Name: preparation of acute spinal cord slices for whole-cell patch-clamp recording in substantia gelatinosa neurons
Uploaded: 2019-01-18T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (מס 81560198, 31660289).

כל הפרוטוקולים ניסיוני תיאר אושרו על-ידי חיה אתיקה הוועדה של נאנצ'אנג האוניברסיטה (נאנצ'אנג, סין, No.2017 האתית-010). כל המאמצים נעשו כדי למזער את הלחץ והכאב של החיות ניסיוני. ההקלטות אלקטרופיזיולוגיות שבוצעה כאן בוצעו בטמפרטורת החדר (RT, 22 – 25 ° C).
1. בעלי חיים
<ol><li>השתמש חולדות ספר?...

<ol>
	<li>Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+circuitry+for+pain+processing+in+the+dorsal+horn.">Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).</li><li>Yoshimura, M., Nishi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blind+patch-clamp+recordings+from+substantia+gelatinosa+neurons+in+adult+rat+spinal+cord+slices:+pharmacological+properties+of+synaptic+currents.">Blind patch-clamp recordings from substantia gelatinosa neurons in adult rat spinal cord slices: pharmacological properties of synaptic currents.</a> Neuroscience. 53 (2), 519-526 (1993).</li><li>Maxwell, D. J., Belle, M. D., Cheunsuang, O., Stewart, A., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+of+inhibitory+and+excitatory+interneurons+in+superficial+laminae+of+the+rat+dorsal+horn.">Morphology of inhibitory and excitatory interneurons in superficial laminae of the rat dorsal horn.</a> The Journal of Physiology. 584 (Pt. 2, 521-533 (2007).</li><li>Grudt, T. J., Perl, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlations+between+neuronal+morphology+and+electrophysiological+features+in+the+rodent+superficial+dorsal+horn.">Correlations between neuronal morphology and electrophysiological features in the rodent superficial dorsal horn.</a> The Journal of Physiology. 540 (Pt 1), 189-207 (2002).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+feed-forward+spinal+cord+glycinergic+neural+circuit+gates+mechanical+allodynia.">A feed-forward spinal cord glycinergic neural circuit gates mechanical allodynia.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (9), 4050-4062 (2013).</li><li>Zheng, J., Lu, Y., Perl, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+neurones+of+the+spinal+substantia+gelatinosa+mediate+interaction+of+signals+from+primary+afferents.">Inhibitory neurones of the spinal substantia gelatinosa mediate interaction of signals from primary afferents.</a> The Journal of Physiology. 588 (Pt 12), 2065-2075 (2010).</li><li>Balasubramanyan, S., Stemkowski, P. L., Stebbing, M. J., Smith, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sciatic+chronic+constriction+injury+produces+cell-type-specific+changes+in+the+electrophysiological+properties+of+rat+substantia+gelatinosa+neurons.">Sciatic chronic constriction injury produces cell-type-specific changes in the electrophysiological properties of rat substantia gelatinosa neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 96 (2), 579-590 (2006).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+signal-regulated+kinase+(ERK)+activation+is+required+for+itch+sensation+in+the+spinal+cord.">Extracellular signal-regulated kinase (ERK) activation is required for itch sensation in the spinal cord.</a> Molecular Brain. 7, 25 (2014).</li><li>Kopach, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+alters+trafficking+of+extrasynaptic+AMPA+receptors+in+tonically+firing+lamina+II+neurons+of+the+rat+spinal+dorsal+horn.">Inflammation alters trafficking of extrasynaptic AMPA receptors in tonically firing lamina II neurons of the rat spinal dorsal horn.</a> Pain. 152 (4), 912-923 (2011).</li><li>Takasu, K., Ono, H., Tanabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+cation+channels+at+primary+afferent+terminals+contribute+to+chronic+pain.">Spinal hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channels at primary afferent terminals contribute to chronic pain.</a> Pain. 151 (1), 87-96 (2010).</li><li>Iura, A., Takahashi, A., Hakata, S., Mashimo, T., Fujino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reductions+in+tonic+GABAergic+current+in+substantia+gelatinosa+neurons+and+GABAA+receptor+delta+subunit+expression+after+chronic+constriction+injury+of+the+sciatic+nerve+in+mice.">Reductions in tonic GABAergic current in substantia gelatinosa neurons and GABAA receptor delta subunit expression after chronic constriction injury of the sciatic nerve in mice.</a> European Journal of Pain. 20 (10), 1678-1688 (2016).</li><li>Alles, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve+injury+increases+contribution+of+L-type+calcium+channels+to+synaptic+transmission+in+spinal+lamina+II:+Role+of+alpha2delta-1+subunits.">Peripheral nerve injury increases contribution of L-type calcium channels to synaptic transmission in spinal lamina II: Role of alpha2delta-1 subunits.</a> Molecular Pain. 14, 1-12 (2018).</li><li>Santos, S. F., Rebelo, S., Derkach, V. A., Safronov, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitatory+interneurons+dominate+sensory+processing+in+the+spinal+substantia+gelatinosa+of+rat.">Excitatory interneurons dominate sensory processing in the spinal substantia gelatinosa of rat.</a> The Journal of Physiology. 581 (Pt 1), 241-254 (2007).</li><li>Lu, Y., Perl, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+organization+of+excitatory+circuits+between+neurons+of+the+spinal+superficial+dorsal+horn+(laminae+I+and+II).">Modular organization of excitatory circuits between neurons of the spinal superficial dorsal horn (laminae I and II).</a> The Journal of Neuroscience. 25 (15), 3900-3907 (2005).</li><li>Hantman, A. W., van den Pol, A. N., Perl, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+physiological+features+of+a+set+of+spinal+substantia+gelatinosa+neurons+defined+by+green+fluorescent+protein+expression.">Morphological and physiological features of a set of spinal substantia gelatinosa neurons defined by green fluorescent protein expression.</a> The Journal of Neuroscience. 24 (4), 836-842 (2004).</li><li>Yasaka, T., Tiong, S. Y., Hughes, D. I., Riddell, J. S., Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Populations+of+inhibitory+and+excitatory+interneurons+in+lamina+II+of+the+adult+rat+spinal+dorsal+horn+revealed+by+a+combined+electrophysiological+and+anatomical+approach.">Populations of inhibitory and excitatory interneurons in lamina II of the adult rat spinal dorsal horn revealed by a combined electrophysiological and anatomical approach.</a> Pain. 151 (2), 475-488 (2010).</li><li>Yin, H., Park, S. A., Han, S. K., Park, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+5-hydroxytryptamine+on+substantia+gelatinosa+neurons+of+the+trigeminal+subnucleus+caudalis+in+immature+mice.">Effects of 5-hydroxytryptamine on substantia gelatinosa neurons of the trigeminal subnucleus caudalis in immature mice.</a> Brain Research. 1368, 91-101 (2011).</li><li>Hu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lidocaine+Inhibits+HCN+Currents+in+Rat+Spinal+Substantia+Gelatinosa+Neurons.">Lidocaine Inhibits HCN Currents in Rat Spinal Substantia Gelatinosa Neurons.</a> Anesthesia and Analgesia. 122 (4), 1048-1059 (2016).</li><li>Peng, H. Z., Ma, L. X., Lv, M. H., Hu, T., Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minocycline+enhances+inhibitory+transmission+to+substantia+gelatinosa+neurons+of+the+rat+spinal+dorsal+horn.">Minocycline enhances inhibitory transmission to substantia gelatinosa neurons of the rat spinal dorsal horn.</a> Neuroscience. 319, 183-193 (2016).</li><li>Peng, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+presynaptic+HCN+channels+to+excitatory+inputs+of+spinal+substantia+gelatinosa+neurons.">Contribution of presynaptic HCN channels to excitatory inputs of spinal substantia gelatinosa neurons.</a> Neuroscience. 358, 146-157 (2017).</li><li>Liu, N., Zhang, D., Zhu, M., Luo, S., Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minocycline+inhibits+hyperpolarization-activated+currents+in+rat+substantia+gelatinosa+neurons.">Minocycline inhibits hyperpolarization-activated currents in rat substantia gelatinosa neurons.</a> Neuropharmacology. 95, 110-120 (2015).</li><li>Brown, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+whole-cell+recording+from+visually+preselected+neurons+of+perirhinal+cortex+in+brain+slices+from+young+and+aging+rats.">Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats.</a> Journal of Neuroscience Methods. 86 (1), 35-54 (1998).</li><li>Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurotoxicity+of+excitatory+amino+acids+is+produced+by+passive+chloride+influx.">The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx.</a> The Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).</li><li>Rice, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+ascorbate+in+the+preparation+and+maintenance+of+brain+slices.">Use of ascorbate in the preparation and maintenance of brain slices.</a> Methods. 18 (2), 144-149 (1999).</li><li>Takasu, K., Ogawa, K., Minami, K., Shinohara, S., Kato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injury-specific+functional+alteration+of+N-type+voltage-gated+calcium+channels+in+synaptic+transmission+of+primary+afferent+C-fibers+in+the+rat+spinal+superficial+dorsal+horn.">Injury-specific functional alteration of N-type voltage-gated calcium channels in synaptic transmission of primary afferent C-fibers in the rat spinal superficial dorsal horn.</a> European Journal of Pharmacology. 772, 11-21 (2016).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitatory+synaptic+transmission+in+the+spinal+substantia+gelatinosa+is+under+an+inhibitory+tone+of+endogenous+adenosine.">Excitatory synaptic transmission in the spinal substantia gelatinosa is under an inhibitory tone of endogenous adenosine.</a> Neuroscience Letters. 477 (1), 28-32 (2010).</li><li>Funai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+dexmedetomidine+augments+inhibitory+synaptic+transmission+in+the+superficial+dorsal+horn+through+activation+of+descending+noradrenergic+control:+an+in+vivo+patch-clamp+analysis+of+analgesic+mechanisms.">Systemic dexmedetomidine augments inhibitory synaptic transmission in the superficial dorsal horn through activation of descending noradrenergic control: an in vivo patch-clamp analysis of analgesic mechanisms.</a> Pain. 155 (3), 617-628 (2014).</li><li>Yamasaki, H., Funai, Y., Funao, T., Mori, T., Nishikawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+tramadol+on+substantia+gelatinosa+neurons+in+the+rat+spinal+cord:+an+in+vivo+patch-clamp+analysis.">Effects of tramadol on substantia gelatinosa neurons in the rat spinal cord: an in vivo patch-clamp analysis.</a> PLoS One. 10 (5), e0125147 (2015).</li><li>Furue, H., Narikawa, K., Kumamoto, E., Yoshimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responsiveness+of+rat+substantia+gelatinosa+neurones+to+mechanical+but+not+thermal+stimuli+revealed+by+in+vivo+patch-clamp+recording.">Responsiveness of rat substantia gelatinosa neurones to mechanical but not thermal stimuli revealed by in vivo patch-clamp recording.</a> The Journal of Physiology. 521 (Pt 2), 529-535 (1999).</li><li>Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+brain+slice+methods+for+adult+and+aging+animals:+application+of+targeted+patch+clamp+analysis+and+optogenetics.">Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics.</a> Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).</li><li>Ting, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Acute+Brain+Slices+Using+an+Optimized+N-Methyl-D-glucamine+Protective+Recovery+Method.">Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e53825 (2018).</li><li>Li, J., Baccei, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+Tissue+Damage+Promotes+Spike+Timing-Dependent+Synaptic+Long-Term+Potentiation+in+Adult+Spinal+Projection+Neurons.">Neonatal Tissue Damage Promotes Spike Timing-Dependent Synaptic Long-Term Potentiation in Adult Spinal Projection Neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (19), 5405-5416 (2016).</li><li>Ford, N. C., Ren, D., Baccei, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NALCN+channels+enhance+the+intrinsic+excitability+of+spinal+projection+neurons.">NALCN channels enhance the intrinsic excitability of spinal projection neurons.</a> Pain. , (2018).</li><li>Cui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+synaptic+transmission+from+primary+afferents+to+spinal+substantia+gelatinosa+neurons+by+group+III+mGluRs+in+GAD65-EGFP+transgenic+mice.">Modulation of synaptic transmission from primary afferents to spinal substantia gelatinosa neurons by group III mGluRs in GAD65-EGFP transgenic mice.</a> Journal of Neurophysiology. 105 (3), 1102-1111 (2011).</li><li>Yang, K., Ma, R., Wang, Q., Jiang, P., Li, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optoactivation+of+parvalbumin+neurons+in+the+spinal+dorsal+horn+evokes+GABA+release+that+is+regulated+by+presynaptic+GABAB+receptors.">Optoactivation of parvalbumin neurons in the spinal dorsal horn evokes GABA release that is regulated by presynaptic GABAB receptors.</a> Neuroscience Letters. , 55-59 (2015).</li></ol>

פרטים זה פרוטוקול השלבים להכנת פרוסות בחוט השדרה, אשר השתמשנו בהצלחה בעת ביצוע ניסויים תאים כל תיקון-קלאמפ ב ס ג נוירונים18,19,20,21. על-ידי יישום שיטה זו, דיווחנו לאחרונה minocycline, דור שני של טטרציקלין, יכול לשפר במידה ניכרת הס...

Gelatinosa הסובסטנציה (SG, הנדן השנייה של ' קרן ' בעמוד השדרה הגבי) היא מרכז חשוב עוררין ממסר עבור משדר וויסות מידע חושי. הוא מורכב interneurons סינאפסות, אשר מקבלים תשומות הסיבים מביא העיקרי, interneurons מקומיים, מעכבות מערכת יורד1אנדוגני. במהלך העשורים האחרונים, הפיתוח של חוט השדרה חריפה פרוסה הכנה, כניסתו של תאים כל תיקון-קלאמפ הקלטה אפשרו מחקרים שונים המאפיינים אלקטרופיזיולוגיות ו מורפולוגי פנימי של ס ג נוירונים2, 3 , 4 , כמו גם מחקרים של המעגלים המקומיות ב ס ג5,6. בנוסף, באמצעות במבחנה חוט השדרה פרוסה ההכנה, חוקרים יכולים לפרש את השינויים ב-7,excitabilities עצביים8, הפונקציה של יון ערוצי9,10, ו פעילות סינפטית11,12 בתנאים פתולוגיים שונים. מחקרים אלה יש העמיקה הבנתנו התפקיד כי ס ג נוירונים לשחק בפיתוח ותחזוקה של נוירופתי בגירוד וכאב כרוני.
במהותה, היא תנאי מוקדם מפתח כדי להשיג פריט חזותי ברור של סומא עצביים, אידיאלי תאים כל תיקון חוט השדרה חריפה בפרוסות כדי להבטיח את איכות מעולה של פרוסות אז ניתן להשיג את הנוירונים patchable ובריאה. עם זאת, הכנת חוט השדרה פרוסות כרוך במספר שלבים, כגון ביצוע laminectomy הגחוני של הסרת קרום pia-בחופשיות, אשר עשוי להיות מכשולים בהשגת פרוסות בריא. למרות שלא קל להכין פרוסות חוט השדרה, ביצוע הקלטות במבחנה על חוט השדרה פרוסות יש מספר יתרונות. לעומת ההכנות התרבות תאים, חוט השדרה פרוסות יכול חלקית לשמר קשרים סינפטיים הגלום שנמצאים במצב רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. בנוסף, תיקון שלם-תא-הקלטה באמצעות חוט השדרה פרוסות קלאמפ יכול להיות בשילוב עם טכניקות אחרות, כגון תיקון כפול קלאמפ13,14,15,מחקרים מורפולוגי16 תא בודד RT-PCR 17. לכן, טכניקה זו מספקת מידע נוסף על אפיון את הבדלים אנטומיים, גנטיים בתוך אזור מסוים, מאפשר חקירה של ההרכב של המעגלים המקומיות.
כאן, אנו מספקים תיאור בסיסי ומפורט של השיטה שלנו עבור הכנת חריפה השדרה פרוסות ורכישת תאים כל תיקון-קלאמפ הקלטות מ ג נוירונים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF and PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60130</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF, and K+-based intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71500</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF and PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5080</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5280</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7631</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7903</td>
			<td>Used for the preparation of sucrose-ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-gluconate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>169-11835</td>
			<td>Used for the preparation of K+-based intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2-Phosphocreatine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1937</td>
			<td>Used for the preparation of intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td>Used for the preparation of intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td>Used for the preparation of intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187</td>
			<td>Used for the preparation of intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Li-GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5884</td>
			<td>Used for the preparation of intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsMeSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1426</td>
			<td>Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3011</td>
			<td>Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEA-Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2265</td>
			<td>Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobiotin 488</td>
			<td>Vector</td>
			<td>SP-1145</td>
			<td>0.05% neurobiotin 488 could be used for morphological studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7002</td>
			<td>3% agar block was used in our protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>4% paraformaldehyde was used for immunohistochemical processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Hengxing Chemical Reagents</td>
			<td></td>
			<td>Used for the preparation of PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mount Coverslipping Medium</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>18606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urethan</td>
			<td>National Institute for Food and Drug Control</td>
			<td>30191228</td>
			<td>1.5 g/kg, i.p.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW150F-4</td>
			<td>1.5 mm OD, 1.12 mm ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Used for the preparation of micropipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table</td>
			<td>Technical Manufacturing Corporation</td>
			<td>63544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared CCD camera</td>
			<td>Dage-MIT</td>
			<td>IR-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch-clamp amplifier</td>
			<td>HEKA</td>
			<td>EPC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MP-285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Y stage</td>
			<td>Burleigh</td>
			<td>GIBRALTAR X-Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer</td>
			<td>Advanced</td>
			<td>FISKE 210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>FE20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocol microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 700</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of acute spinal cord slices for whole-cell patch-clamp recording in substantia gelatinosa neurons

מחקרים שנעשו לאחרונה תאים כל תיקון-קלאמפ של נוירונים הסובסטנציה gelatinosa (SG) סיפקו גוף גדול של מידע אודות המנגנונים בעמוד השדרה שידור חושית, תקנה nociceptive ופיתוח כרוני כאב או גירוד. מימושים של הקלטות אלקטרופיזיולוגיות יחד עם לימודי מורפולוגי המבוסס על השירות של חוט השדרה חריפה פרוסות השתפרו עוד יותר את ההבנה שלנו של מאפייני עצביים, ההרכב של המעגלים המקומיות ב ס ג. כאן, אנו מציגים מדריך מפורט ומעשי עבור הכנת חוט השדרה פרוסות הצג נציג כל-תא ולהקליט תוצאות מורפולוגי. פרוטוקול זה מאפשר שימור עצביים אידיאלי, ניתן לחקות תנאים ויוו במידה מסוימת. לסיכום, היכולת לקבל הכנה של במבחנה של חוט השדרה פרוסות מאפשרת יציבה זרם, מתח-להדק הקלטות, ובכך יכול להקל על נתונים היסטוריים חקירות המאפיינים קרום פנימי, המעגלים המקומיות, מבנה עצביים באמצעות גישות מגוונות.

חוט השדרה חריפה פרוסות הוכנו על פי התרשים המוצג באיור1. לאחר חיתוך שחזור, פרוסה חוט השדרה הועברה לחדר ההקלטה. נוירונים בריא אותרו על סמך מראה חיצוני סומא באמצעות מיקרוסקופ IR-DIC. הבא, פוטנציאל פעולה של ס ג נוירונים היינו שהפיק סדרה של depolarizing פולסים הנוכחי (מש...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons at JoVE.com

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

הכנה של חוט השדרה חריפה פרוסות תאים כל תיקון-קלאמפ הקלטה בנוירונים הסובסטנציה Gelatinosa

כאן, אנו מתארים את השלבים החיוניים להקלטות תאים כל תיקון-קלאמפ זני הסובסטנציה gelatinosa (SG) נוירונים בתוך הפרוסה חוט שדרה במבחנה . שיטה זו מאפשרת את מאפייני קרום פנימי, הסינאפסית ואפיון מורפולוגי של ס ג נוירונים שילמדו.

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

שיטה זו יכולה לעזור להבהיר את מנגנוני עמוד השדרה שבבסיס שידור חושי, ויסות nociceptive וכאב כרוני או התפתחות כאב היתרון העיקרי של טכניקה זו היא שזה יכול לאפשר שימור עצבי אידיאלי והוא יכול לחקות תנאים in-vivo במידה מסוימת. התחל על ידי משיכת אלקטרודות הקלטה ממיקרו-capillaries זכוכית borosilicate באמצעות מושך נימי. לאחר מכן, למלא תבנית עם אגר מותך להכין 1.2 ס"מ על ידי 1.5 ס"מ על ידי 2.0 ס"מ אגר בלוק.חתוך את הבלוק לערוץ מרכזי אם אתה מתכנן מקטעים רוחביים. או בשר ערוץ עם קצה הבלוק עבור חלקים parasagittal. לפני שפע transcardial ומיצוי חוט השדרה, להכין 500 מיליליטר של סוכרוז מבוסס ACSF.קירור הפתרון לקור כקרח ומצייד ב-95%O2 וב-5%CO2. מקררים את כל כלי הניתוח על הקרח. הפוך חתך אורך חמישה סנטימטרים על העור האחורי מן caudal כדי rostral.לאחר מכן, לחתוך דרך כלוב הצלעות בין עמוד השדרה והצלעות משני הצדדים. השתמש במספריים כדי לחתוך בקצה caudal של עמוד השדרה. ואז לחתוך את הרקמות שמסביב במהירות לבודד את קטע lumbosacral של עמוד השדרה.מעבירים את קטע הלומבוסקרל לצלחת זכוכית המכילה סוכרוז קר כקרח מבוסס ACSF. כאשר הצד הגחון כלפי מעלה, השתמש במספריים עדין כדי לחתוך את פדיקל החוליות באופן דו-צדדי ולחשוף את חוט השדרה בזהירות. לבודד קטע באורך שני סנטימטרים של חוט השדרה עם הגדלת lumbosacral ולהעביר את קטע עמוד השדרה לתוך צלחת זכוכית אחרת מלא סוכרוז קר ACSF.עבודה תחת מיקרוסקופ ניתוח כדי להסיר את קרום הלחם ואת קרום פיא ארכנואיד. חותכים את כל השורשים הגחוני והדורסי מהר ככל האפשר. יש להיזהר מפגיעה בחוט השדרה, במיוחד בקרן הגבית בעת הסרת קרום המוח ושורשי עמוד השדרה.מניחים את חוט השדרה על גוש אגר שבעבר נחתך. כדי להכין פרוסות רוחביות, חבר את הצד הגחוני של חוט השדרה לאגר עם הצד הגבי לכיוון הלהב. להכנת פרוסות parasagittal, לחבר את הצד הגחון עם דבק סופר אגר בכיוון אנכי.לאחר מכן, הר את גוש אגר לפלטפורמה של רטט עם דבק-על. והכן 300 עד 500 מיקרון פרוסות רוחביות או parasagittal עם מהירות מתקדמת של 0.025 מילימטרים לשנייה ותדר רטט של 80 הרץ. חוט השדרה צריך להיות פרוס דורסו-ventrally.לקבלת התוצאות הטובות ביותר, יש להכין את הפרוסה תוך 15 עד 20 דקות. עובי פרוסת עמוד השדרה צריך להיות לא יותר מ 600 מיקרון כדי לספק את הראות של התא. השתמש פיפטה קצוצה פלסטיק להעביר את הפרוסות על רשת ניילון בתא אחסון המכיל ACSF מחומצן ברציפות ב 32 מעלות צלזיוס.כדי לנהל הקלטות מהדק טלאי שלם מתאי ג'לטינוסה או SG, השתמש בפתרונות תאיים מבוססי אשלגן יון להקלטה תוך החלת פתרון מבוסס צסיום רק להקלטה של זרמים פוסט סינפטיים מעכבים. מעבירים בעדינות את פרוסת חוט השדרה לתא ההקלטה. ואז לייצב אותו בחוזקה עם חוט פלטינה בצורת U עם חוטי ניילון ליציבות פרוסה אופטימלית.יש לנפח בהתמדה את הפרוסה עם ACSF מבעבע בטמפרטורת החדר ולהגדיר את קצב ההתנפחות על שניים עד ארבעה מיליליטר לדקה כדי להשיג חמצון מספיק. לאחר מכן, באמצעות עדשת מיקרוסקופ ברזולוציה נמוכה, לזהות את האזור של נוירונים SG כמו רצועה שקופה. בחר נוירון בריא, המאופיין בצורה תלת מימדית עם קרום בהיר וחלק כתא היעד באמצעות המטרה ברזולוציה גבוהה ולהתאים אותו למרכז מסך צג הווידאו.מלאו פיפסה זעירה בנפח מתאים של תווי יון אשלגן או פתרון תאי המבוסס על יון צסיום. לאחר מכן הכנס את המיקרו-פיפטה למחזיק האלקטרודה וודא שהתסופה תאית יוצרת קשר עם חוט הכסף בתוך המחזיק. הכניסו את המיקרו פיפטה לפוקוס ולהשתמש במיקרומניפולטור כדי לטבול אותו ב-ACSF.החל לחץ חיובי קל כדי לכפות משם כל לכלוך ופסולת. הזז בהדרגה את המיקרו פיפטה לכיוון הנוירון הממוקד. ברגע שהפיפטה מתקרבת לנוירון וגומה קטנה מאוד נוצרת על הממברנה העצבית, שחררו את הלחץ החיובי כדי ליצור ג'יגה-זל.לשנות את פוטנציאל ההחזקה למינוס 70 מילי-וולט, וזה קרוב לפוטנציאל הממברנה הפיזיולוגי של תא. לאחר מכן, יש למרוח יניקה נדונה ועדינה על המיקרו פיפטה כדי לקרוע את הממברנה וליצור תצורה טובה של תא שלם. שיא תכונות ירי על ידי בדיקת דפוס הירי של כל נוירון מהדק הנוכחי עם סדרה של שנייה אחת depolarizing פולסים הנוכחי של 25 כדי 150 picoamps עם 25 מרווחים picoamp במנוחה פוטנציאל קרום.כדי להקליט זרמי תת-אחיזה סומטיים, החזק את פוטנציאל הממברנה במינוס 50 מילי-וולט במצב מהדק מתח ולאחר מכן החל סדרה של פולסים מתח היפרפולאריזציה של משך שניה אחת ממינוס 60 מילי-וולט למינוס 120 מילי-וולט עם הפחתה של 10 מילי-וולט. הקלט זרמים סינפטיים סינציוניים עם פתרון תאי מבוסס יון אשלגן במצב מהדק מתח בפוטנציאל החזקה של מינוס 70 מילי-וולט. הקלט IPSC של באמצעות פתרון תאי מבוסס יון צסיום לרישום IPSC של.לאחר החזקת פוטנציאל הממברנה במינוס 70 מילי-וולט למשך כחמש דקות, לשנות בהדרגה את פוטנציאל ההחזקה לאפס מילי-וולט. המתן מספר דקות לייצוב ולאחר מכן התחל לתעד את אירועי IPSC. דפוסי ירי שנקבעו על ידי הזרקת סדרה של שנייה אחת depolarizing פולסים הנוכחי לתוך נוירון SG במנוחה פוטנציאל קרום עשוי להיות מסווג כמו ירי טוניק, עיכוב ירי, פער ירי, פרץ ראשוני, phasic-מתפרץ, חד ספייק וירי מסרב.תמונה זו מציגה את פרוטוקול מעורר עבור זרמי subthreshold במהדק מתח. עקבות מייצגים אלה מראים את התגובה להזרקה זרם היפרפולאריזציה מסווג IH, IA ו- IT. זהו זכר מייצג של SEPSC של נרשם נוירונים SG במינוס 70 millivolts בהיעדר נוכחות של 50 micromolar APV ו 20 מיקרומולר CNQX. מעקב זה מציג את SEPC של נרשם לפני התוספת של APV ו CNQX על ציר זמן מורחב.בעקבות הליך זה הן השיטות כמו הקלטות מהדק תיקון מזווג או אופטוגנטיקה ניתן לבצע כדי לענות על שאלות נוספות כמו אפיון microcircuits עצבי ספציפי בסובסטנציה ג'לטינוסה.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

אלקטרו ומורפולוגי אפיון של שבבים עצביים במוח חריף Slices שימוש מותאם Patch-קלאמפ הקלטות

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

הקלטות תיקון מהדק כל תא פרוסות המוח

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

הכנת פרוסות קורד אלכסון שדרה עבור גחון רוט גירוי

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

תא שלם תיקון מהדק הקלטות עבור קביעת electrophysiological של יון סלקטיביות ב Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

יישום אוטומטי של תמונה מודרך תיקון מהדק לחקר נוירונים של פרוסות המוח

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

גזע המוח השמיעתית תגובה והקלטה החיצוני תא שיער תיקון שלם-תא קלאמפ בחולדות כמחנכת

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

ההכנות ופרוטוקולים עבור כל תא, תיקון קלאמפ הקלטה של נוירונים Tectal צפרדע רפואית זריזה

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology

הערכה של ריבוי סינפטית באמצעות תאים כל תיקון-קלאמפ אלקטרופיזיולוגיה

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic ...

Preparation of Acute Slices from Dorsal Hippocampus for Whole-Cell Recording and Neuronal Reconstruction in the Dentate Gyrus of Adult Mice

הכנת פרוסות חריפות מהיפוקמפוס הגבי להקלטה של תא שלם ושחזור עצבי בGyrus דנטאטה של עכברים בוגרים

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in ...

Hypothalamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings

נוירוני קיספפטין היפותלמיים כיעד להקלטות מהדק טלאי של תאים שלמים

Kisspeptins are essential for the maturation of the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis and fertility. Hypothalamic kisspeptin neurons located in ...