Name: preparation of acute spinal cord slices for whole-cell patch-clamp recording in substantia gelatinosa neurons
Uploaded: 2019-01-18T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons at JoVE.com

وأيد هذا العمل المنح المقدمة من "مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية" (رقم 81560198، 31660289).

ووافق جميع البروتوكولات التجريبية ووصف "الحيوان الأخلاقيات اللجنة من نانتشانغ الجامعة" (نانتشانغ، الصين للعلاقات العامة، والأخلاقية No.2017-010). قدمت جميع الجهود المبذولة للتقليل من الإجهاد والألم من الحيوانات التجريبية. وأجريت التسجيلات الكهربية تؤدي هنا في درجة حرارة الغرفة (RT، 22-25 درجة م?...

<ol>
	<li>Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+circuitry+for+pain+processing+in+the+dorsal+horn.">Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).</li><li>Yoshimura, M., Nishi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blind+patch-clamp+recordings+from+substantia+gelatinosa+neurons+in+adult+rat+spinal+cord+slices:+pharmacological+properties+of+synaptic+currents.">Blind patch-clamp recordings from substantia gelatinosa neurons in adult rat spinal cord slices: pharmacological properties of synaptic currents.</a> Neuroscience. 53 (2), 519-526 (1993).</li><li>Maxwell, D. J., Belle, M. D., Cheunsuang, O., Stewart, A., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+of+inhibitory+and+excitatory+interneurons+in+superficial+laminae+of+the+rat+dorsal+horn.">Morphology of inhibitory and excitatory interneurons in superficial laminae of the rat dorsal horn.</a> The Journal of Physiology. 584 (Pt. 2, 521-533 (2007).</li><li>Grudt, T. J., Perl, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlations+between+neuronal+morphology+and+electrophysiological+features+in+the+rodent+superficial+dorsal+horn.">Correlations between neuronal morphology and electrophysiological features in the rodent superficial dorsal horn.</a> The Journal of Physiology. 540 (Pt 1), 189-207 (2002).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+feed-forward+spinal+cord+glycinergic+neural+circuit+gates+mechanical+allodynia.">A feed-forward spinal cord glycinergic neural circuit gates mechanical allodynia.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (9), 4050-4062 (2013).</li><li>Zheng, J., Lu, Y., Perl, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+neurones+of+the+spinal+substantia+gelatinosa+mediate+interaction+of+signals+from+primary+afferents.">Inhibitory neurones of the spinal substantia gelatinosa mediate interaction of signals from primary afferents.</a> The Journal of Physiology. 588 (Pt 12), 2065-2075 (2010).</li><li>Balasubramanyan, S., Stemkowski, P. L., Stebbing, M. J., Smith, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sciatic+chronic+constriction+injury+produces+cell-type-specific+changes+in+the+electrophysiological+properties+of+rat+substantia+gelatinosa+neurons.">Sciatic chronic constriction injury produces cell-type-specific changes in the electrophysiological properties of rat substantia gelatinosa neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 96 (2), 579-590 (2006).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+signal-regulated+kinase+(ERK)+activation+is+required+for+itch+sensation+in+the+spinal+cord.">Extracellular signal-regulated kinase (ERK) activation is required for itch sensation in the spinal cord.</a> Molecular Brain. 7, 25 (2014).</li><li>Kopach, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+alters+trafficking+of+extrasynaptic+AMPA+receptors+in+tonically+firing+lamina+II+neurons+of+the+rat+spinal+dorsal+horn.">Inflammation alters trafficking of extrasynaptic AMPA receptors in tonically firing lamina II neurons of the rat spinal dorsal horn.</a> Pain. 152 (4), 912-923 (2011).</li><li>Takasu, K., Ono, H., Tanabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+cation+channels+at+primary+afferent+terminals+contribute+to+chronic+pain.">Spinal hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channels at primary afferent terminals contribute to chronic pain.</a> Pain. 151 (1), 87-96 (2010).</li><li>Iura, A., Takahashi, A., Hakata, S., Mashimo, T., Fujino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reductions+in+tonic+GABAergic+current+in+substantia+gelatinosa+neurons+and+GABAA+receptor+delta+subunit+expression+after+chronic+constriction+injury+of+the+sciatic+nerve+in+mice.">Reductions in tonic GABAergic current in substantia gelatinosa neurons and GABAA receptor delta subunit expression after chronic constriction injury of the sciatic nerve in mice.</a> European Journal of Pain. 20 (10), 1678-1688 (2016).</li><li>Alles, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve+injury+increases+contribution+of+L-type+calcium+channels+to+synaptic+transmission+in+spinal+lamina+II:+Role+of+alpha2delta-1+subunits.">Peripheral nerve injury increases contribution of L-type calcium channels to synaptic transmission in spinal lamina II: Role of alpha2delta-1 subunits.</a> Molecular Pain. 14, 1-12 (2018).</li><li>Santos, S. F., Rebelo, S., Derkach, V. A., Safronov, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitatory+interneurons+dominate+sensory+processing+in+the+spinal+substantia+gelatinosa+of+rat.">Excitatory interneurons dominate sensory processing in the spinal substantia gelatinosa of rat.</a> The Journal of Physiology. 581 (Pt 1), 241-254 (2007).</li><li>Lu, Y., Perl, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+organization+of+excitatory+circuits+between+neurons+of+the+spinal+superficial+dorsal+horn+(laminae+I+and+II).">Modular organization of excitatory circuits between neurons of the spinal superficial dorsal horn (laminae I and II).</a> The Journal of Neuroscience. 25 (15), 3900-3907 (2005).</li><li>Hantman, A. W., van den Pol, A. N., Perl, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+physiological+features+of+a+set+of+spinal+substantia+gelatinosa+neurons+defined+by+green+fluorescent+protein+expression.">Morphological and physiological features of a set of spinal substantia gelatinosa neurons defined by green fluorescent protein expression.</a> The Journal of Neuroscience. 24 (4), 836-842 (2004).</li><li>Yasaka, T., Tiong, S. Y., Hughes, D. I., Riddell, J. S., Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Populations+of+inhibitory+and+excitatory+interneurons+in+lamina+II+of+the+adult+rat+spinal+dorsal+horn+revealed+by+a+combined+electrophysiological+and+anatomical+approach.">Populations of inhibitory and excitatory interneurons in lamina II of the adult rat spinal dorsal horn revealed by a combined electrophysiological and anatomical approach.</a> Pain. 151 (2), 475-488 (2010).</li><li>Yin, H., Park, S. A., Han, S. K., Park, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+5-hydroxytryptamine+on+substantia+gelatinosa+neurons+of+the+trigeminal+subnucleus+caudalis+in+immature+mice.">Effects of 5-hydroxytryptamine on substantia gelatinosa neurons of the trigeminal subnucleus caudalis in immature mice.</a> Brain Research. 1368, 91-101 (2011).</li><li>Hu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lidocaine+Inhibits+HCN+Currents+in+Rat+Spinal+Substantia+Gelatinosa+Neurons.">Lidocaine Inhibits HCN Currents in Rat Spinal Substantia Gelatinosa Neurons.</a> Anesthesia and Analgesia. 122 (4), 1048-1059 (2016).</li><li>Peng, H. Z., Ma, L. X., Lv, M. H., Hu, T., Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minocycline+enhances+inhibitory+transmission+to+substantia+gelatinosa+neurons+of+the+rat+spinal+dorsal+horn.">Minocycline enhances inhibitory transmission to substantia gelatinosa neurons of the rat spinal dorsal horn.</a> Neuroscience. 319, 183-193 (2016).</li><li>Peng, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+presynaptic+HCN+channels+to+excitatory+inputs+of+spinal+substantia+gelatinosa+neurons.">Contribution of presynaptic HCN channels to excitatory inputs of spinal substantia gelatinosa neurons.</a> Neuroscience. 358, 146-157 (2017).</li><li>Liu, N., Zhang, D., Zhu, M., Luo, S., Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minocycline+inhibits+hyperpolarization-activated+currents+in+rat+substantia+gelatinosa+neurons.">Minocycline inhibits hyperpolarization-activated currents in rat substantia gelatinosa neurons.</a> Neuropharmacology. 95, 110-120 (2015).</li><li>Brown, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+whole-cell+recording+from+visually+preselected+neurons+of+perirhinal+cortex+in+brain+slices+from+young+and+aging+rats.">Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats.</a> Journal of Neuroscience Methods. 86 (1), 35-54 (1998).</li><li>Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurotoxicity+of+excitatory+amino+acids+is+produced+by+passive+chloride+influx.">The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx.</a> The Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).</li><li>Rice, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+ascorbate+in+the+preparation+and+maintenance+of+brain+slices.">Use of ascorbate in the preparation and maintenance of brain slices.</a> Methods. 18 (2), 144-149 (1999).</li><li>Takasu, K., Ogawa, K., Minami, K., Shinohara, S., Kato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injury-specific+functional+alteration+of+N-type+voltage-gated+calcium+channels+in+synaptic+transmission+of+primary+afferent+C-fibers+in+the+rat+spinal+superficial+dorsal+horn.">Injury-specific functional alteration of N-type voltage-gated calcium channels in synaptic transmission of primary afferent C-fibers in the rat spinal superficial dorsal horn.</a> European Journal of Pharmacology. 772, 11-21 (2016).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitatory+synaptic+transmission+in+the+spinal+substantia+gelatinosa+is+under+an+inhibitory+tone+of+endogenous+adenosine.">Excitatory synaptic transmission in the spinal substantia gelatinosa is under an inhibitory tone of endogenous adenosine.</a> Neuroscience Letters. 477 (1), 28-32 (2010).</li><li>Funai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+dexmedetomidine+augments+inhibitory+synaptic+transmission+in+the+superficial+dorsal+horn+through+activation+of+descending+noradrenergic+control:+an+in+vivo+patch-clamp+analysis+of+analgesic+mechanisms.">Systemic dexmedetomidine augments inhibitory synaptic transmission in the superficial dorsal horn through activation of descending noradrenergic control: an in vivo patch-clamp analysis of analgesic mechanisms.</a> Pain. 155 (3), 617-628 (2014).</li><li>Yamasaki, H., Funai, Y., Funao, T., Mori, T., Nishikawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+tramadol+on+substantia+gelatinosa+neurons+in+the+rat+spinal+cord:+an+in+vivo+patch-clamp+analysis.">Effects of tramadol on substantia gelatinosa neurons in the rat spinal cord: an in vivo patch-clamp analysis.</a> PLoS One. 10 (5), e0125147 (2015).</li><li>Furue, H., Narikawa, K., Kumamoto, E., Yoshimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responsiveness+of+rat+substantia+gelatinosa+neurones+to+mechanical+but+not+thermal+stimuli+revealed+by+in+vivo+patch-clamp+recording.">Responsiveness of rat substantia gelatinosa neurones to mechanical but not thermal stimuli revealed by in vivo patch-clamp recording.</a> The Journal of Physiology. 521 (Pt 2), 529-535 (1999).</li><li>Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+brain+slice+methods+for+adult+and+aging+animals:+application+of+targeted+patch+clamp+analysis+and+optogenetics.">Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics.</a> Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).</li><li>Ting, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Acute+Brain+Slices+Using+an+Optimized+N-Methyl-D-glucamine+Protective+Recovery+Method.">Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e53825 (2018).</li><li>Li, J., Baccei, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+Tissue+Damage+Promotes+Spike+Timing-Dependent+Synaptic+Long-Term+Potentiation+in+Adult+Spinal+Projection+Neurons.">Neonatal Tissue Damage Promotes Spike Timing-Dependent Synaptic Long-Term Potentiation in Adult Spinal Projection Neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (19), 5405-5416 (2016).</li><li>Ford, N. C., Ren, D., Baccei, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NALCN+channels+enhance+the+intrinsic+excitability+of+spinal+projection+neurons.">NALCN channels enhance the intrinsic excitability of spinal projection neurons.</a> Pain. , (2018).</li><li>Cui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+synaptic+transmission+from+primary+afferents+to+spinal+substantia+gelatinosa+neurons+by+group+III+mGluRs+in+GAD65-EGFP+transgenic+mice.">Modulation of synaptic transmission from primary afferents to spinal substantia gelatinosa neurons by group III mGluRs in GAD65-EGFP transgenic mice.</a> Journal of Neurophysiology. 105 (3), 1102-1111 (2011).</li><li>Yang, K., Ma, R., Wang, Q., Jiang, P., Li, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optoactivation+of+parvalbumin+neurons+in+the+spinal+dorsal+horn+evokes+GABA+release+that+is+regulated+by+presynaptic+GABAB+receptors.">Optoactivation of parvalbumin neurons in the spinal dorsal horn evokes GABA release that is regulated by presynaptic GABAB receptors.</a> Neuroscience Letters. , 55-59 (2015).</li></ol>

هذا البروتوكول تفاصيل الخطوات اللازمة لإعداد شرائح الحبل الشوكي، التي كنا قد استخدمت بنجاح عند إجراء تجارب كامل الخلية التصحيح-المشبك في سان جرمان الخلايا العصبية18،19،،من2021. من خلال تنفيذ هذا الأسلوب، ونحن ذكرت مؤخرا ...

جيلاتينوسا المادة (سان جرمان، الصفيحة الثاني من القرن الأفريقي الظهرية العمود الفقري) مركز ترحيل هام بلا منازع ليحيل بها وتنظيم المعلومات الحسية. وهو يتألف من إينتيرنيورونس عليه والمثبطة، التي تتلقى مدخلات من الألياف الزبائ الأولية، إينتيرنيورونس المحلية، و نظام المثبطة تنازلي الذاتية1. في العقود الأخيرة، ومكنت تطوير إعداد شريحة الحبل الشوكي الحاد وظهور تسجيل كامل الخلية التصحيح-المشبك دراسات مختلفة عن الخصائص الجوهرية الكهربية والمورفولوجية ل الخلايا العصبية SG2، 3 , 4 فضلا عن دراسات للدوائر المحلية في سان جرمان5،6. وباﻹضافة إلى ذلك، باستخدام إعداد شريحة الحبل الشوكي في المختبر ، الباحثين ويمكن تفسير التغييرات في الخلايا العصبية اكسسيتابيليتيس7،8، وظيفة أيون القنوات10من9،، و أنشطة متشابك11،12 تحت مختلف الظروف المرضية. وقد تعمقت هذه الدراسات فهمنا للدور الذي تؤديه سان جرمان الخلايا العصبية في تطوير وصيانة الألم المزمن وحكة الأعصاب.
أساسا، الشرط الأساسي لتحقيق وضع تصور واضح سوما الخلايا العصبية والمثالي كامل الخلية التصحيح باستخدام شرائح الحبل الشوكي الحاد لضمان نوعية ممتازة من شرائح حتى يمكن الحصول على الخلايا العصبية سليمة وباتشابل. ومع ذلك، إعداد شرائح الحبل الشوكي ينطوي على عدة خطوات، مثل القيام الاستئصال البطني وإزالة غشاء العنكبوتية بيا، الذي قد تكون عقبات في الحصول على شرائح صحية. على الرغم من أنه ليس من السهل إعداد شرائح الحبل الشوكي، أداء التسجيلات في المختبر على شرائح الحبل الشوكي مزايا عدة. بالمقارنة مع خلية ثقافة الأعمال التحضيرية، شرائح الحبل الشوكي يمكن جزئيا الحفاظ على اتصالات متشابك المتأصلة التي في حالة فسيولوجيا ذات صلة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن الجمع بين كامل الخلية التصحيح-المشبك تسجيل باستخدام شرائح الحبل الشوكي مع أساليب أخرى، مثل التصحيح مزدوجة المشبك13،14و15،الدراسات المورفولوجية16 وخليه واحدة RT-PCR 17-ولذلك، هذا الأسلوب يوفر المزيد من المعلومات في وصف الاختلافات التشريحية والوراثية داخل منطقة محددة ويسمح للتحقيق في تشكيل الدوائر المحلية.
هنا، نحن نقدم وصفاً الأساسية والتفصيلية لأسلوبنا لإعداد شرائح الحبل الشوكي الحاد والحصول على تسجيلات المشبك تصحيح كامل الخلية من الخلايا العصبية SG.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF and PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60130</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF, and K+-based intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71500</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF and PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5080</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5280</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7631</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7903</td>
			<td>Used for the preparation of sucrose-ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-gluconate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>169-11835</td>
			<td>Used for the preparation of K+-based intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2-Phosphocreatine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1937</td>
			<td>Used for the preparation of intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td>Used for the preparation of intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td>Used for the preparation of intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187</td>
			<td>Used for the preparation of intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Li-GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5884</td>
			<td>Used for the preparation of intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsMeSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1426</td>
			<td>Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3011</td>
			<td>Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEA-Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2265</td>
			<td>Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobiotin 488</td>
			<td>Vector</td>
			<td>SP-1145</td>
			<td>0.05% neurobiotin 488 could be used for morphological studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7002</td>
			<td>3% agar block was used in our protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>4% paraformaldehyde was used for immunohistochemical processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Hengxing Chemical Reagents</td>
			<td></td>
			<td>Used for the preparation of PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mount Coverslipping Medium</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>18606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urethan</td>
			<td>National Institute for Food and Drug Control</td>
			<td>30191228</td>
			<td>1.5 g/kg, i.p.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW150F-4</td>
			<td>1.5 mm OD, 1.12 mm ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Used for the preparation of micropipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table</td>
			<td>Technical Manufacturing Corporation</td>
			<td>63544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared CCD camera</td>
			<td>Dage-MIT</td>
			<td>IR-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch-clamp amplifier</td>
			<td>HEKA</td>
			<td>EPC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MP-285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Y stage</td>
			<td>Burleigh</td>
			<td>GIBRALTAR X-Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer</td>
			<td>Advanced</td>
			<td>FISKE 210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>FE20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocol microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 700</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of acute spinal cord slices for whole-cell patch-clamp recording in substantia gelatinosa neurons

وقدمت دراسات أجريت مؤخرا المشبك تصحيح كامل الخلية من الخلايا العصبية في الدماغ جيلاتينوسا (سان جرمان) مجموعة كبيرة من المعلومات عن آليات العمود الفقري الكامنة وراء انتقال الحسية والتنظيم nociceptive، وتنمية ألم أو حكة مزمنة. كذلك تحسنت تطبيقات التسجيلات الكهربية إلى جانب الدراسات المورفولوجية استناداً إلى الأداة المساعدة لشرائح الحبل الشوكي الحاد لفهمنا لخصائص الخلايا العصبية وتكوين الدوائر المحلية في سان جرمان. وهنا، نقدم دليل المفصل وعملية لإعداد شرائح الحبل الشوكي وإظهار الممثل كامل الخلية التسجيل والنتائج المورفولوجية. هذا البروتوكول يسمح بالمحافظة على الخلايا العصبية مثالية، ويمكن أن تحاكي في فيفو الظروف إلى حد ما. وباختصار، القدرة على الحصول على التحضير في المختبر لشرائح الحبل الشوكي تمكن تسجيلات المشبك الحالية والجهد مستقرة ويمكن وبالتالي تسهيل تحقيقات مفصلة في خصائص الغشاء الجوهرية، الدوائر المحلية و هيكل الخلايا العصبية باستخدام مختلف النهج التجريبي.

وتم إعداد شرائح النخاع الشوكي الحادة وفقا للمخطط المبين في الشكل 1. بعد تقطيع والانتعاش، نقل شريحة حبل الشوكي إلى دائرة التسجيل. وتم تحديد الخلايا العصبية سليمة استناداً إلى مظهر سوما باستخدام الأشعة تحت الحمراء-DIC مجهرية. بعد ذلك، كانت أثارت إمكانات العم...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons at JoVE.com

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

إعداد شرائح الحبل الشوكي الحاد لتسجيل كامل الخلية التصحيح-المشبك في الخلايا العصبية جيلاتينوسا الدماغ

هنا، نحن تصف الخطوات الأساسية لتسجيلات المشبك تصحيح كامل الخلية من الخلايا العصبية في الدماغ جيلاتينوسا (سان جرمان) في شريحة الحبل الشوكي في المختبر . يسمح هذا الأسلوب خصائص الغشاء الجوهرية وانتقال متشابك وتوصيف الخصائص المورفولوجية سان جرمان الخلايا العصبية دراستها.

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

هذه الطريقة يمكن أن تساعد في توضيح آليات العمود الفقري الكامنة تحت انتقال الحسية, nociceptive التنظيم والألم المزمن أو وجع التنمية والميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه يمكن أن تسمح الحفاظ على الخلايا العصبية المثالية وأنه يمكن تقليد الظروف في vivo إلى حد ما. تبدأ عن طريق سحب أقطاب تسجيل من الزجاج البورسليكات microcapillaries باستخدام سحب الشعيرات الدموية. ثم املأ قالبًا بـ agar المنصهر لإعداد كتلة أجار 1.2 سنتيمترًا في 1.5 سنتيمترًا في 2.0 سنتيمتر.تقليم كتلة أن يكون لها قناة مركزية إذا التخطيط المقاطع العرضية. أو اللحم قناة مع حافة كتلة لأقسام parasagittal. قبل الإسراف عبر القلب واستخراج الحبل الشوكي، وإعداد 500 ملليلتر من السكروز مقرها ACSF.تبريد حل للجليد الباردة وتككيل مع 95٪ O2 و 5٪ CO2. تبريد جميع أدوات التشريح على الجليد. جعل شق طولي خمسة سنتيمترات على الجلد الخلفي من السد إلى الرسترالي.ثم، قطع من خلال القفص الصدري بين العمود الفقري والأضلاع على جانبي. استخدام مقص لجعل قطع في نهاية السد من العمود الفقري. ثم قطع بعيدا الأنسجة المحيطة بها وعزل بسرعة الجزء من العمود الفقري lumbosacral.نقل الجزء lumbosacral إلى طبق زجاجي يحتوي على الجليد الباردة السكروز مقرها ACSF. مع الجانب البطني التصاعدي، واستخدام مقص غرامة لقطع من خلال pedicle الفقرية ثنائيا وفضح الحبل الشوكي بعناية. عزل مقطع سنتيمترين من الحبل الشوكي مع توسيع اللومترية ونقل القسم الشوكي إلى طبق زجاجي آخر مليء بالسروز البارد ACSF.العمل تحت مجهر تشريح لإزالة السحائيات والغشاء arachnoid بيا. قطع جميع جذور البطن والثمال بعيدا في أسرع وقت ممكن. الحرص على تجنب إصابة الحبل الشوكي، وخاصة القرن الظهري عند إزالة السحايا والجذور الشوكية.ضع الحبل الشوكي على كتلة أجار التي تم تشذيبها سابقًا. لإعداد الشرائح العرضية، قم بتوصيل الجانب البطني من الحبل الشوكي بـ agar مع الجانب الظهري نحو النصل. لإعداد شرائح باراسجيتال، قم بتوصيل الجانب البطني مع الغليدو الفائق إلى أجار في اتجاه عمودي.ثم، جبل كتلة أجار إلى منصة من اهتزاز مع superglue. وإعداد 300 إلى 500 ميكرون شرائح عرضية أو باراسجيتال مع سرعة متقدمة من 0.025 ملليمتر في الثانية الواحدة وتواتر اهتزاز 80 هيرتز. يجب أن يُقطّع الحبل الشوكي إلى شرائح dorso-ventrally.للحصول على أفضل النتائج، يجب إعداد الشريحة في غضون 15 إلى 20 دقيقة. يجب أن لا يزيد سمك الشريحة الشوكية عن 600 ميكرون لتلبية رؤية الخلية. استخدام ماصة بلاستيكية قلص لنقل شرائح على شبكة النايلون في غرفة تخزين تحتوي على أكسجين باستمرار ACSF في 32 درجة مئوية.لإجراء تسجيلات المشبك التصحيح الخلية الكاملة من substantia الجيلاتينوزا أو الخلايا العصبية SG، استخدم أيونات البوتاسيوم القائمة على حلول داخل الخلايا للتسجيل أثناء تطبيق محلول الكاتيوم الموجبة القائم فقط لتسجيل التيارات المثبطة بعد متشابك. قم بتحريك شريحة الحبل الشوكي بلطف إلى غرفة التسجيل. ثم استقراره بقوة مع سلك البلاتين على شكل يو مع خيوط النايلون للاستقرار شريحة الأمثل.بغزارة باطراد شريحة مع ACSF فقاعة في درجة حرارة الغرفة وتعيين معدل الزغرة في 2-4 ملليلتر في الدقيقة الواحدة لتحقيق الأوكسجين كافية. ثم، باستخدام عدسة المجهر منخفضة الدقة، وتحديد منطقة الخلايا العصبية SG كفرقة شفافة. اختيار الخلايا العصبية صحية، تتميز شكل ثلاثي الأبعاد مع غشاء مشرق وسلس كخلية الهدف باستخدام الهدف عالية الدقة وتعديله إلى مركز شاشة الفيديو.ملء ماصة صغيرة مع حجم مناسب من أيونات البوتاسيوم القائمة أو أيونات القائمة على محلول داخل الخلايا. ثم أدخل الماصات الصغيرة في حامل القطب الكهربائي وتأكد من أن الحل داخل الخلايا يتصل بالأسلاك الفضية داخل الحامل. جلب ماصة صغيرة في التركيز واستخدام micromanipulator لتزج بها في ACSF.تطبيق ضغط إيجابي معتدل لإجبار أي الأوساخ والحطام. تحرك تدريجيا ماصة صغيرة نحو الخلايا العصبية المستهدفة. مرة واحدة في ماصة تقترب من الخلايا العصبية وأشكال غماز صغيرة جدا على غشاء الخلايا العصبية، والافراج عن الضغط الإيجابي لتشكيل gigaseal.تغيير احتمال عقد إلى ناقص 70 millivolts، وهو قريب من احتمال غشاء يستريح الفسيولوجية للخلية. ثم، تطبيق شفط عابرة ورقيقة على ماصة صغيرة لتمزق الغشاء وخلق تكوين خلية كاملة جيدة. سجل خصائص اطلاق النار عن طريق اختبار نمط اطلاق النار من كل خلية عصبية في المشبك الحالي مع سلسلة من ثانية واحدة البقول الحالية depolarizing من 25 إلى 150 picoamps مع 25 زيادات picoamp في احتمال غشاء يستريح.لتسجيل التيارات subthreshold الجسدية، عقد احتمالية الغشاء في ناقص 50 millivolts في وضع المشبك الجهد ثم تطبيق سلسلة من نبضات الجهد فرط الاستقطاب لمدة ثانية واحدة من ناقص 60 ملليفولت إلى ناقص 120 millivolts مع 10 ميليفولت 10. سجل التيارات ما بعد متشابك الإثارة مع أيون البوتاسيوم القائمة على حل داخل الخلايا في وضع المشبك الجهد في عقد المحتملة من ناقص 70 millivolts. سجل IPSC باستخدام محلول أيونات أسّس داخل الخلايا لتسجيل IPSC.بعد عقد الغشاء المحتملة في ناقص 70 millivolts لمدة خمس دقائق تقريبا، تدريجيا تغيير احتمال عقد إلى ميليفولت صفر. انتظر بضع دقائق لتحقيق الاستقرار ثم قم بالبدء في تسجيل أحداث IPSC. أنماط اطلاق النار التي تحددها حقن سلسلة من ثانية واحدة البقول الحالية depolarizing في الخلايا العصبية SG في احتمال غشاء يستريح يمكن تصنيفها على أنها منشط اطلاق النار، وتأخير اطلاق النار، والفجوة اطلاق النار، الأولية انفجار، رشق phasic الانفجار، واحد- مسمار ومتردد اطلاق النار.تُظهر هذه الصورة بروتوكول استحضار التيارات subthreshold في المشبك الجهد. وتظهر هذه الآثار التمثيلية الاستجابة لحقن التيار المفرط في الأقطاب المصنفة على أنها IH وIA و IT. هذا هو أثر تمثيلي لـ SEPSC المسجلة من الخلايا العصبية SG في ناقص 70 ملليفولت في غياب ووجود 50 APV ميكرومولار و 20 CNQX ميكرومولار. يظهر هذا التتبع في SEPC المسجلة قبل إضافة APV و CNQX على مقياس زمني موسع.بعد هذا الإجراء هي أساليب مثل تسجيلات المشبك التصحيح الاقتران أو optogenetics يمكن تنفيذها للإجابة على أسئلة إضافية مثل وصف الدوائر الدقيقة العصبية محددة في substantia الجيلاتينوزا.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

الكهربية والمورفولوجية توصيف العصبية الحادة رقائق في الدماغ عن طريق شرائح الموثوقة التصحيح، المشبك التسجيلات

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

تسجيلات خلية كاملة التصحيح، المشبك في الدماغ شرائح

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

لإعداد المائل الحبل الشوكي شرائح لبطني الجذر تحفيز

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

كامل خلية التصحيح المشبك تسجيلات لتحديد الكهربية من أيون الانتقائية في تشانلرودوبسينز

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

تطبيق الآلي صورة موجهة المشبك التصحيح لدراسة الخلايا العصبية في شرائح الدماغ

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

استجابة جذع الدماغ السمعية والخارجي الشعر خلية تسجيل المشبك تصحيح كامل الخلية في الفئران بعد الولادة

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

الأعمال التحضيرية وبروتوكولات "كل خلية التصحيح المشبك تسجيل" ليفيس النمو تيكتال الخلايا العصبية

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology

تقييم متشابك تعدد استخدام المشبك تصحيح كامل الخلية الكهربية

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic ...

Preparation of Acute Slices from Dorsal Hippocampus for Whole-Cell Recording and Neuronal Reconstruction in the Dentate Gyrus of Adult Mice

إعداد شرائح حادة من الحصين دورسال لتسجيل الخلية الكاملة وإعادة بناء الخلايا العصبية في Gyrus Dentate من الفئران الكبار

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in ...

Hypothalamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings

الخلايا العصبية تحت المهاد كيسبيبتين كهدف لتسجيلات المشبك التصحيحي للخلية الكاملة

Kisspeptins are essential for the maturation of the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis and fertility. Hypothalamic kisspeptin neurons located in ...