientas potencialmente útiles para el desarrollo de compuestos terapéuticos. Presentamos es un protocolo optimizado para generación en vitro del coágulo de fibrina, así como análisis del efecto de inhibidores de la interacción de Aß y el Aβ-fibrinógeno. El análisis de turbidez de coágulo es rápido, altamente reproducible y puede utilizarse para probar condiciones múltiples simultáneamente, permitiendo la proyección de un gran número de inhibidores de la Aβ-fibrinógeno. Éxitos compuestos a partir de esta proyección pueden ser evaluados además por su capacidad para mejorar inducida por Aß anormalidades estructurales de la arquitectura del coágulo de fibrina mediante SEM. La eficacia de estos protocolos optimizados se demuestra aquí con TDI-2760, un inhibidor de interacción recientemente identificado de Aβ-fibrinógeno.

En el en vitro la coagulación prueba (turbidez), la trombina enzima hiende fibrinógeno, dando por resultado la formación de la fibrina red24. Esta formación de coágulo de fibrina causa dispersión de la luz que pasa a través de la solución, dando por resultado mayor turbidez (figura 1), estancamiento antes de finalizar el período de lectura (figura 2, verde). Cuando el fibrinógeno se incu...

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Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Análisis de anomalías inducida por β-amiloide en la estructura del coágulo de fibrina por espectroscopía y microscopía electrónica de barrido

Presentados aquí son dos métodos que pueden utilizarse individualmente o en combinación para analizar el efecto de beta-amiloide en la estructura del coágulo de fibrina. Incluido es un protocolo para crear un coágulo de fibrina en vitro , y después coágulo turbidez y microscopía electrónica métodos.

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

La principal ventaja de este ensayo de turbidez basado en placas es que es rápido y permite que varios inhibidores de la interacción amiloide-beta fibrinógeno se torsen a la vez sin una configuración o requisitos sofisticados. Los compuestos de la cabeza que se encuentran en el ensayo de turbidez de la fibrina se pueden evaluar aún más por su capacidad para restaurar la anormalidad estructural inducida por A-beta en los coágulos de fibrina analizados por microscopía electrónica de barrido. La demostración visual de la preparación del coágulo para el análisis de microscopía electrónica de barrido es fundamental, ya que cualquier variación en la preparación puede contribuir a variaciones dentro de los resultados experimentales.El enfoque de esta demostración aquí es en las interacciones de fibrinógeno A-beta. Este protocolo se puede modificar fácilmente para analizar otras interacciones con otras proteínas y los compuestos con el coágulo de fibrina. Comience añadiendo 1,5 micromolares de fibrinógeno recién preparado en 200 microlitros de tampón de formación de coágulos a cada A-beta negativo 42 que contiene y controla pozos e incubar la placa en una plataforma giratoria a temperatura ambiente.Después de 30 minutos añadir simultáneamente 30 microlitros de solución de trombina recién preparada directamente en el centro del pozo que contiene fibrinógenos para iniciar la formación de coágulos y leer inmediatamente la absorbancia de los coágulos in vitro a 350 nanómetros, repitiendo la medición cada 30 a 60 segundos en el transcurso de 10 minutos. Para evaluar el efecto de los inhibidores de la interacción con fibrinógeno A-beta en la estructura del coágulo de fibrina, primero utilice fórceps para colocar limpio, la cubierta del círculo de vidrio siliconizado de 12 milímetros se desliza a los pozos individuales de una placa de 12 pozos y añadir 80 microlitros de fibrinógeno en cada resbalón de la cubierta, extendiendo suavemente la solución para que se distribuyan uniformemente. Añadir 20 microlitros de solución de trombina a cada pozo para iniciar la formación de coágulos.Cubra el plato durante una incubación de 30 a 60 minutos a temperatura ambiente, luego sumerja suavemente cada coágulo en dos mililitros de tampón de cacodilato de sodio helado durante dos minutos, cubierto, a temperatura ambiente dos veces, usando una pipeta de un mililitro para retirar cuidadosamente el tampón después de cada lavado. Después del último lavado, compruebe el estado de la formación de coágulos en el resbalón de la cubierta y fije los coágulos en dos o tres mililitros de hielo 2%glutaraldehído sobre hielo durante 30 minutos. Al final de la incubación, retire suavemente el glutaraldehído de cada pocópido y lave los coágulos con tampón de cacodilato de sodio fresco como se demuestra en el hielo.Hidratar los coágulos fijos en una serie de cinco minutos de etanol helado de cinco minutos se lava sobre hielo sin eliminar completamente el etanol entre los lavados para mantener los coágulos protegidos de la exposición al aire. Durante el último lavado de etanol al 100%, transfiera los resbalones de la cubierta a un portacuchillas de secador de puntos críticos, colocando al menos 1 arandela entre cada resbalón de cubierta y coloque el soporte en una cámara de secadora de punto crítico llena de etanol. Después de un ciclo de secado de 30 minutos, utilice cinta de carbono para montar los resbalones de la cubierta en talones de microscopía electrónica de barrido individuales y transfiera las muestras a la cámara de recubrimiento de pulverización de una cinta de vacío.A continuación, cubra menos de 20 nanómetros de paladio de oro u otros materiales conductores en las muestras durante 25 segundos a cuatro angstroms por segundo e imagine las muestras en un microscopio electrónico de barrido equipado con un detector de electrones secundario tipo dos a cuatro kilovoltas. La formación de coágulos de fibrina provoca la dispersión de la luz que pasa a través de la solución, lo que resulta en un aumento de la turbidez que se al final del período de lectura. Cuando el fibrinógeno se incuba en presencia de A-beta 42 la turbidez de la solución disminuye con la curva alcanzando una altura máxima de aproximadamente la mitad de la de fibrinógeno solo.En presencia de un bloqueador de interacción A-beta 42 se mejora el efecto de beta-amiloide y la turbidez es mayor que la de A-beta solo. El efecto del bloqueador no aparece debido a la turbidez de fondo, ya que el compuesto no cambia la turbidez del coágulo de fibrina cuando A-beta está ausente. Además, la formación de coágulos en presencia de GPRP, un péptido conocido por interferir con la polimerización de la fibrina, demuestra una turbidez significativamente reducida en comparación con la formación de coágulos de fibrina en ausencia del inhibidor.El fibrinógeno generado en presencia de trombina y cloruro de calcio sólo forman una malla de fibrina con hilos alargados e intercalados de fibrina, así como haces más grandes. Cuando A-beta está presente, los hilos de fibrina se volvieron más delgados con varios grumos pegajosos en agregados, lo que indica anomalías estructurales inducidas por A-beta. De acuerdo con los resultados del ensayo de turbidez, la formación de coágulos en presencia de un bloqueador de interacción de fibrinógeno A-beta restaura parcialmente la estructura del coágulo de fibrina a partir de los cambios inducidos por A-beta a medida que se observan menos grumos con este tratamiento.El ensayo de turbidez del coágulo y los protocolos de análisis del microscopio electrónico de barrido se han optimizado para evaluar varios inhibidores de la interacción con fibrinógenos A-beta de una manera rápida y reproducible. Y pronto los datos proporcionarán información valiosa sobre la formación de coágulos de fibrina que se puede aplicar a otros estudios tanto in vitro como in vivo.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

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Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Investigación

Bioquímica

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Análisis de una sola partícula de alta resolución a partir de imágenes de crosmicroscopía electrónica usando SPHIRE

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Seccionamiento transversal de arroz maduro (Oryza sativa L.) Núcleos para imágenes de microscopía electrónica de barrido utilizando puntas de pipeta como soporte de inmovilización

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Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

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Micropatronaje Transmisión Microscopía Microscopía Rejillas para Dirigir el Posicionamiento Celular dentro de los Flujos de Trabajo de Tomografía Crioelectrónica de Celda Entera

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...