Name: preparation of acute spinal cord slices for whole-cell patch-clamp recording in substantia gelatinosa neurons
Uploaded: 2019-01-18T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Natural Science Foundation of China (No. 81560198, 31660289).

Tutti i protocolli sperimentali descritti sono stati approvati dall'animale etica Comitato di Università di Nanchang (Nanchang, Cina PR, etico No.2017-010). Tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo lo stress e il dolore degli animali sperimentali. Le registrazioni elettrofisiologiche eseguite qui sono state effettuate a temperatura ambiente (RT, 22 – 25 ° C).
1. gli animali
<ol><li>Utilizzare ratti Sprague-Dawley (3 – 5 settimane) di entrambi i sessi. Casa gli animali so...

<ol>
	<li>Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+circuitry+for+pain+processing+in+the+dorsal+horn.">Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).</li><li>Yoshimura, M., Nishi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blind+patch-clamp+recordings+from+substantia+gelatinosa+neurons+in+adult+rat+spinal+cord+slices:+pharmacological+properties+of+synaptic+currents.">Blind patch-clamp recordings from substantia gelatinosa neurons in adult rat spinal cord slices: pharmacological properties of synaptic currents.</a> Neuroscience. 53 (2), 519-526 (1993).</li><li>Maxwell, D. J., Belle, M. D., Cheunsuang, O., Stewart, A., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+of+inhibitory+and+excitatory+interneurons+in+superficial+laminae+of+the+rat+dorsal+horn.">Morphology of inhibitory and excitatory interneurons in superficial laminae of the rat dorsal horn.</a> The Journal of Physiology. 584 (Pt. 2, 521-533 (2007).</li><li>Grudt, T. J., Perl, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlations+between+neuronal+morphology+and+electrophysiological+features+in+the+rodent+superficial+dorsal+horn.">Correlations between neuronal morphology and electrophysiological features in the rodent superficial dorsal horn.</a> The Journal of Physiology. 540 (Pt 1), 189-207 (2002).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+feed-forward+spinal+cord+glycinergic+neural+circuit+gates+mechanical+allodynia.">A feed-forward spinal cord glycinergic neural circuit gates mechanical allodynia.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (9), 4050-4062 (2013).</li><li>Zheng, J., Lu, Y., Perl, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+neurones+of+the+spinal+substantia+gelatinosa+mediate+interaction+of+signals+from+primary+afferents.">Inhibitory neurones of the spinal substantia gelatinosa mediate interaction of signals from primary afferents.</a> The Journal of Physiology. 588 (Pt 12), 2065-2075 (2010).</li><li>Balasubramanyan, S., Stemkowski, P. L., Stebbing, M. J., Smith, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sciatic+chronic+constriction+injury+produces+cell-type-specific+changes+in+the+electrophysiological+properties+of+rat+substantia+gelatinosa+neurons.">Sciatic chronic constriction injury produces cell-type-specific changes in the electrophysiological properties of rat substantia gelatinosa neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 96 (2), 579-590 (2006).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+signal-regulated+kinase+(ERK)+activation+is+required+for+itch+sensation+in+the+spinal+cord.">Extracellular signal-regulated kinase (ERK) activation is required for itch sensation in the spinal cord.</a> Molecular Brain. 7, 25 (2014).</li><li>Kopach, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+alters+trafficking+of+extrasynaptic+AMPA+receptors+in+tonically+firing+lamina+II+neurons+of+the+rat+spinal+dorsal+horn.">Inflammation alters trafficking of extrasynaptic AMPA receptors in tonically firing lamina II neurons of the rat spinal dorsal horn.</a> Pain. 152 (4), 912-923 (2011).</li><li>Takasu, K., Ono, H., Tanabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+cation+channels+at+primary+afferent+terminals+contribute+to+chronic+pain.">Spinal hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channels at primary afferent terminals contribute to chronic pain.</a> Pain. 151 (1), 87-96 (2010).</li><li>Iura, A., Takahashi, A., Hakata, S., Mashimo, T., Fujino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reductions+in+tonic+GABAergic+current+in+substantia+gelatinosa+neurons+and+GABAA+receptor+delta+subunit+expression+after+chronic+constriction+injury+of+the+sciatic+nerve+in+mice.">Reductions in tonic GABAergic current in substantia gelatinosa neurons and GABAA receptor delta subunit expression after chronic constriction injury of the sciatic nerve in mice.</a> European Journal of Pain. 20 (10), 1678-1688 (2016).</li><li>Alles, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve+injury+increases+contribution+of+L-type+calcium+channels+to+synaptic+transmission+in+spinal+lamina+II:+Role+of+alpha2delta-1+subunits.">Peripheral nerve injury increases contribution of L-type calcium channels to synaptic transmission in spinal lamina II: Role of alpha2delta-1 subunits.</a> Molecular Pain. 14, 1-12 (2018).</li><li>Santos, S. F., Rebelo, S., Derkach, V. A., Safronov, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitatory+interneurons+dominate+sensory+processing+in+the+spinal+substantia+gelatinosa+of+rat.">Excitatory interneurons dominate sensory processing in the spinal substantia gelatinosa of rat.</a> The Journal of Physiology. 581 (Pt 1), 241-254 (2007).</li><li>Lu, Y., Perl, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+organization+of+excitatory+circuits+between+neurons+of+the+spinal+superficial+dorsal+horn+(laminae+I+and+II).">Modular organization of excitatory circuits between neurons of the spinal superficial dorsal horn (laminae I and II).</a> The Journal of Neuroscience. 25 (15), 3900-3907 (2005).</li><li>Hantman, A. W., van den Pol, A. N., Perl, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+physiological+features+of+a+set+of+spinal+substantia+gelatinosa+neurons+defined+by+green+fluorescent+protein+expression.">Morphological and physiological features of a set of spinal substantia gelatinosa neurons defined by green fluorescent protein expression.</a> The Journal of Neuroscience. 24 (4), 836-842 (2004).</li><li>Yasaka, T., Tiong, S. Y., Hughes, D. I., Riddell, J. S., Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Populations+of+inhibitory+and+excitatory+interneurons+in+lamina+II+of+the+adult+rat+spinal+dorsal+horn+revealed+by+a+combined+electrophysiological+and+anatomical+approach.">Populations of inhibitory and excitatory interneurons in lamina II of the adult rat spinal dorsal horn revealed by a combined electrophysiological and anatomical approach.</a> Pain. 151 (2), 475-488 (2010).</li><li>Yin, H., Park, S. A., Han, S. K., Park, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+5-hydroxytryptamine+on+substantia+gelatinosa+neurons+of+the+trigeminal+subnucleus+caudalis+in+immature+mice.">Effects of 5-hydroxytryptamine on substantia gelatinosa neurons of the trigeminal subnucleus caudalis in immature mice.</a> Brain Research. 1368, 91-101 (2011).</li><li>Hu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lidocaine+Inhibits+HCN+Currents+in+Rat+Spinal+Substantia+Gelatinosa+Neurons.">Lidocaine Inhibits HCN Currents in Rat Spinal Substantia Gelatinosa Neurons.</a> Anesthesia and Analgesia. 122 (4), 1048-1059 (2016).</li><li>Peng, H. Z., Ma, L. X., Lv, M. H., Hu, T., Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minocycline+enhances+inhibitory+transmission+to+substantia+gelatinosa+neurons+of+the+rat+spinal+dorsal+horn.">Minocycline enhances inhibitory transmission to substantia gelatinosa neurons of the rat spinal dorsal horn.</a> Neuroscience. 319, 183-193 (2016).</li><li>Peng, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+presynaptic+HCN+channels+to+excitatory+inputs+of+spinal+substantia+gelatinosa+neurons.">Contribution of presynaptic HCN channels to excitatory inputs of spinal substantia gelatinosa neurons.</a> Neuroscience. 358, 146-157 (2017).</li><li>Liu, N., Zhang, D., Zhu, M., Luo, S., Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minocycline+inhibits+hyperpolarization-activated+currents+in+rat+substantia+gelatinosa+neurons.">Minocycline inhibits hyperpolarization-activated currents in rat substantia gelatinosa neurons.</a> Neuropharmacology. 95, 110-120 (2015).</li><li>Brown, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+whole-cell+recording+from+visually+preselected+neurons+of+perirhinal+cortex+in+brain+slices+from+young+and+aging+rats.">Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats.</a> Journal of Neuroscience Methods. 86 (1), 35-54 (1998).</li><li>Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurotoxicity+of+excitatory+amino+acids+is+produced+by+passive+chloride+influx.">The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx.</a> The Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).</li><li>Rice, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+ascorbate+in+the+preparation+and+maintenance+of+brain+slices.">Use of ascorbate in the preparation and maintenance of brain slices.</a> Methods. 18 (2), 144-149 (1999).</li><li>Takasu, K., Ogawa, K., Minami, K., Shinohara, S., Kato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injury-specific+functional+alteration+of+N-type+voltage-gated+calcium+channels+in+synaptic+transmission+of+primary+afferent+C-fibers+in+the+rat+spinal+superficial+dorsal+horn.">Injury-specific functional alteration of N-type voltage-gated calcium channels in synaptic transmission of primary afferent C-fibers in the rat spinal superficial dorsal horn.</a> European Journal of Pharmacology. 772, 11-21 (2016).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitatory+synaptic+transmission+in+the+spinal+substantia+gelatinosa+is+under+an+inhibitory+tone+of+endogenous+adenosine.">Excitatory synaptic transmission in the spinal substantia gelatinosa is under an inhibitory tone of endogenous adenosine.</a> Neuroscience Letters. 477 (1), 28-32 (2010).</li><li>Funai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+dexmedetomidine+augments+inhibitory+synaptic+transmission+in+the+superficial+dorsal+horn+through+activation+of+descending+noradrenergic+control:+an+in+vivo+patch-clamp+analysis+of+analgesic+mechanisms.">Systemic dexmedetomidine augments inhibitory synaptic transmission in the superficial dorsal horn through activation of descending noradrenergic control: an in vivo patch-clamp analysis of analgesic mechanisms.</a> Pain. 155 (3), 617-628 (2014).</li><li>Yamasaki, H., Funai, Y., Funao, T., Mori, T., Nishikawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+tramadol+on+substantia+gelatinosa+neurons+in+the+rat+spinal+cord:+an+in+vivo+patch-clamp+analysis.">Effects of tramadol on substantia gelatinosa neurons in the rat spinal cord: an in vivo patch-clamp analysis.</a> PLoS One. 10 (5), e0125147 (2015).</li><li>Furue, H., Narikawa, K., Kumamoto, E., Yoshimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responsiveness+of+rat+substantia+gelatinosa+neurones+to+mechanical+but+not+thermal+stimuli+revealed+by+in+vivo+patch-clamp+recording.">Responsiveness of rat substantia gelatinosa neurones to mechanical but not thermal stimuli revealed by in vivo patch-clamp recording.</a> The Journal of Physiology. 521 (Pt 2), 529-535 (1999).</li><li>Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+brain+slice+methods+for+adult+and+aging+animals:+application+of+targeted+patch+clamp+analysis+and+optogenetics.">Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics.</a> Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).</li><li>Ting, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Acute+Brain+Slices+Using+an+Optimized+N-Methyl-D-glucamine+Protective+Recovery+Method.">Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e53825 (2018).</li><li>Li, J., Baccei, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+Tissue+Damage+Promotes+Spike+Timing-Dependent+Synaptic+Long-Term+Potentiation+in+Adult+Spinal+Projection+Neurons.">Neonatal Tissue Damage Promotes Spike Timing-Dependent Synaptic Long-Term Potentiation in Adult Spinal Projection Neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (19), 5405-5416 (2016).</li><li>Ford, N. C., Ren, D., Baccei, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NALCN+channels+enhance+the+intrinsic+excitability+of+spinal+projection+neurons.">NALCN channels enhance the intrinsic excitability of spinal projection neurons.</a> Pain. , (2018).</li><li>Cui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+synaptic+transmission+from+primary+afferents+to+spinal+substantia+gelatinosa+neurons+by+group+III+mGluRs+in+GAD65-EGFP+transgenic+mice.">Modulation of synaptic transmission from primary afferents to spinal substantia gelatinosa neurons by group III mGluRs in GAD65-EGFP transgenic mice.</a> Journal of Neurophysiology. 105 (3), 1102-1111 (2011).</li><li>Yang, K., Ma, R., Wang, Q., Jiang, P., Li, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optoactivation+of+parvalbumin+neurons+in+the+spinal+dorsal+horn+evokes+GABA+release+that+is+regulated+by+presynaptic+GABAB+receptors.">Optoactivation of parvalbumin neurons in the spinal dorsal horn evokes GABA release that is regulated by presynaptic GABAB receptors.</a> Neuroscience Letters. , 55-59 (2015).</li></ol>

Questo protocollo dettagli i passaggi per la preparazione di fettine di midollo spinale, che abbiamo utilizzato con successo durante gli esperimenti di cellule intere patch-clamp su SG neuroni18,19,20,21. Mediante l'implementazione di questo metodo, abbiamo recentemente riportato che la minociclina, una seconda generazione di tetraciclina, marcatamente potrebbe migliorare la trasmissione sinapt...

La sostanza gelatinosa (SG, della lamina II del corno dorsale spinale) è un centro di relè indiscutibilmente importante per la trasmissione e regolazione informazioni sensoriali. Si compone di interneuroni inibitori ed eccitatori, che ricevono gli input dalle fibre afferenti primarie, interneuroni locali e il sistema inibitorio discendente1endogeno. Negli ultimi decenni, lo sviluppo di preparazione fetta acuta del midollo spinale e l'avvento della registrazione della intero-cellula patch-clamp hanno permesso diversi studi sulle proprietà elettrofisiologiche e morfologiche intrinseche di SG neuroni2, 3 , 4 così come gli studi dei circuiti locali in SG5,6. Inoltre, utilizzando la preparazione di fetta del midollo spinale in vitro , i ricercatori in grado di interpretare i cambiamenti in un neurone excitabilities7,8, la funzione dello ione canali9,10, e attività sinaptica11,12 in varie condizioni patologiche. Questi studi hanno approfondito la nostra comprensione del ruolo che i neuroni SG svolgono nello sviluppo e mantenimento del dolore cronico e prurito neuropatico.
Essenzialmente, il presupposto fondamentale per ottenere una chiara visualizzazione di soma neuronale e ideale della intero-cellula patch usando le fette acute del midollo spinale è garantire l'eccellente qualità delle fette così sani e patchable neuroni possono essere ottenuti. Tuttavia, preparando fettine di midollo spinale prevede diversi passaggi, ad esempio eseguendo un laminectomy ventrale e rimuovere la membrana di pia-aracnoide, che può essere ostacoli nell'ottenere fette sani. Sebbene non sia facile da preparare fettine di midollo spinale, esecuzione di registrazioni in vitro su fettine di midollo spinale ha diversi vantaggi. Rispetto alle preparazioni di cultura di cellule, fettine di midollo spinale possono conservare parzialmente inerente connessioni sinaptiche che sono in una condizione fisiologicamente rilevante. Inoltre, cellule intere patch-clamp registrazione con fettine di midollo spinale potrebbe essere combinata con altre tecniche, quali patch doppio morsetto13,14, studi morfologici15,16 e unicellulare RT-PCR 17. Pertanto, questa tecnica fornisce ulteriori informazioni su che caratterizzano le diversità anatomiche e genetiche in una regione specifica e consente di indagine della composizione dei circuiti locali.
Qui, forniamo una descrizione di base e di dettagliata del nostro metodo per preparare fette acute del midollo spinale e l'acquisizione di registrazioni di cellule intere patch-clamp da neuroni di SG.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF and PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60130</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF, and K+-based intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71500</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF and PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5080</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5280</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7631</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7903</td>
			<td>Used for the preparation of sucrose-ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-gluconate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>169-11835</td>
			<td>Used for the preparation of K+-based intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2-Phosphocreatine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1937</td>
			<td>Used for the preparation of intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td>Used for the preparation of intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td>Used for the preparation of intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187</td>
			<td>Used for the preparation of intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Li-GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5884</td>
			<td>Used for the preparation of intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsMeSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1426</td>
			<td>Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3011</td>
			<td>Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEA-Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2265</td>
			<td>Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobiotin 488</td>
			<td>Vector</td>
			<td>SP-1145</td>
			<td>0.05% neurobiotin 488 could be used for morphological studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7002</td>
			<td>3% agar block was used in our protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>4% paraformaldehyde was used for immunohistochemical processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Hengxing Chemical Reagents</td>
			<td></td>
			<td>Used for the preparation of PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mount Coverslipping Medium</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>18606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urethan</td>
			<td>National Institute for Food and Drug Control</td>
			<td>30191228</td>
			<td>1.5 g/kg, i.p.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW150F-4</td>
			<td>1.5 mm OD, 1.12 mm ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Used for the preparation of micropipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table</td>
			<td>Technical Manufacturing Corporation</td>
			<td>63544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared CCD camera</td>
			<td>Dage-MIT</td>
			<td>IR-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch-clamp amplifier</td>
			<td>HEKA</td>
			<td>EPC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MP-285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Y stage</td>
			<td>Burleigh</td>
			<td>GIBRALTAR X-Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer</td>
			<td>Advanced</td>
			<td>FISKE 210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>FE20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocol microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 700</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of acute spinal cord slices for whole-cell patch-clamp recording in substantia gelatinosa neurons

Studi recenti di cellule intere patch-clamp da neuroni di sostanza gelatinosa (SG) hanno fornito un grande corpo di informazioni circa i meccanismi spinali trasmissione sensoriale, regolamento nocicettivo e sviluppo cronico dolore o prurito. Implementazioni di registrazioni elettrofisiologiche insieme a studi morfologici basati sull'utilità delle fette acute del midollo spinale hanno ulteriormente migliorato la nostra comprensione delle proprietà di un neurone e la composizione dei circuiti locali in SG. Qui, presentiamo una guida dettagliata e pratica per la preparazione di fettine di midollo spinale e visualizza rappresentativo della intero-cellula registrazione e risultati morfologici. Questo protocollo permette ideale conservazione neuronale e può imitare le condizioni in vivo in una certa misura. In sintesi, la capacità di ottenere una preparazione in vitro di fettine di midollo spinale permette stabile a corrente e tensione morsetto registrazioni e così potrebbe facilitare le indagini dettagliate nelle proprietà intrinseche della membrana, circuiti locali e struttura di un neurone utilizzando diversi approcci sperimentali.

Fette di acuta del midollo spinale sono stati preparati secondo lo schema indicato nella Figura 1. Dopo affettamento e il recupero, una fetta di midollo spinale è stata trasferita alla camera di registrazione. I neuroni sani sono stati identificati sulla base di aspetto soma usando la microscopia IR-DIC. Successivamente, i potenziali di azione dei neuroni SG sono stati tratti da una serie di depolarizzanti impulsi di corrente (1 s durata) quando i neuroni so...

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Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Preparazione delle fette Acute del midollo spinale per la registrazione di cellule intere Patch-clamp in neuroni di sostanza Gelatinosa

Qui, descriviamo i passi essenziali per le registrazioni di cellule intere patch-clamp fatta da neuroni di sostanza gelatinosa (SG) nella fetta di midollo spinale in vitro . Questo metodo consente la proprietà intrinseca della membrana, la trasmissione sinaptica e la caratterizzazione morfologica dei neuroni di SG per essere studiato.

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

Questo metodo può aiutare a chiarire i meccanismi spinali alla base della trasmissione sensoriale, della regolazione nocicettiva e dello sviluppo cronico del dolore o del dolore Il principale vantaggio di questa tecnica è che può consentire la conservazione neuronale ideale e può imitare le condizioni in vivo in una certa misura. Iniziare tirando elettrodi di registrazione da microcapillari di vetro borosilicato utilizzando un estrattore capillare. Quindi, riempire uno stampo con agar fuso per preparare un blocco di agar di 1,2 centimetri per 1,5 centimetri per 2,0 centimetri.Tagliare il blocco per avere un canale centrale se si pianificano sezioni trasversali. O una carne di canale con il bordo del blocco per le sezioni parasagittali. Prima della profusione trascardica e dell'estrazione del midollo spinale, preparare 500 millilitri di ACSF a base di saccarosio.Raffreddare la soluzione per raffreddare il ghiaccio ed equilibrare con il 95%O2 e il 5%CO2. Raffreddare tutti gli strumenti di dissezione sul ghiaccio. Fai un'incisione longitudinale di cinque centimetri sulla pelle posteriore dal caudale al rostrale.Quindi, tagliare la gabbia toracica tra la colonna vertebrale e le costole su entrambi i lati. Usa le forbici per fare un taglio all'estremità caudale della colonna vertebrale. Quindi tagliare i tessuti circostanti e isolare rapidamente il segmento lumbosacrale della colonna vertebrale.Trasferire il segmento lumbosacrale in un piatto di vetro contenente saccarosio freddo ghiacciato a base di ACSF. Con il lato ventrale verso l'alto, utilizzare forbici fini per tagliare bilateralmente il pedicolo vertebrale ed esporre attentamente il midollo spinale. Isolare una sezione del midollo spinale lunga due centimetri con l'ingrandimento lumbosacrale e trasferire la sezione spinale in un altro piatto di vetro riempito con saccarosio freddo ACSF.Lavorare al microscopio a dissezione per rimuovere le meningi e la membrana pia aracnoide. Tagliare tutte le radici ventrali e dorsali il più rapidamente possibile. Fare attenzione ad evitare il lesionee al midollo spinale, in particolare il corno dorsale quando si rimuovono le meningi e le radici spinali.Posizionare il midollo spinale sul blocco di agar tagliato in precedenza. Per preparare fette trasversali, attaccare il lato ventrale del midollo spinale all'agar con il lato dorsale verso la lama. Per preparare fette parasagittali, attaccare il lato ventrale con supercolla all'agar in direzione verticale.Quindi, montare il blocco di agar su una piattaforma di un vibratomo con supercolla. E preparare fette trasversali o parasagittali da 300 a 500 micron con una velocità avanzata di 0,025 millimetri al secondo e una frequenza di vibrazione di 80 Hertz. Il midollo spinale deve essere tagliato dorso-ventrally.Per ottenere i migliori risultati, la fetta deve essere preparata entro 15-20 minuti. Lo spessore della fetta spinale non deve essere superiore a 600 micron per soddisfare la visibilità cellulare. Utilizzare una pipetta rifilata in plastica per trasferire le fette su rete di nylon in una camera di stoccaggio contenente ACSF ossigenato continuamente a 32 gradi Celsius.Per condurre registrazioni di patch patch a cellule intere da neuroni substantia gelatinosa o SG, utilizzare soluzioni intracellulari a base di ioni di potassio per la registrazione durante l'applicazione di soluzione a base di cesio solo per la registrazione di correnti post-sinaptiche inibitorie. Spostare delicatamente la fetta del midollo spinale nella camera di registrazione. E poi stabilizzarlo saldamente con un filo di platino a forma di U con fili di nylon per una stabilità ottimale delle fette.Abbondantemente la fetta con ACSF bolleto a temperatura ambiente e impostare la velocità di profusione a due o quattro millilitri al minuto per ottenere una sufficiente ossigenazione. Quindi, usando una lente al microscopio a bassa risoluzione, identificare la regione dei neuroni SG come una banda traslucida. Scegli un neurone sano, caratterizzato da una forma tridimensionale con una membrana luminosa e liscia come cellula bersaglio utilizzando l'obiettivo ad alta risoluzione e regolalo al centro dello schermo del monitor video.Riempire una micro pipetta con un volume appropriato di soluzione intracellulare a base di ioni di potassio o di cesio. Quindi inserire la micro-pipetta nel supporto dell'elettrodo e assicurarsi che la soluzione intracellulare contatti il filo d'argento all'interno del supporto. Mettere a fuoco la micro pipetta e utilizzare il micromanipolatore per immergerla nell'ACSF.Applicare una leggera pressione positiva per forzare lo sporco e i detriti. Spostare gradualmente la micro pipetta verso il neurone mirato. Una volta che la pipetta si avvicina al neurone e si forma una fossetta molto piccola sulla membrana neuronale, rilasciare la pressione positiva per formare un gigaseale.Alterare il potenziale di detenzione a meno 70 millivolt, che è vicino al fisiologico potenziale di membrana a riposo di una cellula. Quindi, applicare un'aspirazione transitoria e delicata alla micro pipetta per rompono la membrana e creare una buona configurazione a celle intere. Registra le proprietà di cottura testando il modello di attivazione di ogni neurone nel morsetto di corrente con una serie di un secondo di impulsi di corrente depolarizzante da 25 a 150 picoamp con incrementi di 25 picoamp al potenziale della membrana a riposo.Per registrare le correnti subreshold somatiche, mantenere il potenziale della membrana a meno 50 millivolt in modalità morsetto di tensione, quindi applicare una serie di impulsi di tensione iperpolarizzanti di una seconda durata da meno 60 millivolt a meno 120 millivolt con un decremento di 10 millivolt. Registrare le correnti post-sinaptiche eccitatorie con la soluzione intracellulare a base di ioni di potassio in modalità morsetto di tensione ad un potenziale di tenuta di meno 70 millivolt. Registrare IPSC utilizzando una soluzione intracellulare basata sugli ioni di cesio per la registrazione di IPSC.Dopo aver tenuto il potenziale della membrana a meno 70 millivolt per circa cinque minuti, cambiare gradualmente il potenziale di tenuta a zero millivolt. Attendere alcuni minuti per la stabilizzazione, quindi iniziare a registrare gli eventi IPSC. I modelli di cottura determinati iniettando una serie di impulsi di corrente depolarizzanti di un secondo in un neurone SG a potenziale di membrana a riposo possono essere classificati come tonico-firing, ritardato-firing, gap-firing, initial-burst, phasic-bursting, single-spike e reluctant-firing.Questa immagine mostra il protocollo evocante per le correnti di sottosoglie nel morsetto di tensione. Queste tracce rappresentative mostrano la risposta all'iniezione di corrente iperpolarizzante classificata come IH, IA e IT. Questa è una traccia rappresentativa di SEPSC registrata dai neuroni SG a meno 70 millivolt in assenza e presenza di 50 micromolari APV e 20 micromolare CNQX. Questa traccia mostra i SEPC registrati prima dell'aggiunta di APV e CNQX su una scala cronologica espansa.Seguendo questa procedura sono i metodi come le registrazioni di patch clamp accoppiate o l'optogenetica può essere eseguita per rispondere a domande aggiuntive come caratterizzare specifici microcircuiti neuronali in substantia gelatinosa.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

Elettrofisiologici e morfologica Caratterizzazione neuronali Microcircuiti in Acute Fette cervello Utilizzando accoppiati di patch-clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Ricerca

Neuroscienze

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Registrazioni Whole-cell patch-clamp nel cervello fette

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

La preparazione di Oblique Spinal Cord Fette per ventrale Root Stimolazione

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Registrazioni patch-clamp intere cellule per la determinazione elettrofisiologica della selettività ionica in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Applicazione di morsetto di patch automatico guidato per immagini per lo studio dei neuroni in fettine di cervello

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

Risposta uditiva del tronco cerebrale ed esterna della cellula ciliata cellule intere Patch Clamp registrazione in ratti postnatali

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparazioni e protocolli per l'intera cella Patch Clamp registrazione dei neuroni Tectal Xenopus laevis

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology

Valutazione di molteplicità sinaptica utilizzando cellule intere Patch-clamp Elettrofisiologia

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic ...

Preparation of Acute Slices from Dorsal Hippocampus for Whole-Cell Recording and Neuronal Reconstruction in the Dentate Gyrus of Adult Mice

Preparazione di fette acute dall'ippocampo dorsale per la registrazione a cellule intere e la ricostruzione neuronale nel giro dentato di topi adulti

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in ...

Hypothalamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings

Neuroni ipotalamici di kisspeptina come bersaglio per le registrazioni di patch-clamp a cellule intere

Kisspeptins are essential for the maturation of the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis and fertility. Hypothalamic kisspeptin neurons located in ...