Name: preparation of acute spinal cord slices for whole-cell patch-clamp recording in substantia gelatinosa neurons
Uploaded: 2019-01-18T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons at JoVE.com

Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Natural Science Foundation of China (Nr. 81560198, 31660289).

Die Tier Ethik Komitee von Nanchang University (Nanchang, VR China, ethische No.2017-010) stimmten alle experimentelle Protokolle beschrieben. Alle Anstrengungen wurden unternommen, um den Stress und die Schmerzen der Versuchstiere zu minimieren. Die elektrophysiologischen Aufnahmen, die hier aufgeführt wurden bei Raumtemperatur (RT, 22 – 25 ° C) durchgeführt.
(1) Tiere
<ol><li>Verwenden Sie Sprague-Dawley Ratten (3 – 5 Wochen alt) beiderlei Geschlechts. Beherbergen Sie die Tiere unte...

<ol>
	<li>Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+circuitry+for+pain+processing+in+the+dorsal+horn.">Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).</li><li>Yoshimura, M., Nishi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blind+patch-clamp+recordings+from+substantia+gelatinosa+neurons+in+adult+rat+spinal+cord+slices:+pharmacological+properties+of+synaptic+currents.">Blind patch-clamp recordings from substantia gelatinosa neurons in adult rat spinal cord slices: pharmacological properties of synaptic currents.</a> Neuroscience. 53 (2), 519-526 (1993).</li><li>Maxwell, D. J., Belle, M. D., Cheunsuang, O., Stewart, A., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+of+inhibitory+and+excitatory+interneurons+in+superficial+laminae+of+the+rat+dorsal+horn.">Morphology of inhibitory and excitatory interneurons in superficial laminae of the rat dorsal horn.</a> The Journal of Physiology. 584 (Pt. 2, 521-533 (2007).</li><li>Grudt, T. J., Perl, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlations+between+neuronal+morphology+and+electrophysiological+features+in+the+rodent+superficial+dorsal+horn.">Correlations between neuronal morphology and electrophysiological features in the rodent superficial dorsal horn.</a> The Journal of Physiology. 540 (Pt 1), 189-207 (2002).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+feed-forward+spinal+cord+glycinergic+neural+circuit+gates+mechanical+allodynia.">A feed-forward spinal cord glycinergic neural circuit gates mechanical allodynia.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (9), 4050-4062 (2013).</li><li>Zheng, J., Lu, Y., Perl, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+neurones+of+the+spinal+substantia+gelatinosa+mediate+interaction+of+signals+from+primary+afferents.">Inhibitory neurones of the spinal substantia gelatinosa mediate interaction of signals from primary afferents.</a> The Journal of Physiology. 588 (Pt 12), 2065-2075 (2010).</li><li>Balasubramanyan, S., Stemkowski, P. L., Stebbing, M. J., Smith, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sciatic+chronic+constriction+injury+produces+cell-type-specific+changes+in+the+electrophysiological+properties+of+rat+substantia+gelatinosa+neurons.">Sciatic chronic constriction injury produces cell-type-specific changes in the electrophysiological properties of rat substantia gelatinosa neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 96 (2), 579-590 (2006).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+signal-regulated+kinase+(ERK)+activation+is+required+for+itch+sensation+in+the+spinal+cord.">Extracellular signal-regulated kinase (ERK) activation is required for itch sensation in the spinal cord.</a> Molecular Brain. 7, 25 (2014).</li><li>Kopach, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+alters+trafficking+of+extrasynaptic+AMPA+receptors+in+tonically+firing+lamina+II+neurons+of+the+rat+spinal+dorsal+horn.">Inflammation alters trafficking of extrasynaptic AMPA receptors in tonically firing lamina II neurons of the rat spinal dorsal horn.</a> Pain. 152 (4), 912-923 (2011).</li><li>Takasu, K., Ono, H., Tanabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+cation+channels+at+primary+afferent+terminals+contribute+to+chronic+pain.">Spinal hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channels at primary afferent terminals contribute to chronic pain.</a> Pain. 151 (1), 87-96 (2010).</li><li>Iura, A., Takahashi, A., Hakata, S., Mashimo, T., Fujino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reductions+in+tonic+GABAergic+current+in+substantia+gelatinosa+neurons+and+GABAA+receptor+delta+subunit+expression+after+chronic+constriction+injury+of+the+sciatic+nerve+in+mice.">Reductions in tonic GABAergic current in substantia gelatinosa neurons and GABAA receptor delta subunit expression after chronic constriction injury of the sciatic nerve in mice.</a> European Journal of Pain. 20 (10), 1678-1688 (2016).</li><li>Alles, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve+injury+increases+contribution+of+L-type+calcium+channels+to+synaptic+transmission+in+spinal+lamina+II:+Role+of+alpha2delta-1+subunits.">Peripheral nerve injury increases contribution of L-type calcium channels to synaptic transmission in spinal lamina II: Role of alpha2delta-1 subunits.</a> Molecular Pain. 14, 1-12 (2018).</li><li>Santos, S. F., Rebelo, S., Derkach, V. A., Safronov, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitatory+interneurons+dominate+sensory+processing+in+the+spinal+substantia+gelatinosa+of+rat.">Excitatory interneurons dominate sensory processing in the spinal substantia gelatinosa of rat.</a> The Journal of Physiology. 581 (Pt 1), 241-254 (2007).</li><li>Lu, Y., Perl, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+organization+of+excitatory+circuits+between+neurons+of+the+spinal+superficial+dorsal+horn+(laminae+I+and+II).">Modular organization of excitatory circuits between neurons of the spinal superficial dorsal horn (laminae I and II).</a> The Journal of Neuroscience. 25 (15), 3900-3907 (2005).</li><li>Hantman, A. W., van den Pol, A. N., Perl, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+physiological+features+of+a+set+of+spinal+substantia+gelatinosa+neurons+defined+by+green+fluorescent+protein+expression.">Morphological and physiological features of a set of spinal substantia gelatinosa neurons defined by green fluorescent protein expression.</a> The Journal of Neuroscience. 24 (4), 836-842 (2004).</li><li>Yasaka, T., Tiong, S. Y., Hughes, D. I., Riddell, J. S., Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Populations+of+inhibitory+and+excitatory+interneurons+in+lamina+II+of+the+adult+rat+spinal+dorsal+horn+revealed+by+a+combined+electrophysiological+and+anatomical+approach.">Populations of inhibitory and excitatory interneurons in lamina II of the adult rat spinal dorsal horn revealed by a combined electrophysiological and anatomical approach.</a> Pain. 151 (2), 475-488 (2010).</li><li>Yin, H., Park, S. A., Han, S. K., Park, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+5-hydroxytryptamine+on+substantia+gelatinosa+neurons+of+the+trigeminal+subnucleus+caudalis+in+immature+mice.">Effects of 5-hydroxytryptamine on substantia gelatinosa neurons of the trigeminal subnucleus caudalis in immature mice.</a> Brain Research. 1368, 91-101 (2011).</li><li>Hu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lidocaine+Inhibits+HCN+Currents+in+Rat+Spinal+Substantia+Gelatinosa+Neurons.">Lidocaine Inhibits HCN Currents in Rat Spinal Substantia Gelatinosa Neurons.</a> Anesthesia and Analgesia. 122 (4), 1048-1059 (2016).</li><li>Peng, H. Z., Ma, L. X., Lv, M. H., Hu, T., Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minocycline+enhances+inhibitory+transmission+to+substantia+gelatinosa+neurons+of+the+rat+spinal+dorsal+horn.">Minocycline enhances inhibitory transmission to substantia gelatinosa neurons of the rat spinal dorsal horn.</a> Neuroscience. 319, 183-193 (2016).</li><li>Peng, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+presynaptic+HCN+channels+to+excitatory+inputs+of+spinal+substantia+gelatinosa+neurons.">Contribution of presynaptic HCN channels to excitatory inputs of spinal substantia gelatinosa neurons.</a> Neuroscience. 358, 146-157 (2017).</li><li>Liu, N., Zhang, D., Zhu, M., Luo, S., Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minocycline+inhibits+hyperpolarization-activated+currents+in+rat+substantia+gelatinosa+neurons.">Minocycline inhibits hyperpolarization-activated currents in rat substantia gelatinosa neurons.</a> Neuropharmacology. 95, 110-120 (2015).</li><li>Brown, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+whole-cell+recording+from+visually+preselected+neurons+of+perirhinal+cortex+in+brain+slices+from+young+and+aging+rats.">Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats.</a> Journal of Neuroscience Methods. 86 (1), 35-54 (1998).</li><li>Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurotoxicity+of+excitatory+amino+acids+is+produced+by+passive+chloride+influx.">The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx.</a> The Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).</li><li>Rice, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+ascorbate+in+the+preparation+and+maintenance+of+brain+slices.">Use of ascorbate in the preparation and maintenance of brain slices.</a> Methods. 18 (2), 144-149 (1999).</li><li>Takasu, K., Ogawa, K., Minami, K., Shinohara, S., Kato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injury-specific+functional+alteration+of+N-type+voltage-gated+calcium+channels+in+synaptic+transmission+of+primary+afferent+C-fibers+in+the+rat+spinal+superficial+dorsal+horn.">Injury-specific functional alteration of N-type voltage-gated calcium channels in synaptic transmission of primary afferent C-fibers in the rat spinal superficial dorsal horn.</a> European Journal of Pharmacology. 772, 11-21 (2016).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitatory+synaptic+transmission+in+the+spinal+substantia+gelatinosa+is+under+an+inhibitory+tone+of+endogenous+adenosine.">Excitatory synaptic transmission in the spinal substantia gelatinosa is under an inhibitory tone of endogenous adenosine.</a> Neuroscience Letters. 477 (1), 28-32 (2010).</li><li>Funai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+dexmedetomidine+augments+inhibitory+synaptic+transmission+in+the+superficial+dorsal+horn+through+activation+of+descending+noradrenergic+control:+an+in+vivo+patch-clamp+analysis+of+analgesic+mechanisms.">Systemic dexmedetomidine augments inhibitory synaptic transmission in the superficial dorsal horn through activation of descending noradrenergic control: an in vivo patch-clamp analysis of analgesic mechanisms.</a> Pain. 155 (3), 617-628 (2014).</li><li>Yamasaki, H., Funai, Y., Funao, T., Mori, T., Nishikawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+tramadol+on+substantia+gelatinosa+neurons+in+the+rat+spinal+cord:+an+in+vivo+patch-clamp+analysis.">Effects of tramadol on substantia gelatinosa neurons in the rat spinal cord: an in vivo patch-clamp analysis.</a> PLoS One. 10 (5), e0125147 (2015).</li><li>Furue, H., Narikawa, K., Kumamoto, E., Yoshimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responsiveness+of+rat+substantia+gelatinosa+neurones+to+mechanical+but+not+thermal+stimuli+revealed+by+in+vivo+patch-clamp+recording.">Responsiveness of rat substantia gelatinosa neurones to mechanical but not thermal stimuli revealed by in vivo patch-clamp recording.</a> The Journal of Physiology. 521 (Pt 2), 529-535 (1999).</li><li>Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+brain+slice+methods+for+adult+and+aging+animals:+application+of+targeted+patch+clamp+analysis+and+optogenetics.">Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics.</a> Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).</li><li>Ting, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Acute+Brain+Slices+Using+an+Optimized+N-Methyl-D-glucamine+Protective+Recovery+Method.">Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e53825 (2018).</li><li>Li, J., Baccei, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+Tissue+Damage+Promotes+Spike+Timing-Dependent+Synaptic+Long-Term+Potentiation+in+Adult+Spinal+Projection+Neurons.">Neonatal Tissue Damage Promotes Spike Timing-Dependent Synaptic Long-Term Potentiation in Adult Spinal Projection Neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (19), 5405-5416 (2016).</li><li>Ford, N. C., Ren, D., Baccei, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NALCN+channels+enhance+the+intrinsic+excitability+of+spinal+projection+neurons.">NALCN channels enhance the intrinsic excitability of spinal projection neurons.</a> Pain. , (2018).</li><li>Cui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+synaptic+transmission+from+primary+afferents+to+spinal+substantia+gelatinosa+neurons+by+group+III+mGluRs+in+GAD65-EGFP+transgenic+mice.">Modulation of synaptic transmission from primary afferents to spinal substantia gelatinosa neurons by group III mGluRs in GAD65-EGFP transgenic mice.</a> Journal of Neurophysiology. 105 (3), 1102-1111 (2011).</li><li>Yang, K., Ma, R., Wang, Q., Jiang, P., Li, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optoactivation+of+parvalbumin+neurons+in+the+spinal+dorsal+horn+evokes+GABA+release+that+is+regulated+by+presynaptic+GABAB+receptors.">Optoactivation of parvalbumin neurons in the spinal dorsal horn evokes GABA release that is regulated by presynaptic GABAB receptors.</a> Neuroscience Letters. , 55-59 (2015).</li></ol>

Dieses Protokolldetails der Schritte für die Zubereitung von Rückenmark Slices, die wir erfolgreich eingesetzt haben, wenn ganze Zelle Patch-Clamp-Experimenten auf der SG Neuronen18,19,20,21. Durch die Implementierung dieser Methode, wir berichteten kürzlich, dass Minocyclin eine zweite Generation von Tetracyclin, inhibitorischen synaptischen Übertragung durch einen präsynaptischen Mechani...

Die Substantia Gelatinosa (SG, Lamina II der spinalen Hinterhorn) ist ein unbestreitbar wichtig Relais für Sende- und Regulierung von sensorischen Informationen. Es besteht aus exzitatorischen und inhibitorischen Interneuronen, die Eingänge von den primären afferenten Fasern, lokale Interneuronen und der endogenen absteigenden hemmenden System1erhalten. In den letzten Jahrzehnten konnten die Entwicklung der akuten Rückenmark Slice Vorbereitung und dem Aufkommen der gesamten Zelle Patch-Clamp-Aufnahme verschiedene Studien über die inhärenten elektrophysiologischen und morphologischen Eigenschaften von SG Neuronen2, 3 , 4 sowie Studien über die lokalen Schaltung in SG5,6. Darüber hinaus durch die Verwendung der in-vitro- Rückenmark Slice Vorbereitung, Forscher interpretieren können die Änderungen in neuronalen Excitabilities7,8, die Funktion der Ionen-Kanäle9,10, und synaptische Aktivitäten11,12 unter verschiedenen pathologischen Bedingungen. Diese Studien haben unser Verständnis von der Rolle der SG Neuronen in der Entwicklung und Instandhaltung von chronischen Schmerzen und neuropathischen Juckreiz vertieft.
Im Wesentlichen ist die wesentliche Voraussetzung für eine klare Visualisierung der neuronalen Soma und ideale ganze Zelle Patchen mit akuten Rückenmark Scheiben zu erreichen um die hervorragende Qualität der Scheiben zu gewährleisten, so gesunde und patchbare Neuronen erreicht werden können. Allerdings umfasst bereitet Rückenmark Scheiben mehrere Schritte, wie das Durchführen einer ventralen Laminektomie und Entfernen der Pia-Arachnoidea-Membran, die Hindernisse bei der Beschaffung von gesunder Scheiben werden kann. Obwohl es nicht einfach zuzubereitende Rückenmark Scheiben, hat Durchführung von Aufnahmen in Vitro am Rückenmark Scheiben mehrere Vorteile. Im Vergleich zu Zelle Kultur Vorbereitungen, erhalten Rückenmark Scheiben teilweise inhärente synaptische Verbindungen, die in einem physiologisch relevanten Zustand befinden. Darüber hinaus könnten ganze Zelle Patch-Clamp-Aufnahme mit Rückenmark Scheiben mit anderen Techniken, wie z. B. doppelte Patch Clamp13,14, morphologische Studien15,16 und einzellige RT-PCR kombiniert werden 17. daher, diese Technik enthält weitere Informationen zur Charakterisierung der anatomische und genetische Unterschiede innerhalb einer bestimmten Region und ermöglicht die Untersuchung der Zusammensetzung der lokalen Schaltung.
Hier bieten wir eine grundlegende und detaillierte Beschreibung unserer Methode für die Vorbereitung der akuten Rückenmark Scheiben und ganze Zelle Patch-Clamp-Aufnahmen von SG Neuronen zu erwerben.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF and PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60130</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF, and K+-based intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71500</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF and PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5080</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5280</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7631</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7903</td>
			<td>Used for the preparation of sucrose-ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-gluconate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>169-11835</td>
			<td>Used for the preparation of K+-based intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2-Phosphocreatine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1937</td>
			<td>Used for the preparation of intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td>Used for the preparation of intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td>Used for the preparation of intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187</td>
			<td>Used for the preparation of intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Li-GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5884</td>
			<td>Used for the preparation of intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsMeSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1426</td>
			<td>Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3011</td>
			<td>Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEA-Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2265</td>
			<td>Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobiotin 488</td>
			<td>Vector</td>
			<td>SP-1145</td>
			<td>0.05% neurobiotin 488 could be used for morphological studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7002</td>
			<td>3% agar block was used in our protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>4% paraformaldehyde was used for immunohistochemical processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Hengxing Chemical Reagents</td>
			<td></td>
			<td>Used for the preparation of PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mount Coverslipping Medium</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>18606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urethan</td>
			<td>National Institute for Food and Drug Control</td>
			<td>30191228</td>
			<td>1.5 g/kg, i.p.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW150F-4</td>
			<td>1.5 mm OD, 1.12 mm ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Used for the preparation of micropipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table</td>
			<td>Technical Manufacturing Corporation</td>
			<td>63544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared CCD camera</td>
			<td>Dage-MIT</td>
			<td>IR-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch-clamp amplifier</td>
			<td>HEKA</td>
			<td>EPC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MP-285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Y stage</td>
			<td>Burleigh</td>
			<td>GIBRALTAR X-Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer</td>
			<td>Advanced</td>
			<td>FISKE 210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>FE20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocol microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 700</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of acute spinal cord slices for whole-cell patch-clamp recording in substantia gelatinosa neurons

Ganze Zelle Patch-Clamp-Studien von Neuronen der Substantia Gelatinosa (SG) haben einen großen Bestand an Informationen über die Wirbelsäulen Mechanismen sensorischer Übertragung, nozizeptiven Regulierung und chronische Schmerzen oder Juckreiz Entwicklung zur Verfügung gestellt. Implementierungen von elektrophysiologische Aufnahmen zusammen mit morphologischen Studien basierend auf die Nützlichkeit des akuten Rückenmark Scheiben haben unser Verständnis der neuronalen Eigenschaften und die Zusammensetzung der lokalen Schaltung in SG weiter verbessert. Hier präsentieren wir Ihnen eine ausführliche und praktische Anleitung für die Zubereitung von Rückenmark Scheiben und zeigen repräsentative ganze Zelle Aufnahme und morphologischen Ergebnisse. Dieses Protokoll ermöglicht ideale neuronalen Erhaltung und in-Vivo -Bedingungen bis zu einem gewissen Grad zu imitieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, die Fähigkeit, eine in-vitro- Vorbereitung des Rückenmarks Scheiben zu erhalten ermöglicht stabile Strom und Spannung-Klemme Aufnahmen und könnte somit detaillierte Untersuchungen in der inneren Membran Eigenschaften, lokalen Schaltung erleichtern und neuronale Struktur mit vielfältigen experimentellen Ansätzen.

Akuten Rückenmark Scheiben wurden entsprechend dem Diagramm in Abbildung 1dargestellte vorbereitet. Nach dem Schneiden und Wiederherstellung wurde eine Rückenmark-Scheibe zur Aufnahme Kammer übertragen. Gesunde Neuronen wurden identifiziert, basierend auf Soma Auftritt mit IR-DIC Mikroskopie. Als nächstes wurden die Aktionspotentiale der SG Neuronen durch eine Reihe von depolarisierende Stromimpulse (1 s Dauer) ausgelöst wenn Neuronen bei RMP gehalten wu...

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Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Vorbereitung der akuten Rückenmark Scheiben auf Whole-Cell Patch-Clamp-Aufnahme in den Neuronen der Substantia Gelatinosa

Hier beschreiben wir die wesentlichen Schritte für die ganze Zelle Patch-Clamp-Aufnahmen, die von Neuronen der Substantia Gelatinosa (SG) in der in-vitro- Rückenmark-Slice. Diese Methode ermöglicht die innere Membran Eigenschaften, synaptische Übertragung und morphologische Charakterisierung der SG Neuronen untersucht werden.

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

Diese Methode kann helfen, die Spinalmechanismen zugrunde sensorische Übertragung, nozizeptive Regulation und chronische Schmerzen oder Schmerzen Entwicklung zu klären Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es eine ideale neuronale Konservierung ermöglichen kann und es kann In-vivo-Bedingungen bis zu einem gewissen Grad imitieren. Beginnen Sie mit dem Ziehen von Aufnahmeelektroden aus Borosilikatglas-Mikrokapillaren mit einem Kapillarzieher. Dann füllen Sie eine Form mit geschmolzenem Agar, um einen 1,2 Zentimeter mal 1,5 Zentimeter mal 2,0 Zentimeter großen Agarblock vorzubereiten.Trimmen Sie den Block, um einen zentralen Kanal zu haben, wenn Querabschnitte geplant werden. Oder ein Kanalfleisch mit der Kante des Blocks für parasagittale Abschnitte. Vor der transkardialen Profusion und Rückenmarksextraktion 500 Milliliter Saccharose-basierte ACSF vorbereiten.Kühlen Sie die Lösung auf Eiseskälte und gleichnden Sie mit 95%O2 und 5%CO2. Kühlen Sie alle Sezierwerkzeuge auf Eis. Machen Sie einen längs fünf Zentimeter großen Schnitt auf der Rückenhaut von kaudal zu rostral.Dann durchschneiden Sie den Rippenkäfig zwischen der Wirbelsäule und den Rippen auf beiden Seiten. Verwenden Sie eine Schere, um einen Schnitt am kaudalen Ende der Wirbelsäule zu machen. Schneiden Sie dann die umgebenden Gewebe ab und isolieren Sie schnell das lumbosakrale Segment der Wirbelsäule.Übertragen Sie das lumbosakrale Segment auf eine Glasschale mit eiskalter Saccharose-Basis ACSF. Mit der ventralen Seite nach oben, verwenden Sie eine feine Schere, um durch den Wirbel Pedikle bilateral zu schneiden und das Rückenmark sorgfältig auszusetzen. Isolieren Sie einen zwei Zentimeter langen Teil des Rückenmarks mit der lumbosakralen Vergrößerung und übertragen Sie den Wirbelsäulenbereich in eine andere Glasschale, die mit kalter Saccharose ACSF gefüllt ist.Arbeiten Sie unter einem Seziermikroskop, um die Meningen und die Pia arachnoiden Membran zu entfernen. Schneiden Sie alle ventralen und dorsalen Wurzeln so schnell wie möglich weg. Achten Sie darauf, die Verletzung des Rückenmarks zu vermeiden, insbesondere das Rückenhorn beim Entfernen der Hirnhaut und der Wirbelsäulenwurzeln.Legen Sie das Rückenmark auf den zuvor getrimmten Agarblock. Um Querscheiben vorzubereiten, befestigen Sie die ventrale Seite des Rückenmarks mit der Rückenseite an den Agar mit der Rückenseite zur Klinge. Um parasagittale Scheiben vorzubereiten, befestigen Sie die ventrale Seite mit Superkleber an den Agar in vertikaler Richtung.Dann montieren Sie den Agarblock auf einer Plattform eines Vibratome mit Superkleber. Und bereiten Sie 300 bis 500 Mikron Quer- oder Parasagittalscheiben mit einer fortgeschrittenen Geschwindigkeit von 0,025 Millimetern pro Sekunde und einer Schwingungsfrequenz von 80 Hertz vor. Das Rückenmark sollte dorso-ventral in Scheiben geschnitten werden.Für die besten Ergebnisse sollte die Scheibe innerhalb von 15 bis 20 Minuten vorbereitet werden. Die Dicke der Wirbelsäulenscheibe sollte nicht mehr als 600 Mikrometer betragen, um die Sichtbarkeit der Zelle zu gewährleisten. Verwenden Sie eine kunststoffbeschnittene Pipette, um die Scheiben auf Nylongewebe in einer Lagerkammer zu übertragen, die kontinuierlich sauerstoffhaltige ACSF bei 32 Grad Celsius enthält.Um Ganzzellpatch-Klemmenaufnahmen von substantia gelatinosa oder SG Neuronen durchzuführen, verwenden Sie kaliumionenbasierte intrazelluläre Lösungen für die Aufzeichnung, während Cäsiumkation basierte Lösung nur für die Aufzeichnung von hemmenden postsynaptischen Strömen angewendet wird. Bewegen Sie die Rückenmarksscheibe vorsichtig in die Aufnahmekammer. Und dann stabilisieren Sie es fest mit einem U-förmigen Platindraht mit Nylonfäden für optimale Scheibenstabilität.Die Scheibe mit geblasenem ACSF bei Raumtemperatur kontinuierlich überspritzen und die Überflussrate auf zwei bis vier Milliliter pro Minute einstellen, um eine ausreichende Sauerstoffversorgung zu erreichen. Identifizieren Sie dann mithilfe einer Mikroskoplinse mit niedriger Auflösung die Region der SG-Neuronen als transluzentes Band. Wählen Sie ein gesundes Neuron, das sich durch eine dreidimensionale Form mit einer hellen und glatten Membran als Zielzelle mit dem hochauflösenden Objektiv auszeichnet, und passen Sie es an die Mitte des Videobildschirms an.Füllen Sie eine Mikropipette mit einem geeigneten Volumen an Kaliumionen- oder Cäsiumionenbasis intrazellulärer Lösung. Legen Sie dann die Mikropipette in den Elektrodenhalter ein und stellen Sie sicher, dass die intrazelluläre Lösung den Silberdraht im Inneren des Halters anspricht. Bringen Sie die Mikropipette in den Fokus und verwenden Sie den Mikromanipulator, um sie in den ACSF einzutauchen.Wenden Sie einen leichten positiven Druck an, um Schmutz und Schmutz zu entfernen. Bewegen Sie die Mikropipette nach und nach in Richtung des Zielneurons. Sobald sich die Pipette dem Neuron nähert und sich ein sehr kleiner Dimple auf der neuronalen Membran bildet, geben Sie den positiven Druck frei, ein Gigaseal zu bilden.Ändern Sie das Haltepotenzial auf minus 70 Millivolt, was in der Nähe des physiologischen Ruhemembranpotentials einer Zelle liegt. Dann wenden Sie eine transiente und sanfte Absaugung auf die Mikropipette an, um die Membran zu brechen und eine gute Ganzzellkonfiguration zu schaffen. Zeichnen Sie die Brenneigenschaften auf, indem Sie das Brennmuster jedes Neurons in stromaktueller Klemme mit einer Reihe von einer Sekunde depolarisierenden Stromimpulsen von 25 bis 150 Picoamps mit 25 Picoamp-Schritten beim ruhenden Membranpotential testen.Um somatische Unterschwellenströme aufzuzeichnen, halten Sie das Membranpotential bei minus 50 Millivolt im Spannungsklemmenmodus und wenden dann eine Reihe von hyperpolierenden Spannungsimpulsen von einer Sekunde Dauer von minus 60 Millivolt bis minus 120 Millivolt mit einem 10 Millivolt-Dekrement an. Zeichnen Sie exzitatorische postsynaptische Ströme mit der kaliumionsbasierten intrazellulären Lösung im Spannungsklemmenmodus bei einem Haltepotenzial von minus 70 Millivolt auf. Zeichnen Sie IPCKs mit Cäsium-Ionen-basierter intrazellulärer Lösung für die Aufzeichnung von IPSc auf.Nachdem Sie das Membranpotential etwa fünf Minuten lang bei minus 70 Millivolt gehalten haben, ändern Sie das Haltepotential schrittweise auf null Millivolt. Warten Sie einige Minuten nach der Stabilisierung, und beginnen Sie dann mit der Aufzeichnung der IPSC-Ereignisse. Brennmuster, die durch Injektion einer Reihe von einer Sekunde depolarisierenden Stromimpulsen in ein SG-Neuron am ruhenden Membranpotential bestimmt werden, können als tonisch feuerndes, verzögertes Brennen, Lückenschießen, Initial-Burst, Phasic-Bursting, Single-Spike und Reluctant-Firing klassifiziert werden.Dieses Bild zeigt das evozierende Protokoll für Unterschwellenströme in spannungsklemme. Diese repräsentativen Spuren zeigen die Reaktion auf hyperpolarisierende Strominjektionen, die als IH, IA und IT klassifiziert sind. Dies ist eine repräsentative Spur von SEPSc von SG Neuronen bei minus 70 Millivolt in Abwesenheit und Vorhandensein von 50 Mikromolar APV und 20 Mikromolar CNQX aufgezeichnet. Diese Ablaufverfolgung zeigt die aufgezeichneten SEPCs vor dem Hinzufügen von APV und CNQX auf einer erweiterten Zeitskala.Nach diesem Verfahren können die Methoden wie gepaarte Patch-Klemmen-Aufnahmen oder Optogenetik durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Charakterisierung spezifischer neuronaler Mikrokreise bei substantia gelatinein.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

Elektrophysiologische und morphologische Charakterisierung neuronaler Schaltkreise in akuten Hirnschnitten Mit Paired-Patch-Clamp-Aufnahmen

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Forschung

Neurowissenschaften

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen in Hirnschnitten

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Die Herstellung von Oblique Spinal Cord Slices für Ventralwurzel Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Ganzzellige Patch-Clamp-Aufnahmen zur elektrophysiologischen Bestimmung der Ionenselektivität in Channelrhodopsinen

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Anwendung von automatisierten Bild-geführten Patch-Clamp für die Studie von Neuronen in Gehirn-Scheiben

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

Auditory Brainstem Response und äußeren Haarzellen Whole-Cell Patch Clamp Aufnahme bei postnatalen Ratten

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Vorbereitungen und Protokolle für die ganze Zelle Patch Clamp Aufnahme von Xenopus Laevis Tectal Neuronen

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology

Bewertung der synaptischen Multiplizität mit Whole-Cell Patch-Clamp-Elektrophysiologie

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic ...

Preparation of Acute Slices from Dorsal Hippocampus for Whole-Cell Recording and Neuronal Reconstruction in the Dentate Gyrus of Adult Mice

Vorbereitung von akuten Scheiben aus dem Dorsal Hippocampus für die Ganzzellaufnahme und neuronale Rekonstruktion im Dentate Gyrus von erwachsenen Mäusen

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in ...

Hypothalamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings

Hypothalamische Kisspeptin-Neurone als Ziel für Ganzzell-Patch-Clamp-Ableitungen

Kisspeptins are essential for the maturation of the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis and fertility. Hypothalamic kisspeptin neurons located in ...