Name: analysis of &#946;-amyloid-induced abnormalities on fibrin clot structure by spectroscopy and scanning electron microscopy
Uploaded: 2018-11-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of ÃŽÂ²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Yazarlar Masanori Kawasaki, Kazuyoshi Aso ve Michael Foley Tri-Kurumsal Therapeutics Discovery Enstitüsü (TDI), New York Aβ-fibrinojen etkileşim inhibitörleri sentezi için ve onların değerli öneriler teşekkür. Yazarlar ayrıca Üyeler Strickland laboratuarının yararlı tartışma için teşekkür ederiz. Bu eser NIH grant NS104386, Alzheimer ilaç keşif Vakfı ve Robertson terapötik Geliştirme Fonu tarafından H.A. için NIH NS50537, Tri-Kurumsal Therapeutics Discovery Enstitüsü, Alzheimer'ın uyuşturucu keşif Vakfı Hibe desteklenmiştir, Rudin Aile Vakfı ve John A. Herrmann S.S. için

1. hazırlanması Aβ42 ve fibrinojen analizi için
<ol><li>Liyofilize toz üzerinden monomeric Aβ42 hazırlamak<ol>
<li>1500 x g 30 için de aşağı Aβ42 toz oda sıcaklığında ve spin sıcak s.</li>
		<li>Buz gibi hexafluoroisopropanol (HFIP) 100 µL 0.5 mg Aβ42 tozu ekleyin ve buz üzerinde 30 dk için kuluçkaya. Dikkat: HFIP ele alırken dikkatli olun ve kimyasal bir mahallede tüm adımları gerçekleştirin.</li>
		<li>20 µL aliquots ve kuru kimyasal başlıklı 2-3 h. filmleri filmleri hava-ebilmek va...

<ol>
	<li>Selkoe, D. J., Schenk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease:+molecular+understanding+predicts+amyloid-based+therapeutics.">Alzheimer's disease: molecular understanding predicts amyloid-based therapeutics.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 43, 545-584 (2003).</li><li>Kurz, A., Perneczky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+clearance+as+a+treatment+target+against+Alzheimer's+disease.">Amyloid clearance as a treatment target against Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 24, 61-73 (2011).</li><li>Benilova, I., Karran, E., De Strooper, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+toxic+Abeta+oligomer+and+Alzheimer's+disease:+an+emperor+in+need+of+clothes.">The toxic Abeta oligomer and Alzheimer's disease: an emperor in need of clothes.</a> Nature Neuroscience. 15 (3), 349-357 (2012).</li><li>Karran, E., Hardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critique+of+the+drug+discovery+and+phase+3+clinical+programs+targeting+the+amyloid+hypothesis+for+Alzheimer+disease.">A critique of the drug discovery and phase 3 clinical programs targeting the amyloid hypothesis for Alzheimer disease.</a> Annals of Neurology. 76 (2), 185-205 (2014).</li><li>Yoshikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+cerebral+blood+flow+in+Alzheimer+disease+and+vascular+dementia.">Heterogeneity of cerebral blood flow in Alzheimer disease and vascular dementia.</a> AJNR, American Journal of Neuroradiology. 24 (7), 1341-1347 (2003).</li><li>Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+will+out:+vascular+contributions+to+Alzheimer's+disease.">Blood will out: vascular contributions to Alzheimer's disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (2), 556-563 (2018).</li><li>Ahn, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease+peptide+beta-amyloid+interacts+with+fibrinogen+and+induces+its+oligomerization.">Alzheimer's disease peptide beta-amyloid interacts with fibrinogen and induces its oligomerization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21812-21817 (2010).</li><li>Zamolodchikov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+structural+analysis+of+the+interaction+between+beta-amyloid+and+fibrinogen.">Biochemical and structural analysis of the interaction between beta-amyloid and fibrinogen.</a> Blood. 128 (8), 1144-1151 (2016).</li><li>Cortes-Canteli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrinogen+and+beta-amyloid+association+alters+thrombosis+and+fibrinolysis:+a+possible+contributing+factor+to+Alzheimer's+disease.">Fibrinogen and beta-amyloid association alters thrombosis and fibrinolysis: a possible contributing factor to Alzheimer's disease.</a> Neuron. 66 (5), 695-709 (2010).</li><li>Cortes-Canteli, M., Mattei, L., Richards, A. T., Norris, E. H., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+deposited+in+the+Alzheimer's+disease+brain+promotes+neuronal+degeneration.">Fibrin deposited in the Alzheimer's disease brain promotes neuronal degeneration.</a> Neurobiology of Aging. 36 (2), 608-617 (2015).</li><li>Liao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+characterization+of+postmortem+amyloid+plaques+isolated+by+laser+capture+microdissection.">Proteomic characterization of postmortem amyloid plaques isolated by laser capture microdissection.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 37061-37068 (2004).</li><li>Zamolodchikov, D., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abeta+delays+fibrin+clot+lysis+by+altering+fibrin+structure+and+attenuating+plasminogen+binding+to+fibrin.">Abeta delays fibrin clot lysis by altering fibrin structure and attenuating plasminogen binding to fibrin.</a> Blood. 119 (14), 3342-3351 (2012).</li><li>Ahn, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Abeta-fibrinogen+interaction+inhibitor+rescues+altered+thrombosis+and+cognitive+decline+in+Alzheimer's+disease+mice.">A novel Abeta-fibrinogen interaction inhibitor rescues altered thrombosis and cognitive decline in Alzheimer's disease mice.</a> The Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1049-1062 (2014).</li><li>Singh, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminopyrimidine+Class+Aggregation+Inhibitor+Effectively+Blocks+Abeta-Fibrinogen+Interaction+and+Abeta-Induced+Contact+System+Activation.">Aminopyrimidine Class Aggregation Inhibitor Effectively Blocks Abeta-Fibrinogen Interaction and Abeta-Induced Contact System Activation.</a> Biochemistry. 57 (8), 1399-1409 (2018).</li><li>Pretorius, E., Mbotwe, S., Bester, J., Robinson, C. J., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+induction+of+anomalous+and+amyloidogenic+blood+clotting+by+molecular+amplification+of+highly+substoichiometric+levels+of+bacterial+lipopolysaccharide.">Acute induction of anomalous and amyloidogenic blood clotting by molecular amplification of highly substoichiometric levels of bacterial lipopolysaccharide.</a> Journal of the Royal Society Interface. 13 (122), (2016).</li><li>Veklich, Y., Francis, C. W., White, J., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+studies+of+fibrinolysis+by+electron+microscopy.">Structural studies of fibrinolysis by electron microscopy.</a> Blood. 92 (12), 4721-4729 (1998).</li><li>Weisel, J. W., Nagaswami, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+modeling+of+fibrin+polymerization+kinetics+correlated+with+electron+microscope+and+turbidity+observations:+clot+structure+and+assembly+are+kinetically+controlled.">Computer modeling of fibrin polymerization kinetics correlated with electron microscope and turbidity observations: clot structure and assembly are kinetically controlled.</a> Biophysical Journal. 63 (1), 111-128 (1992).</li><li>Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+clots+are+equilibrium+polymers+that+can+be+remodeled+without+proteolytic+digestion.">Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion.</a> Scientific Reports. 2, 879 (2012).</li><li>Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+amyloid+beta-peptide+(Abeta)+aggregation+using+the+Congo+red-Abeta+(CR-abeta)+spectrophotometric+assay.">Quantifying amyloid beta-peptide (Abeta) aggregation using the Congo red-Abeta (CR-abeta) spectrophotometric assay.</a> Analytical Biochemistry. 266 (1), 66-76 (1999).</li><li>Zhao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+amyloid+formation+by+turbidity+assay-seeing+through+the+cloud.">Measurement of amyloid formation by turbidity assay-seeing through the cloud.</a> Biophysical Reviews. 8 (4), 445-471 (2016).</li><li>Bester, J., Soma, P., Kell, D. B., Pretorius, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+and+ultrastructural+characteristics+of+whole+blood+and+plasma+in+Alzheimer-type+dementia,+and+the+possible+role+of+bacterial+lipopolysaccharides+(LPS).">Viscoelastic and ultrastructural characteristics of whole blood and plasma in Alzheimer-type dementia, and the possible role of bacterial lipopolysaccharides (LPS).</a> Oncotarget. 6 (34), 35284-35303 (2015).</li><li>Pretorius, E., Page, M. J., Mbotwe, S., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-binding+protein+(LBP)+can+reverse+the+amyloid+state+of+fibrin+seen+or+induced+in+Parkinson's+disease.">Lipopolysaccharide-binding protein (LBP) can reverse the amyloid state of fibrin seen or induced in Parkinson's disease.</a> PLoS One. 13 (3), e0192121 (2018).</li><li>Kell, D. B., Pretorius, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+behaving+badly.+Substoichiometric+molecular+control+and+amplification+of+the+initiation+and+nature+of+amyloid+fibril+formation:+lessons+from+and+for+blood+clotting.">Proteins behaving badly. Substoichiometric molecular control and amplification of the initiation and nature of amyloid fibril formation: lessons from and for blood clotting.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 123, 16-41 (2017).</li><li>Wolberg, A. S., Campbell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombin+generation,+fibrin+clot+formation+and+hemostasis.">Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis.</a> Transfusion and Apheresis Science. 38 (1), 15-23 (2008).</li><li>Soon, A. S., Lee, C. S., Barker, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+fibrin+matrix+properties+via+knob:hole+affinity+interactions+using+peptide-PEG+conjugates.">Modulation of fibrin matrix properties via knob:hole affinity interactions using peptide-PEG conjugates.</a> Biomaterials. 32 (19), 4406-4414 (2011).</li></ol>

Burada açıklanan yöntemleri fibrin pıhtısı oluşumu vitrodeğerlendirilmesi için tekrarlanabilir ve hızlı bir yol sağlar. Ayrıca, sistem sadeliği Aβ fibrin pıhtısı oluşumu ve yapısı nispeten düz ileri etkilemesi yorumu yapar. Bu laboratuar önceki yayında, bu deneyleri bileşikler Aβ-fibrinojen etkileşim13,14etkisizleştirmek yeteneklerini için test etmek için kullanılabilir gösterildi. Bu iki deneyleri kullanılarak, bir dizi ...

Alzheimer hastalığı (Ah), yaşlı hastalarda bilişsel gerileme önde gelen bir nörodejeneratif hastalık çoğunlukla anormal beta-amiloid (Aβ) ifade, toplama ve engelli izni nörotoksisite1', kaynaklanan kaynaklanmaktadır 2. Aβ toplamları ve reklam3arasında iyi karakterize derneğin rağmen altta yatan hastalık patoloji kesin mekanizmaları iyi anlaşılan4değildir. Aβ doğrudan6dolaşım sistemi bileşenleriyle etkileşimli çalışır gibi öneriyor kanıt artan nörovasküler açıkları ilerleme ve reklam5, şiddeti bir rol oynamaktadır. Aβ da reklam hastalar ve fare modelleri9,10,11Aβ yataklarında yerelleştirir fibrinojen7,8, yüksek-benzeşme etkileşim vardır. Ayrıca, Aβ-fibrinojen etkileşim anormal fibrin pıhtısı oluşumu ve yapısı, aynı zamanda direnç fibrinolitik9,12neden olmaktadır. Reklam, tedavisinde bir tedavi imkanı hafifletilmesi dolaşım açıkları Aβ ve fibrinojen13,14arasındaki etkileşimi engelleyerek. Biz, bu nedenle, birkaç küçük bileşikler yüksek aktarım tarama ve tıbbi Kimya yaklaşımlar13,14kullanarak Aβ-fibrinojen etkileşim inhibe tespit. Aβ-fibrinojen etkileşim inhibitörleri etkinliğini test etmek için biz iki yöntem vitro fibrin pıhtısı oluşumu analizi için en iyi duruma getirilmiş: pıhtısı bulanıklık tahlil ve Tarama elektron mikroskobu (SEM)14.
Pıhtı bulanıklık tahlil fibrin pıhtısı oluşumu UV-görünür spektroskopi kullanarak izlemek için düz ileri ve hızlı bir yöntemdir. Fibrin pıhtısı formlar, ışık giderek dağınık ve çözüm bulanıklık artar. Diğer taraftan, Aβ olmadığı durumlarda, fibrin pıhtısı yapısı değişmiş ve karışım bulanıklık azalır (Şekil 1). İnhibitör bileşiklerin etkisi pıhtı bulanıklık Aβ kaynaklı anormallikler geri yüklemek için potansiyel için tespit edilebilir. Bulanıklık tahlil birden çok koşul hızlı analiz için izin verirken, pıhtı şekli ve yapısı üzerinde sınırlı bilgi sağlar. SEM, katı cisimlerin topografya elektron sonda tarafından kendiliğinden ortaya sağlar pıhtı15,16,17,18 3D Mimarlık ve nasıl bir değerlendirme analizi için Aβ varlığı ve / veya inhibitör bileşikler o yapısı9,14değiştirir. Her iki spektrometresi ve SEM çeşitli amaçlar için kullanılan klasik laboratuvar teknikleri vardır, mesela spectrophotometry amiloid toplama19,20izlenmesi için kullanılır. Benzer şekilde, SEM Ayrıca Parkinson ve tromboembolik inme hastalarında21,22,23Alzheimer, plazma oluşan fibrin pıhtısı analiz etmek için kullanılır. Burada sunulan protokolleri fibrin pıhtısı oluşumu tekrarlanabilir ve hızlı bir şekilde değerlendirmek için optimize edilmiştir.
Aşağıdaki iletişim kuralı bir vitro fibrin-pıhtı ile ve ezelî Aβ hazırlanması için yönergeler sağlar. Ayrıca fibrin pıhtısı oluşumu ve yapısı üzerinde Aβ etkisini analiz yöntemleri ayrıntıları. Aβ-fibrinojen etkileşim inhibisyonu ölçmek için bu iki yöntem etkinliğini TDI-2760, küçük bir inhibitör bileşik14kullanarak gösterilmiştir. Bu yöntemler, ayrı ayrı ve birlikte, hızlı ve basit bir analiz vitro fibrin pıhtısı oluşumu için olanak sağlar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fibriogen, Plasminogen-Depleted, Plasma</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>341578</td>
			<td>keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-Amyloid (1-42), Human</td>
			<td>Anaspec</td>
			<td>AS-20276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from human plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>105228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTERED</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>S271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>C70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Syringe, 0.2&#181;M, 25mm</td>
			<td>Pall</td>
			<td>4612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia.</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLVV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat Bottom</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>21377203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectramax Plus384</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>89212-396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, 5417R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson 200 Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>15-337-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Rotator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>2314-1CEQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spare washers for cover slip holder</td>
			<td>Tousimis</td>
			<td>8766-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow Stem Pipets - Sedi-Pet</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>70967-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample holder for CPD (Cover slip holder)</td>
			<td>Tousimis</td>
			<td>8766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mount Holder Box, Pin Type</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>76610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round glass cover slides (12 mm)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>16120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Cacodylate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM Stubs, Tapered end pin.</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>75192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm OD</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>16084-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosamdri-815 Critical Point Dryer with Gold/Palladium target</td>
			<td>Tousimis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denton Desk IV Coater</td>
			<td>Denton Vacuum</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leo 1550 FE-SEM</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smart SEM Software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of &#946;-amyloid-induced abnormalities on fibrin clot structure by spectroscopy and scanning electron microscopy

Bu makale in vitro fibrin pıhtısı oluşturma ve beta-amiloid (Aβ) protein pıhtı oluşumu ve yapısı üzerinde etkisi spektrometresi tarafından analiz ve elektron mikroskobu (SEM) tarama yöntemleri sunar. Aβ nörotoksik amiloid toplamları Alzheimer hastalığı içinde (Ah) formları, fibrinojen ile etkileşim göstermiştir. Bu Aβ-fibrinojen etkileşim fibrin pıhtısı yapısal anormal ve fibrinolitik dayanıklı yapar. Fibrin pıhtılaşma bozuklukları Aβ kaynaklı Ayrıca serebrovasküler yönleri gibi microinfarcts, reklam patoloji ile katkıda inflamasyonu yanı sıra, serebral amiloid angiopathy (CAA). Nörovasküler açıkları potansiyel olarak kritik rolü AD patolojisi göz önüne alındığında, inhibe veya Aβ-fibrinojen etkileşimi azaltmak bileşikleri gelişmekte umut verici tedavi değeri vardır. Kolayca ve sistematik olarak tarafından hangi fibrin pıhtısı oluşumu tespit edilebilir vitro terapötik bileşiklerin geliştirmek için potansiyel olarak yararlı araçlar yöntemlerdir. Burada sunulan bir en iyi duruma getirilmiş Aβ ve Aβ-fibrinojen etkileşim inhibitörleri etkisini analiz yanı sıra fibrin pıhtısı vitro nesil için iletişim kuralıdır. Pıhtı bulanıklık tahlil hızlı, son derece tekrarlanabilir ve aynı anda birden çok koşul sınamak için Aβ-fibrinojen inhibitörleri çok sayıda tarama için izin kullanılabilir. Bu tarama hit bileşikleri yeteneklerini Aβ kaynaklı yapısal anormallikler SEM kullanarak fibrin pıhtısı mimarisinin iyileştirmek için daha fazla değerlendirilebilir Bu en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralları etkinliği burada TDI-2760, yakın zamanda belirlenen Aβ-fibrinojen etkileşim inhibitörü kullanarak gösterilmiştir.

(Bulanıklık) tahlil pıhtılaşma vitro , fibrinojen, fibrin ağı24oluşumunda kaynaklanan enzim Trombin cleaves. Bu fibrin pıhtısı oluşumu artan bulanıklık (Şekil 1), (Şekil 2, yeşil) okuma süreniz bitmeden karıştırmadan sonuçlanan çözüm, buradan geçen ışık saçılma neden olur. Fibrinojen Aβ42 huzurunda inkübe zaman çözüm bulanıklık azalmıştır, kabaca yarısı m...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of ÃŽÂ²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

β-amiloid-indüklenen anormallikler Fibrin pıhtısı yapısına spektroskopisi ve elektron mikroskobu tarama Analizi

Burada sunulan tek tek veya birlikte fibrin pıhtısı yapısı üzerinde beta-amiloid etkisini analiz için kullanılan iki yöntem vardır. Vitro fibrin pıhtısı oluşturma takip için pıhtı bulanıklık ve Tarama elektron mikroskobu ile yöntemleri dahil bir protokoldür.

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Bu plaka tabanlı bulanıklık testinin en büyük avantajı hızlı olması ve birkaç amiloid-beta fibrinojen etkileşim inhibitörlerinin gelişmiş kurulum veya gereksinimler olmadan aynı anda taranmasını sağlamasıdır. Fibrin türbiditesi testinde bulunan kafa bileşikleri, elektron mikroskobu taranarak analiz edilen fibrin pıhtılarında A-beta kaynaklı yapısal anormalliği geri getirme yetenekleri açısından daha fazla değerlendirilebilir. Taramalı elektron mikroskobu analizi için pıhtı hazırlığının görsel gösterimi, hazırlıktaki herhangi bir varyasyonun deneysel sonuçlardaki varyasyonlara katkıda bulunabileceğinden kritik öneme yöneliktir.Bu gösterinin odak noktası A-beta fibrinojen etkileşimleridir. Bu protokol kolayca fibrin pıhtısı ile diğer proteinler ve bileşikler ile diğer etkileşimleri analiz etmek için değiştirilebilir. Her A-beta negatif 42 içeren ve kontrol kuyuları içeren ve kontrol kuyuları ve oda sıcaklığında dönen bir platform üzerinde plaka kuluçka ya da pıhtı oluşumu tampon 200 mikrolitre taze hazırlanmış fibrinojen 1.5 mikromolar ekleyerek başlayın.30 dakika sonra aynı anda pıhtı oluşumunu başlatmak için doğrudan fibrinojen içeren kuyunun merkezine taze hazırlanmış trombin çözeltisi 30 mikrolitre ekleyin ve hemen 350 nanometre de in vitro pıhtıların emici okuyun, 10 dakika boyunca her 30 ila 60 saniyede bir ölçüm tekrarlayın. A-beta fibrinojen etkileşim inhibitörlerinin fibrin pıhtı yapısı üzerindeki etkisini değerlendirmek için, ilk olarak temiz, 12 milimetre silikonlu cam daire kapağını 12 kuyunun ayrı kuyularına yerleştirmek için forseps kullanın ve her kapak kapağına 80 mikrolitre fibrinojen ekleyerek çözeltiyi eşit olarak dağıtılır. Pıhtı oluşumunu başlatmak için her kuyuya 20 mikrolitre trombin çözeltisi ekleyin.Oda sıcaklığında 30 ila 60 dakikalık bir kuluçka için plakayı kapatın, sonra her pıhtıyı iki mililitre buz gibi sodyum kacodylate tamponuna iki dakika batırın, oda sıcaklığında iki kez, her yıkamadan sonra tamponu dikkatlice çıkarmak için bir mililitrelik pipet kullanın. Son yıkamadan sonra, kapak kayma pıhtı oluşumudurumunu kontrol edin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde buz üzerinde buz üzerinde 2-3 mililitre buz pıhtıları düzeltmek. Kuluçka sonunda, yavaşça her kuyudan glutaraldehit kaldırmak ve taze sodyum kacodylate tampon ile pıhtıyı yıkayın buz üzerinde gösterildiği gibi.Beş dakikalık buz gibi etanol bir dereceli serisi sabit pıhtıları nemlendirmek için tamamen pıhtıları hava maruz kalma dan korumak için yıkayımı arasında etanol çıkarmadan buz üzerinde yıkarsın. Son %100 etanol yıkama sırasında, kapak kaydığı kritik bir nokta kurutucu numune tutucuya aktarın, her kapak fişi arasına en az 1 yıkayacak makinesi yerleştirin ve tutucuyu etanol dolu kritik bir nokta kurutucu haznesine yerleştirin. 30 dakikalık bir kurutma döngüsünden sonra, tek tek taramalı elektron mikroskobu koçanları üzerine kapak fişleri monte etmek için karbon bandı kullanın ve örnekleri vakum püskürtücü kaplama odasına aktarın.Daha sonra 20 nanometreden daha az altın paladyum veya diğer iletken malzemelerin numuneler üzerine saniyede dört angstrom'da 25 saniye boyunca fışkırtMası ve numuneleri dört kilovoltta tip iki ikincil elektron dedektörü ile donatılmış bir tarama elektron mikroskobu üzerinde görüntüle. Fibrin pıhtı oluşumu çözeltiden geçen ışığın saçılmasına neden olur ve okuma döneminin sonunda yaylaların bulanıklıkta artışa yol açar. Fibrinojen A-beta 42 varlığında inkübe edildiğinde çözeltinin bulanıklığı eğrinin sadece fibrinojenin yaklaşık yarısı kadar maksimum yüksekliğe ulaşmasıyla azalır.Bir A-beta 42 etkileşim blokeri varlığında beta-amiloid etkisi iyilenir ve bulanıklık sadece A-beta ile daha yüksektir. A-beta olmadığında bileşiği fibrin pıhtı bulanıklığını değiştirmediği için blokerin etkisi arka plan bulanıklığı ndan dolayı görünmez. Ayrıca, GPRP varlığında pıhtı oluşumu, fibrin polimerizasyonu ile müdahale bilinen bir peptid, inhibitörü yokluğunda fibrin pıhtı oluşumuna göre önemli ölçüde azaltılmış bulanıklık göstermektedir.Trombin ve kalsiyum klorür varlığında üretilen fibrinojen sadece fibrin uzun ve intercalated iplikleri yanı sıra daha büyük demetleri ile bir fibrin mesh oluşturur. A-beta mevcut olduğunda, fibrin iplikleri agregalarda birkaç yapışkan kümeler ile ince oldu, A-beta indüklenen yapısal anormallikleri gösteren. Bulanıklık tahsin sonuçları ile tutarlı olarak, Bir A-beta fibrinojen etkileşim bloker varlığında pıhtı oluşumu kısmen daha az kümeleri bu tedavi ile gözlenen olarak A-beta kaynaklı değişikliklerden fibrin pıhtı yapısını geri.Pıhtı bulanıklığı testi ve taramalı elektron mikroskobu analiz protokolleri, birkaç A-beta fibrinojen etkileşim inhibitörünü hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde değerlendirmek için optimize edilmiştir. Ve yakında veriler hem in vitro hem de in vivo ileri çalışmalara uygulanabilecek fibrin pıhtı oluşumu hakkında değerli bilgiler sağlayacaktır.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Yöntem gözünüzde canlandırın ve Transmisyon Elektron Mikroskobu Membran Etkileşen Proteinler Analiz için

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

SPHIRE Kullanılarak Elektron Kriyo-mikroskopi Görüntülerinden Yüksek Çözünürlüklü Tek Parçacık Analizi

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Peptid benzeşme reaktif keşif ve elde edilen yalıtır analizi için bakteriyel ekran kütüphanelerin yarı otomatik Biopanning

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems

Negatif varyasyonlarında leke elektron mikroskobu yöntemleri: sistemleri zorlu mücadele için Araçlar

Negative stain electron microscopy (EM) allows relatively simple and quick observation of macromolecules and macromolecular complexes through the use of ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

Dinamik Protein kompleksleri analiz monte ve kütle spektrometresi ve Elektron Mikroskopisi kullanılarak Biolayer Interferometry biyoalgılayıcı--dan serbest bırakmak

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Göreli ışık ve hacim elektron mikroskobu ile mitokondri ve endoplazmik reticulum görüntüleme

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Olgun Pirincin Enine Kesiti (Oryza sativa L.) Hareketsizleştirme Desteği Olarak Pipet İpuçlarını Kullanarak Elektron Mikroskopi Görüntülemesini Taramak için Çekirdekler

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Transkripsiyonel Aktif Alellerin Tek Molekül FISH ile Tek Hücre Analizi

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskopisi: Numuneden Yapıya

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Tüm Hücreli Kriyo-Elektron Tomografi İş Akışlarında Doğrudan Hücre Konumlandırmasına Mikropatterning İletim Elektron Mikroskopi Izgaraları

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...