Name: analysis of &#946;-amyloid-induced abnormalities on fibrin clot structure by spectroscopy and scanning electron microscopy
Uploaded: 2018-11-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of ÃŽÂ²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Författarna vill tacka Masanori Kawasaki, Kazuyoshi Aso och Michael Foley från Tri-institutionella Therapeutics Discovery Institute (TDI), New York för syntes av Aβ-fibrinogen interaktion hämmare och deras värdefulla förslag. Författarna vill även tacka medlemmar Strickland labbet för bra diskussion. Detta arbete fick stöd av NIH grant NS104386, Alzheimer's Drug Discovery Foundation och Robertson terapeutiska utvecklingsfonden för H.A., NIH bevilja NS50537, den Tri-institutionella Therapeutics Discovery Institute, Alzheimer's Drug Discovery Foundation, Rudin Family Foundation, och John A. Herrmann för S.S.

1. beredning av Aβ42 och Fibrinogen för analys
<ol><li>Förbereda monomer Aβ42 från frystorkat pulver<ol>
<li>Varm Aβ42 pulver till rumstemperatur och snurra ner vid 1500 x g i 30 s.</li>
		<li>Tillsätt 100 µL av iskall hexafluoroisopropanol (Bovallstrand) per 0,5 mg Aβ42 pulver och inkubera i 30 min på is. Varning: Var försiktig vid hantering av Bovallstrand och utföra alla steg i en kemisk huva.</li>
		<li>Förbereda 20 µL portioner och låt filmer luften torr i en kemisk huva för 2-3 h. filmer kan f?...

<ol>
	<li>Selkoe, D. J., Schenk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease:+molecular+understanding+predicts+amyloid-based+therapeutics.">Alzheimer's disease: molecular understanding predicts amyloid-based therapeutics.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 43, 545-584 (2003).</li><li>Kurz, A., Perneczky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+clearance+as+a+treatment+target+against+Alzheimer's+disease.">Amyloid clearance as a treatment target against Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 24, 61-73 (2011).</li><li>Benilova, I., Karran, E., De Strooper, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+toxic+Abeta+oligomer+and+Alzheimer's+disease:+an+emperor+in+need+of+clothes.">The toxic Abeta oligomer and Alzheimer's disease: an emperor in need of clothes.</a> Nature Neuroscience. 15 (3), 349-357 (2012).</li><li>Karran, E., Hardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critique+of+the+drug+discovery+and+phase+3+clinical+programs+targeting+the+amyloid+hypothesis+for+Alzheimer+disease.">A critique of the drug discovery and phase 3 clinical programs targeting the amyloid hypothesis for Alzheimer disease.</a> Annals of Neurology. 76 (2), 185-205 (2014).</li><li>Yoshikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+cerebral+blood+flow+in+Alzheimer+disease+and+vascular+dementia.">Heterogeneity of cerebral blood flow in Alzheimer disease and vascular dementia.</a> AJNR, American Journal of Neuroradiology. 24 (7), 1341-1347 (2003).</li><li>Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+will+out:+vascular+contributions+to+Alzheimer's+disease.">Blood will out: vascular contributions to Alzheimer's disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (2), 556-563 (2018).</li><li>Ahn, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease+peptide+beta-amyloid+interacts+with+fibrinogen+and+induces+its+oligomerization.">Alzheimer's disease peptide beta-amyloid interacts with fibrinogen and induces its oligomerization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21812-21817 (2010).</li><li>Zamolodchikov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+structural+analysis+of+the+interaction+between+beta-amyloid+and+fibrinogen.">Biochemical and structural analysis of the interaction between beta-amyloid and fibrinogen.</a> Blood. 128 (8), 1144-1151 (2016).</li><li>Cortes-Canteli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrinogen+and+beta-amyloid+association+alters+thrombosis+and+fibrinolysis:+a+possible+contributing+factor+to+Alzheimer's+disease.">Fibrinogen and beta-amyloid association alters thrombosis and fibrinolysis: a possible contributing factor to Alzheimer's disease.</a> Neuron. 66 (5), 695-709 (2010).</li><li>Cortes-Canteli, M., Mattei, L., Richards, A. T., Norris, E. H., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+deposited+in+the+Alzheimer's+disease+brain+promotes+neuronal+degeneration.">Fibrin deposited in the Alzheimer's disease brain promotes neuronal degeneration.</a> Neurobiology of Aging. 36 (2), 608-617 (2015).</li><li>Liao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+characterization+of+postmortem+amyloid+plaques+isolated+by+laser+capture+microdissection.">Proteomic characterization of postmortem amyloid plaques isolated by laser capture microdissection.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 37061-37068 (2004).</li><li>Zamolodchikov, D., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abeta+delays+fibrin+clot+lysis+by+altering+fibrin+structure+and+attenuating+plasminogen+binding+to+fibrin.">Abeta delays fibrin clot lysis by altering fibrin structure and attenuating plasminogen binding to fibrin.</a> Blood. 119 (14), 3342-3351 (2012).</li><li>Ahn, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Abeta-fibrinogen+interaction+inhibitor+rescues+altered+thrombosis+and+cognitive+decline+in+Alzheimer's+disease+mice.">A novel Abeta-fibrinogen interaction inhibitor rescues altered thrombosis and cognitive decline in Alzheimer's disease mice.</a> The Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1049-1062 (2014).</li><li>Singh, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminopyrimidine+Class+Aggregation+Inhibitor+Effectively+Blocks+Abeta-Fibrinogen+Interaction+and+Abeta-Induced+Contact+System+Activation.">Aminopyrimidine Class Aggregation Inhibitor Effectively Blocks Abeta-Fibrinogen Interaction and Abeta-Induced Contact System Activation.</a> Biochemistry. 57 (8), 1399-1409 (2018).</li><li>Pretorius, E., Mbotwe, S., Bester, J., Robinson, C. J., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+induction+of+anomalous+and+amyloidogenic+blood+clotting+by+molecular+amplification+of+highly+substoichiometric+levels+of+bacterial+lipopolysaccharide.">Acute induction of anomalous and amyloidogenic blood clotting by molecular amplification of highly substoichiometric levels of bacterial lipopolysaccharide.</a> Journal of the Royal Society Interface. 13 (122), (2016).</li><li>Veklich, Y., Francis, C. W., White, J., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+studies+of+fibrinolysis+by+electron+microscopy.">Structural studies of fibrinolysis by electron microscopy.</a> Blood. 92 (12), 4721-4729 (1998).</li><li>Weisel, J. W., Nagaswami, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+modeling+of+fibrin+polymerization+kinetics+correlated+with+electron+microscope+and+turbidity+observations:+clot+structure+and+assembly+are+kinetically+controlled.">Computer modeling of fibrin polymerization kinetics correlated with electron microscope and turbidity observations: clot structure and assembly are kinetically controlled.</a> Biophysical Journal. 63 (1), 111-128 (1992).</li><li>Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+clots+are+equilibrium+polymers+that+can+be+remodeled+without+proteolytic+digestion.">Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion.</a> Scientific Reports. 2, 879 (2012).</li><li>Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+amyloid+beta-peptide+(Abeta)+aggregation+using+the+Congo+red-Abeta+(CR-abeta)+spectrophotometric+assay.">Quantifying amyloid beta-peptide (Abeta) aggregation using the Congo red-Abeta (CR-abeta) spectrophotometric assay.</a> Analytical Biochemistry. 266 (1), 66-76 (1999).</li><li>Zhao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+amyloid+formation+by+turbidity+assay-seeing+through+the+cloud.">Measurement of amyloid formation by turbidity assay-seeing through the cloud.</a> Biophysical Reviews. 8 (4), 445-471 (2016).</li><li>Bester, J., Soma, P., Kell, D. B., Pretorius, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+and+ultrastructural+characteristics+of+whole+blood+and+plasma+in+Alzheimer-type+dementia,+and+the+possible+role+of+bacterial+lipopolysaccharides+(LPS).">Viscoelastic and ultrastructural characteristics of whole blood and plasma in Alzheimer-type dementia, and the possible role of bacterial lipopolysaccharides (LPS).</a> Oncotarget. 6 (34), 35284-35303 (2015).</li><li>Pretorius, E., Page, M. J., Mbotwe, S., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-binding+protein+(LBP)+can+reverse+the+amyloid+state+of+fibrin+seen+or+induced+in+Parkinson's+disease.">Lipopolysaccharide-binding protein (LBP) can reverse the amyloid state of fibrin seen or induced in Parkinson's disease.</a> PLoS One. 13 (3), e0192121 (2018).</li><li>Kell, D. B., Pretorius, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+behaving+badly.+Substoichiometric+molecular+control+and+amplification+of+the+initiation+and+nature+of+amyloid+fibril+formation:+lessons+from+and+for+blood+clotting.">Proteins behaving badly. Substoichiometric molecular control and amplification of the initiation and nature of amyloid fibril formation: lessons from and for blood clotting.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 123, 16-41 (2017).</li><li>Wolberg, A. S., Campbell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombin+generation,+fibrin+clot+formation+and+hemostasis.">Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis.</a> Transfusion and Apheresis Science. 38 (1), 15-23 (2008).</li><li>Soon, A. S., Lee, C. S., Barker, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+fibrin+matrix+properties+via+knob:hole+affinity+interactions+using+peptide-PEG+conjugates.">Modulation of fibrin matrix properties via knob:hole affinity interactions using peptide-PEG conjugates.</a> Biomaterials. 32 (19), 4406-4414 (2011).</li></ol>

Metoderna som beskrivs här ger ett reproducerbara och snabba sätt att bedöma fibrin koagel bildas i vitro. Enkelheten i systemet gör dessutom tolkningen av hur Aβ påverkar fibrin koagelbildning och struktur relativt rakt fram. I denna lab's tidigare publikation visades att dessa analyser kan användas för att testa föreningar för sin förmåga att hämma Aβ-fibrinogen interaktion13,14. Använder dessa två analyser, en serie av syntetiserade f?...

Alzheimers sjukdom (AD), en neurodegenerativ sjukdom som leder till kognitiv försämring hos äldre patienter, huvudsakligen uppkommer onormala beta-amyloid (Aβ) uttryck, aggregering och nedsatt clearance vilket resulterar i neurotoxicitet1, 2. de exakta mekanismerna bakom sjukdomen patologin trots välkarakteriserad associationen mellan Aβ-aggregat och AD3, inte är förstådda4. Ökande bevis föreslår att neurovaskulära underskott spelar en roll i progression och svårighetsgraden av AD5, som Aβ interagerar direkt med komponenter av cirkulationssystemet6. Aβ har en hög affinitet interaktion med fibrinogen7,8, som också lokaliserar till Aβ avlagringar i både AD patienter och mus modeller9,10,11. Dessutom inducerar Aβ-fibrinogen interaktionen onormal fibrin-koagelbildning och struktur, samt resistens mot fibrinolys9,12. En terapeutisk möjlighet vid behandling av AD, är att lindra cirkulatoriska underskott genom att hämma interaktionen mellan Aβ och fibrinogen13,14. Vi identifierade därför flera små föreningar att hämma den Aβ-fibrinogen interaktion med hög genomströmning screening och läkemedelskemi metoder13,14. För att testa effekten av Aβ-fibrinogen interaktion hämmare, optimerad vi två metoder för analys av in vitro- fibrin koagelbildning: koagulera grumlighet assay och scanning electron microscopy (SEM)14.
Clot grumlighet analysen är en enkel och snabb metod för att övervaka fibrin koagelbildning med hjälp av UV-synliga spektroskopi. Som fibrin koagel former, ljus är alltmer utspridda och turbiditeten av lösningen ökar. Omvänt, när Aβ är närvarande, fibrin koagel struktur ändras och turbiditeten av blandningen minskar (figur 1). Effekten av hämmande föreningar kan bedömas för potential att återställa propp turbiditet från Aβ-inducerad avvikelser. Medan grumlighet analysen möjliggör snabb analys av flera villkor, ger det begränsad information på propp form och struktur. SEM, där topografin av fasta föremål avslöjas av elektron probe, möjliggör analys av 3D arkitekturen av koagel15,16,17,18 och bedömningen av hur förekomsten av Aβ och / eller hämmande substanser förändrar det struktur9,14. Både spektrometri och SEM är klassiskt laboratorietekniker som har använts för olika ändamål, exempelvis spektrofotometri används för övervakning av amyloid aggregering19,20. Likaså används SEM också för att analysera fibrin koagel bildas av plasma från Alzheimer, Parkinson och tromboembolisk stroke patienter21,22,23. De protokoll som presenteras här är optimerade för att bedöma fibrin-koagelbildning i ett reproducerbart och snabbt sätt.
Följande protokoll finns instruktioner för beredning av ett in vitro- fibrin-clot både med och utan Aβ. Det Detaljer också metoder för att analysera effekten av Aβ fibrin koagelbildning och struktur. Effektiviteten hos dessa två metoder för att mäta hämning av Aβ-fibrinogen interaktionen demonstreras med TDI-2760, en litet hämmande förening14. Dessa metoder, möjliggör både individuellt och tillsammans, snabb och enkel analys av in vitro- fibrin koagelbildning.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fibriogen, Plasminogen-Depleted, Plasma</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>341578</td>
			<td>keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-Amyloid (1-42), Human</td>
			<td>Anaspec</td>
			<td>AS-20276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from human plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>105228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTERED</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>C70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Syringe, 0.2&#181;M, 25mm</td>
			<td>Pall</td>
			<td>4612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia.</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLVV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat Bottom</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>21377203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectramax Plus384</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>89212-396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, 5417R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 200 Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>15-337-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Rotator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>2314-1CEQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spare washers for cover slip holder</td>
			<td>Tousimis</td>
			<td>8766-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow Stem Pipets - Sedi-Pet</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>70967-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample holder for CPD (Cover slip holder)</td>
			<td>Tousimis</td>
			<td>8766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mount Holder Box, Pin Type</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>76610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round glass cover slides (12 mm)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>16120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Cacodylate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM Stubs, Tapered end pin.</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>75192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm OD</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16084-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosamdri-815 Critical Point Dryer with Gold/Palladium target</td>
			<td>Tousimis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denton Desk IV Coater</td>
			<td>Denton Vacuum</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leo 1550 FE-SEM</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smart SEM Software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of &#946;-amyloid-induced abnormalities on fibrin clot structure by spectroscopy and scanning electron microscopy

Denna artikel presenterar metoder för att generera i vitro fibrin blodproppar och analysera effekten av beta-amyloid (Aβ) protein på koagelbildning och struktur av spektrometri och svepelektronmikroskopi (SEM). Aβ, som bildar neurotoxiska amyloid aggregat i Alzheimers sjukdom (AD), har visats interagera med fibrinogen. Denna Aβ-fibrinogen interaktion gör fibrin koagel strukturellt avvikande och resistenta mot fibrinolys. Aβ-inducerad avvikelser i fibrin koagulering kan också bidra till cerebrovaskulär aspekter av AD patologin såsom microinfarcts, inflammation, liksom, cerebral amyloid angiopati (CAA). Tanke på potentiellt kritiska rollen av neurovaskulära underskott i AD patologi, har utveckla föreningar som kan hämma eller minska Aβ-fibrinogen interaktionen lovande terapeutiskt värde. In vitro metoder genom vilka fibrin koagelbildning kan enkelt och systematiskt utvärderas är potentiellt användbara verktyg för att utveckla terapeutiska föreningar. Presenteras här är en optimerad protokoll för in vitro- generation av fibrin koagel, samt analys av effekten av Aβ och Aβ-fibrinogen interaktion hämmare. Clot grumlighet analysen är snabb, mycket reproducerbara och kan användas för att testa flera villkor samtidigt, vilket möjliggör screening av stora antal av Aβ-fibrinogen-hämmare. Hit föreningar från denna screening kan utvärderas ytterligare för sin förmåga att lindra Aβ-inducerad strukturella avvikelser av fibrin clot arkitektur med hjälp av SEM. Effektiviteten av dessa optimerade protokoll framgår här använder TDI-2760, en nyligen identifierade Aβ-fibrinogen interaktion hämmare.

In vitro- koagulation (grumlighet) analys klyver av enzymet trombin fibrinogen, vilket resulterar i bildandet av fibrin nätverk24. Detta fibrin koagelbildning orsakar spridning av det ljus som passerar genom den lösningen, vilket resulterar i ökad grumlighet (figur 1), plateauing före utgången av perioden läsning (figur 2, grön). När fibrinogen var inkuberas i närvaro av Aβ42, turbiditet...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of ÃŽÂ²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analys av β-Amyloid-inducerad avvikelser på Fibrin Clot struktur av spektroskopi och svepelektronmikroskopi

Presenteras här är två metoder som kan användas enskilt eller i kombination för att analysera effekten av beta-amyloid på fibrin clot struktur. Inkluderat är ett protokoll för att skapa en in vitro- fibrin clot, följt av koagel grumlighet och scanning electron microscopy metoder.

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Den största fördelen med denna platta-baserade grumlighet analys är att det är snabbt och möjliggör flera amyloid-beta fibrinogen interaktionshämmare som skall screenas på en gång utan sofistikerade setup eller krav. Huvudet föreningar som är i fibrin grumlighet analysen kan utvärderas ytterligare för deras förmåga att återställa A-beta-inducerad strukturella abnormitet i fibrin blodproppar analyseras genom att skanna elektronmikroskopi. Visuell demonstration av propppreparation för svepelektronmikroskopianalys är kritisk då eventuella variationer i preparatet kan bidra till variationer inom de experimentella resultaten.Fokus för denna demonstration här är på A-beta fibrinogen interaktioner. Detta protokoll kan lätt modifieras för att analysera andra interaktioner med andra proteiner och föreningarna med fibrinkoagel. Börja med att lägga till 1,5 mikromolar av nyberedda fibrinogen i 200 mikroliter av clot formation buffert till varje A-beta negativ 42 som innehåller och styr brunnar och inkubera plattan på en roterande plattform vid rumstemperatur.Efter 30 minuter samtidigt lägga 30 mikroliter av nyberedda trombinlösning direkt i centrum av fibrinogen-innehållande väl att inleda proppbildning och omedelbart läsa absorbansen av in vitro-proppar vid 350 nanometer, upprepa mätningen var 30 till 60 sekunder under loppet av 10 minuter. För att utvärdera effekten av A-beta fibrinogen interaktionshämmare på fibrin clot struktur, först använda forceps att placera rena, 12 millimeter siliconized glas cirkel täcka glider till enskilda brunnar av en 12 brunnsplatta och tillsätt 80 mikroliter fibrinogen på varje täcka slip, försiktigt sprida lösningen så att de är jämnt fördelade. Tillsätt 20 mikroliter av trombinlösning till varje brunn för att initiera proppbildning.Täck plattan för en 30 till 60 minuters inkubering vid rumstemperatur, sedan försiktigt doppa varje propp i två milliliter iskall natrium cacodylat buffert i två minuter, täckt, vid rumstemperatur två gånger, med hjälp av en milliliter pipett för att försiktigt ta bort bufferten efter varje tvätt. Efter den sista tvätten, kontrollera status för proppbildningen på täcksligen och fixera propparna i två till tre milliliter iskall 2%glutaraldehyd på is i 30 minuter. I slutet av inkubationen, försiktigt bort glutaraldehyd från varje brunn och tvätta blodproppar med färsk natrium cacodylat buffert som visas på is.För att hydrera de fasta blodpropparna i en graderad serie av fem minuters iskall etanol tvättar på is utan att helt ta bort etanol mellan tvättarna för att hålla blodproppar skyddade från luftexponering. Under den senaste 100%etanol tvätt, överför locket glider in i en kritisk punkt torktumlare provhållare, placera minst 1 bricka mellan varje täcksli och placera hållaren i en kritisk punkt torkkammare fylld med etanol. Efter en 30 minuters torkningscykel, använd koltejp för att montera täcksliorna på enskilda svepelektronmikroskopist och överför proverna till sputterbeläggningskammaren på en vakuumsputterrockare.Sedan sputter päls mindre än 20 nanometer guld palladium eller andra ledande material på proverna i 25 sekunder vid fyra ångström per sekund och bild proverna på en scanning elektronmikroskop utrustad med en typ två sekundära elektroner detektor på fyra kilovolt. Fibrin clot bildning orsakar spridning av ljuset som passerar genom lösningen, vilket resulterar i en ökad grumlighet som platåer i slutet av läsperioden. När fibrinogen inkuberas i närvaro av A-beta 42 minskar grumligheten i lösningen med kurvan når en maximal höjd av ungefär hälften av fibrinogen ensam.I närvaro av en A-beta 42 interaktionsblockerare är effekten av beta-amyloid ameliorated och grumligheten är högre än den med A-beta ensam. Effekten av blockeraren visas inte på grund av bakgrundsturbiditet eftersom föreningen inte ändrar fibrinkoagula grumlighet när A-beta är frånvarande. Vidare visar proppbildning i närvaro av GPRP, en peptid som är känd för att störa fibrinpolymerisering, en signifikant minskad grumlighet jämfört med fibrin clot-formationen i frånvaro av inhibitorn.Fibrinogen som genereras i närvaro av trombin och kalciumklorid bildar endast ett fibrinnät med avlånga och intercalated trådar av fibrin samt större buntar. När A-beta är närvarande, fibrin trådarna blev tunnare med flera klibbiga klumpar i aggregat, som anger A-beta inducerad strukturella avvikelser. Överensstämmer med grumlighetsanalysresultaten, koagelbildning i närvaro av en A-beta fibrinogen interaktionsblockerare delvis återställer strukturen av fibrin clot från de A-beta-inducerad förändringar som färre klumpar observeras med denna behandling.Protokollen för koagelturbiditetsanalys och svepelektronmikroskopanalys har optimerats för utvärdering av flera A-beta fibrinogeninteraktionshämmare på ett snabbt och reproducerbart sätt. Och snart data kommer att ge värdefull information om fibrin clot bildning som kan tillämpas på ytterligare studier både in vitro och in vivo.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Metod för att visualisera och analysera membraninteragerande proteiner genom transmissionselektronmikroskopi

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Högupplösande enkelpartikelanalys från elektronkryo-mikroskopi bilder med hjälp av SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Halvautomatisk Biopanning bakteriell Display bibliotek för peptid affinitet reagens identifiering och analys av resulterande isolat

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems

Variationer på negativa fläcken elektronmikroskopi metoder: verktyg för att hantera utmanande system

Negative stain electron microscopy (EM) allows relatively simple and quick observation of macromolecules and macromolecular complexes through the use of ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

Analysera dynamiska proteinkomplex monterat på och släppt från Biolayer interferometri Biosensor med hjälp av masspektrometri och elektronmikroskopi

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Mitokona-och endoplasmatiska Retikulum avbildning av korrelat ljus och Volymelektronmikroskopi

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Tvärgående sektionering av moget ris (Oryza sativa L.) Kärnor för skanning av elektronmikroskopiavbildning med pipettespetsar som immobiliseringsstöd

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Encellsanalys av transkriptionellt aktiva alleler med enmolekylig FISK

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Single Particle Cryo-Electron Mikroskopi: Från prov till struktur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Mikropapper transmission elektronmikroskopinät till direkt cellpositionering inom arbetsflöden för hela cell cryo-elektrontomografi

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...