Name: preparation of acute spinal cord slices for whole-cell patch-clamp recording in substantia gelatinosa neurons
Uploaded: 2019-01-18T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons at JoVE.com

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모든 실험 프로토콜 설명 동물 윤리 위원회의 남 창 대학 (난창, 홍보 중국, 윤리적인 No.2017-010)에 의해 승인 되었다. 모든 노력이 스트레스와 실험 동물의 고통을 최소화 하기 위해 만들어졌다. 여기 수행 electrophysiological 녹음 실 온 (RT, 22-25 ° C)에서 실행 되었다.
1입니다. 동물
<ol><li>어느 섹스의 Sprague-Dawley 쥐 (3-5 주 이전)을 사용 합니다. 12 h 빛 어두운 주기에서 동물을 집 고...

<ol>
	<li>Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+circuitry+for+pain+processing+in+the+dorsal+horn.">Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).</li><li>Yoshimura, M., Nishi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blind+patch-clamp+recordings+from+substantia+gelatinosa+neurons+in+adult+rat+spinal+cord+slices:+pharmacological+properties+of+synaptic+currents.">Blind patch-clamp recordings from substantia gelatinosa neurons in adult rat spinal cord slices: pharmacological properties of synaptic currents.</a> Neuroscience. 53 (2), 519-526 (1993).</li><li>Maxwell, D. J., Belle, M. D., Cheunsuang, O., Stewart, A., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+of+inhibitory+and+excitatory+interneurons+in+superficial+laminae+of+the+rat+dorsal+horn.">Morphology of inhibitory and excitatory interneurons in superficial laminae of the rat dorsal horn.</a> The Journal of Physiology. 584 (Pt. 2, 521-533 (2007).</li><li>Grudt, T. J., Perl, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlations+between+neuronal+morphology+and+electrophysiological+features+in+the+rodent+superficial+dorsal+horn.">Correlations between neuronal morphology and electrophysiological features in the rodent superficial dorsal horn.</a> The Journal of Physiology. 540 (Pt 1), 189-207 (2002).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+feed-forward+spinal+cord+glycinergic+neural+circuit+gates+mechanical+allodynia.">A feed-forward spinal cord glycinergic neural circuit gates mechanical allodynia.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (9), 4050-4062 (2013).</li><li>Zheng, J., Lu, Y., Perl, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+neurones+of+the+spinal+substantia+gelatinosa+mediate+interaction+of+signals+from+primary+afferents.">Inhibitory neurones of the spinal substantia gelatinosa mediate interaction of signals from primary afferents.</a> The Journal of Physiology. 588 (Pt 12), 2065-2075 (2010).</li><li>Balasubramanyan, S., Stemkowski, P. L., Stebbing, M. J., Smith, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sciatic+chronic+constriction+injury+produces+cell-type-specific+changes+in+the+electrophysiological+properties+of+rat+substantia+gelatinosa+neurons.">Sciatic chronic constriction injury produces cell-type-specific changes in the electrophysiological properties of rat substantia gelatinosa neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 96 (2), 579-590 (2006).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+signal-regulated+kinase+(ERK)+activation+is+required+for+itch+sensation+in+the+spinal+cord.">Extracellular signal-regulated kinase (ERK) activation is required for itch sensation in the spinal cord.</a> Molecular Brain. 7, 25 (2014).</li><li>Kopach, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+alters+trafficking+of+extrasynaptic+AMPA+receptors+in+tonically+firing+lamina+II+neurons+of+the+rat+spinal+dorsal+horn.">Inflammation alters trafficking of extrasynaptic AMPA receptors in tonically firing lamina II neurons of the rat spinal dorsal horn.</a> Pain. 152 (4), 912-923 (2011).</li><li>Takasu, K., Ono, H., Tanabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+cation+channels+at+primary+afferent+terminals+contribute+to+chronic+pain.">Spinal hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channels at primary afferent terminals contribute to chronic pain.</a> Pain. 151 (1), 87-96 (2010).</li><li>Iura, A., Takahashi, A., Hakata, S., Mashimo, T., Fujino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reductions+in+tonic+GABAergic+current+in+substantia+gelatinosa+neurons+and+GABAA+receptor+delta+subunit+expression+after+chronic+constriction+injury+of+the+sciatic+nerve+in+mice.">Reductions in tonic GABAergic current in substantia gelatinosa neurons and GABAA receptor delta subunit expression after chronic constriction injury of the sciatic nerve in mice.</a> European Journal of Pain. 20 (10), 1678-1688 (2016).</li><li>Alles, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve+injury+increases+contribution+of+L-type+calcium+channels+to+synaptic+transmission+in+spinal+lamina+II:+Role+of+alpha2delta-1+subunits.">Peripheral nerve injury increases contribution of L-type calcium channels to synaptic transmission in spinal lamina II: Role of alpha2delta-1 subunits.</a> Molecular Pain. 14, 1-12 (2018).</li><li>Santos, S. F., Rebelo, S., Derkach, V. A., Safronov, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitatory+interneurons+dominate+sensory+processing+in+the+spinal+substantia+gelatinosa+of+rat.">Excitatory interneurons dominate sensory processing in the spinal substantia gelatinosa of rat.</a> The Journal of Physiology. 581 (Pt 1), 241-254 (2007).</li><li>Lu, Y., Perl, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+organization+of+excitatory+circuits+between+neurons+of+the+spinal+superficial+dorsal+horn+(laminae+I+and+II).">Modular organization of excitatory circuits between neurons of the spinal superficial dorsal horn (laminae I and II).</a> The Journal of Neuroscience. 25 (15), 3900-3907 (2005).</li><li>Hantman, A. W., van den Pol, A. N., Perl, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+physiological+features+of+a+set+of+spinal+substantia+gelatinosa+neurons+defined+by+green+fluorescent+protein+expression.">Morphological and physiological features of a set of spinal substantia gelatinosa neurons defined by green fluorescent protein expression.</a> The Journal of Neuroscience. 24 (4), 836-842 (2004).</li><li>Yasaka, T., Tiong, S. Y., Hughes, D. I., Riddell, J. S., Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Populations+of+inhibitory+and+excitatory+interneurons+in+lamina+II+of+the+adult+rat+spinal+dorsal+horn+revealed+by+a+combined+electrophysiological+and+anatomical+approach.">Populations of inhibitory and excitatory interneurons in lamina II of the adult rat spinal dorsal horn revealed by a combined electrophysiological and anatomical approach.</a> Pain. 151 (2), 475-488 (2010).</li><li>Yin, H., Park, S. A., Han, S. K., Park, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+5-hydroxytryptamine+on+substantia+gelatinosa+neurons+of+the+trigeminal+subnucleus+caudalis+in+immature+mice.">Effects of 5-hydroxytryptamine on substantia gelatinosa neurons of the trigeminal subnucleus caudalis in immature mice.</a> Brain Research. 1368, 91-101 (2011).</li><li>Hu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lidocaine+Inhibits+HCN+Currents+in+Rat+Spinal+Substantia+Gelatinosa+Neurons.">Lidocaine Inhibits HCN Currents in Rat Spinal Substantia Gelatinosa Neurons.</a> Anesthesia and Analgesia. 122 (4), 1048-1059 (2016).</li><li>Peng, H. Z., Ma, L. X., Lv, M. H., Hu, T., Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minocycline+enhances+inhibitory+transmission+to+substantia+gelatinosa+neurons+of+the+rat+spinal+dorsal+horn.">Minocycline enhances inhibitory transmission to substantia gelatinosa neurons of the rat spinal dorsal horn.</a> Neuroscience. 319, 183-193 (2016).</li><li>Peng, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+presynaptic+HCN+channels+to+excitatory+inputs+of+spinal+substantia+gelatinosa+neurons.">Contribution of presynaptic HCN channels to excitatory inputs of spinal substantia gelatinosa neurons.</a> Neuroscience. 358, 146-157 (2017).</li><li>Liu, N., Zhang, D., Zhu, M., Luo, S., Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minocycline+inhibits+hyperpolarization-activated+currents+in+rat+substantia+gelatinosa+neurons.">Minocycline inhibits hyperpolarization-activated currents in rat substantia gelatinosa neurons.</a> Neuropharmacology. 95, 110-120 (2015).</li><li>Brown, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+whole-cell+recording+from+visually+preselected+neurons+of+perirhinal+cortex+in+brain+slices+from+young+and+aging+rats.">Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats.</a> Journal of Neuroscience Methods. 86 (1), 35-54 (1998).</li><li>Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurotoxicity+of+excitatory+amino+acids+is+produced+by+passive+chloride+influx.">The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx.</a> The Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).</li><li>Rice, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+ascorbate+in+the+preparation+and+maintenance+of+brain+slices.">Use of ascorbate in the preparation and maintenance of brain slices.</a> Methods. 18 (2), 144-149 (1999).</li><li>Takasu, K., Ogawa, K., Minami, K., Shinohara, S., Kato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injury-specific+functional+alteration+of+N-type+voltage-gated+calcium+channels+in+synaptic+transmission+of+primary+afferent+C-fibers+in+the+rat+spinal+superficial+dorsal+horn.">Injury-specific functional alteration of N-type voltage-gated calcium channels in synaptic transmission of primary afferent C-fibers in the rat spinal superficial dorsal horn.</a> European Journal of Pharmacology. 772, 11-21 (2016).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitatory+synaptic+transmission+in+the+spinal+substantia+gelatinosa+is+under+an+inhibitory+tone+of+endogenous+adenosine.">Excitatory synaptic transmission in the spinal substantia gelatinosa is under an inhibitory tone of endogenous adenosine.</a> Neuroscience Letters. 477 (1), 28-32 (2010).</li><li>Funai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+dexmedetomidine+augments+inhibitory+synaptic+transmission+in+the+superficial+dorsal+horn+through+activation+of+descending+noradrenergic+control:+an+in+vivo+patch-clamp+analysis+of+analgesic+mechanisms.">Systemic dexmedetomidine augments inhibitory synaptic transmission in the superficial dorsal horn through activation of descending noradrenergic control: an in vivo patch-clamp analysis of analgesic mechanisms.</a> Pain. 155 (3), 617-628 (2014).</li><li>Yamasaki, H., Funai, Y., Funao, T., Mori, T., Nishikawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+tramadol+on+substantia+gelatinosa+neurons+in+the+rat+spinal+cord:+an+in+vivo+patch-clamp+analysis.">Effects of tramadol on substantia gelatinosa neurons in the rat spinal cord: an in vivo patch-clamp analysis.</a> PLoS One. 10 (5), e0125147 (2015).</li><li>Furue, H., Narikawa, K., Kumamoto, E., Yoshimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responsiveness+of+rat+substantia+gelatinosa+neurones+to+mechanical+but+not+thermal+stimuli+revealed+by+in+vivo+patch-clamp+recording.">Responsiveness of rat substantia gelatinosa neurones to mechanical but not thermal stimuli revealed by in vivo patch-clamp recording.</a> The Journal of Physiology. 521 (Pt 2), 529-535 (1999).</li><li>Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+brain+slice+methods+for+adult+and+aging+animals:+application+of+targeted+patch+clamp+analysis+and+optogenetics.">Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics.</a> Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).</li><li>Ting, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Acute+Brain+Slices+Using+an+Optimized+N-Methyl-D-glucamine+Protective+Recovery+Method.">Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e53825 (2018).</li><li>Li, J., Baccei, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+Tissue+Damage+Promotes+Spike+Timing-Dependent+Synaptic+Long-Term+Potentiation+in+Adult+Spinal+Projection+Neurons.">Neonatal Tissue Damage Promotes Spike Timing-Dependent Synaptic Long-Term Potentiation in Adult Spinal Projection Neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (19), 5405-5416 (2016).</li><li>Ford, N. C., Ren, D., Baccei, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NALCN+channels+enhance+the+intrinsic+excitability+of+spinal+projection+neurons.">NALCN channels enhance the intrinsic excitability of spinal projection neurons.</a> Pain. , (2018).</li><li>Cui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+synaptic+transmission+from+primary+afferents+to+spinal+substantia+gelatinosa+neurons+by+group+III+mGluRs+in+GAD65-EGFP+transgenic+mice.">Modulation of synaptic transmission from primary afferents to spinal substantia gelatinosa neurons by group III mGluRs in GAD65-EGFP transgenic mice.</a> Journal of Neurophysiology. 105 (3), 1102-1111 (2011).</li><li>Yang, K., Ma, R., Wang, Q., Jiang, P., Li, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optoactivation+of+parvalbumin+neurons+in+the+spinal+dorsal+horn+evokes+GABA+release+that+is+regulated+by+presynaptic+GABAB+receptors.">Optoactivation of parvalbumin neurons in the spinal dorsal horn evokes GABA release that is regulated by presynaptic GABAB receptors.</a> Neuroscience Letters. , 55-59 (2015).</li></ol>

이 프로토콜 세부 SG 뉴런18,19,,2021에 전체 셀 패치 클램프 실험을 수행할 때 우리가 성공적으로 사용한 척수 조각 준비 단계. 이 메서드를 구현 하 여 우리는 최근 그 minocycline 보고 차세대 항생물질, 현저 하 게 SG 뉴런19에 연 접 메커니즘을 통해 억제 시 냅 스 전송 향상 시킬 수 있는....

Substantia gelatinosa (SG, lamina 척추 등 경적의 II) 전송 하 고 규제 하는 감각 정보에 대 한 논의 여지가 없 중요 한 릴레이 센터 이다. 그것은 기본 구심 섬유, 지역 수 및 생 내림차순 억제 시스템1에서 입력을 받아 흥분 성의 억제 수 구성 됩니다. 최근 수십 년간, 급성 척수 조각 준비의 개발 및 전체 셀 패치 클램프 기록의 출현 설정한 SG 뉴런2, 의 본질적인 electrophysiological 및 형태학 속성에 대 한 다양 한 연구 3 , 4 뿐만 아니라 SG5,6에 로컬 회로의 연구. 또한, 생체 외에서 척수 조각 준비를 사용 하 여 연구원 신경 excitabilities7,8에 변화를 해석할 수 있는, 이온의 기능9,10, 채널 및 시 냅 스 활동11,12 다양 한 병 적인 조건 하에서. 이러한 연구 개발에 재생 SG 신경 역할에 대 한 우리의 이해 및 만성 통증과 neuropathic 가려움증의 유지 보수 깊 어 있다.
기본적으로, 이상적인 전체 셀 패치 급성 척수 조각을 사용 하 여 신경 소마의 명확한 시각화를 달성 하기 위해 핵심 필수 건강 하 고 패치되지 뉴런 얻어질 수 있다 조각의 우수한 품질을 보장 하기 위해입니다. 그러나, 척수 조각 준비 복 부 laminectomy 수행 하 고 건강 한 조각을 얻기에 장애물이 될 수 피아-거미 집 모양의 막 제거 등의 여러 단계가 포함 됩니다. 그것은 척수 조각 준비 하기 쉬운, 척수 조각에 녹음에서 시험관에서 수행는 여러 가지 장점이 있습니다. 셀 문화 준비에 비해, 척수 조각 순수 관련 조건에는 고유한 시 냅 스 연결을 부분적으로 보존할 수 있습니다. 또한, 전체 셀 패치 클램프 척수 조각을 사용 하 여 녹음 더블 패치 클램프13,14, 형태학 연구15,16 단일 셀 RT-PCR 등의 다른 방법을 결합 될 수 있는 17. 따라서,이 특정 지역 내에서 해 부와 유전 다양성을 특성화에 더 많은 정보를 제공 합니다 기술과 지역 회로의 구성의 조사에 대 한 수 있습니다.
여기, 우리는 급성 척수 조각을 준비 하 고 전체 셀 패치 클램프 기록 SG 뉴런에서 인수에 대 한 우리의 방법의 기본과 상세한 설명을 제공 합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF and PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60130</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF, and K+-based intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71500</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF and PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5080</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5280</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7631</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7903</td>
			<td>Used for the preparation of sucrose-ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-gluconate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>169-11835</td>
			<td>Used for the preparation of K+-based intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2-Phosphocreatine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1937</td>
			<td>Used for the preparation of intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td>Used for the preparation of intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td>Used for the preparation of intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187</td>
			<td>Used for the preparation of intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Li-GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5884</td>
			<td>Used for the preparation of intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsMeSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1426</td>
			<td>Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3011</td>
			<td>Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEA-Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2265</td>
			<td>Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobiotin 488</td>
			<td>Vector</td>
			<td>SP-1145</td>
			<td>0.05% neurobiotin 488 could be used for morphological studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7002</td>
			<td>3% agar block was used in our protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>4% paraformaldehyde was used for immunohistochemical processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Hengxing Chemical Reagents</td>
			<td></td>
			<td>Used for the preparation of PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mount Coverslipping Medium</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>18606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urethan</td>
			<td>National Institute for Food and Drug Control</td>
			<td>30191228</td>
			<td>1.5 g/kg, i.p.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW150F-4</td>
			<td>1.5 mm OD, 1.12 mm ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Used for the preparation of micropipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table</td>
			<td>Technical Manufacturing Corporation</td>
			<td>63544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared CCD camera</td>
			<td>Dage-MIT</td>
			<td>IR-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch-clamp amplifier</td>
			<td>HEKA</td>
			<td>EPC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MP-285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Y stage</td>
			<td>Burleigh</td>
			<td>GIBRALTAR X-Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer</td>
			<td>Advanced</td>
			<td>FISKE 210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>FE20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocol microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 700</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of acute spinal cord slices for whole-cell patch-clamp recording in substantia gelatinosa neurons

신경 세포 substantia gelatinosa (SG)에서 최근 전체 셀 패치 클램프 연구는 큰 신체의 감각 전송, nociceptive 규정과 만성 통증이 나 가려움 개발 기본 척추 메커니즘에 대 한 정보를 제공 합니다. 신경 속성에 대 한 우리의 이해 및 sg에서 지역 회로의 구성에 추가 형태학 연구 급성 척수 조각의 유틸리티에 따라 함께 electrophysiological 녹음의 구현 향상 되었습니다. 여기, 우리는 척수 조각 및 쇼 대표 전체 세포 기록 및 형태학 결과의 준비에 대 한 상세 하 고 실용적인 가이드를 제시. 이 프로토콜 이상적인 신경 보존을 허용 하 고 어느 정도 조건 vivo에서 모방 수 있습니다. 요약 하자면, 척수 조각의 생체 외에서 준비 얻을 수 안정 된 전류와 전압 클램프 녹음을 가능 하 게 수 따라서 용이 하 내장 막 속성, 로컬 회로에 대 한 자세한 조사와 다양 한 실험 방법을 사용 하 여 신경 구조입니다.

급성 척수 조각 그림 1에 표시 된 다이어그램에 따라 준비 되었다. 조각화 및 복구, 후 척수 조각 녹음 실로 옮겨 졌다. 건강 한 신경 소마 모양 IR DIC 현미경을 사용 하 여에 따라 확인 되었다. 다음, SG 뉴런의 활동 전위 전류 펄스 (1 s 기간) depolarizing의 시리즈에 의해 elicited 했다 신경 RMP에서 열렸다. 보이는 것 처럼 그림 2설명 되...

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Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

급성 척수 조각 Substantia Gelatinosa 신경에 있는 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 준비

여기, 우리가 시험관에서 척수 조각에서 신경 세포 substantia gelatinosa (SG)에서 만든 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 필수 단계 설명 합니다. 이 메서드는 기본 막 속성, 시 냅 스 전송 및 공부 SG 뉴런의 형태학 상 특성을 수 있습니다.

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

이 방법은 감각 전염, 출혈 조절 및 만성 통증 또는 통증 발달의 기본 척추 메커니즘을 명확히하는 데 도움이 될 수 있으며,이 기술의 주요 장점은 이상적인 신경 보존을 허용 할 수 있으며 생체 내 조건을 어느 정도 모방 할 수 있다는 것입니다. 모세관 풀러를 사용하여 보로실리케이트 유리 미세 모세 혈관에서 기록 전극을 당겨 서 시작합니다. 그런 다음 몰드를 용융 한천으로 채우고 1.2 센티미터에서 1.5 센티미터를 2.0 센티미터 의 천막 블록으로 준비하십시오.가로 섹션을 계획하는 경우 블록을 중앙 채널을 갖도록 트림합니다. 또는 기생 절개블록의 가장자리가 있는 채널 살. 경질 증혈 및 척수 추출에 앞서 500밀리리터의 자당 기반 ACSF를 준비하십시오.얼음 추위에 대한 용액을 식히고 95%O2 및 5%CO2로 균형을 이룬다. 얼음에 있는 모든 해부 도구를 식힙니다. 코달에서 장밋빛까지 뒤쪽 피부에 세로 5센티미터 절개를 합니다.그런 다음 양쪽의 척추와 갈비뼈 사이의 갈비뼈를 잘라냅니다. 가위를 사용하여 척추의 caudal 끝에서 절단하십시오. 그런 다음 주변 조직을 잘라 내고 척추의 요추 를 신속하게 분리합니다.요추를 얼음 차가운 자당 기반 ACSF가 함유된 유리 접시에 옮춥시다. 복부 쪽을 위쪽으로, 양면으로 척추 페디클을 잘라 조심스럽게 척수를 노출하기 위하여 미세한 가위를 사용하십시오. 척수의 2센티미터 길이 부분을 요추 확대로 분리하고 척추 부위를 차가운 자당 ACSF로 채워진 다른 유리 접시로 옮깁니다.수막과 피아 거미막을 제거하기 위해 해부 현미경으로 작동합니다. 모든 복부와 등대 뿌리를 가능한 한 빨리 잘라냅니다. 수막과 척추 뿌리를 제거할 때 척수, 특히 등경에 부상을 피하십시오.이전에 손질된 한천 블록에 척수를 놓습니다. 횡방향 슬라이스를 준비하려면 척수의 복부 면을 등쪽이 칼날을 향해 한천에 부착합니다. 기생 조각을 준비하려면 복부 면을 수퍼 접착제로 천지에 수직 방향으로 부착합니다.그런 다음, 초접착제와 진동의 플랫폼에 천 블록을 마운트. 또한 300~500마이크로론 횡단 또는 기생슬라이스를 초당 0.025밀리미터의 고급 속도와 80 헤르츠의 진동 주파수로 준비한다. 척수는 등구를 심창적으로 슬라이스해야합니다.최상의 결과를 얻으려면 슬라이스를 15~20분 이내에 준비해야 합니다. 척추 슬라이스의 두께는 세포 가시성을 만족시키기 위해 600 미크론을 초과해서는 안됩니다. 플라스틱 트리밍 파이펫을 사용하여 32도에서 지속적으로 산소를 공급받는 저장 챔버에서 나일론 메쉬로 슬라이스를 전달합니다.실질적인 젤라틴사 또는 SG 뉴런으로부터 전세포 패치 클램프 레코딩을 수행하려면, 시냅스 후 전류의 레코딩을 위해서만 카이슘 양이온 기반 용액을 적용하는 동안 기록용 세포내 용액을 기반으로 칼륨 이온을 사용하십시오. 척수 슬라이스를 녹음실로 부드럽게 이동합니다. 그런 다음 최적의 슬라이스 안정성을 위해 나일론 실이있는 U 자형 플래티넘 와이어로 단단히 안정화하십시오.꾸준히 실온에서 거품 ACSF와 슬라이스를 profuse하고 충분한 산소를 달성하기 위해 분당 2 ~ 4 밀리리터로 풍부 속도를 설정합니다. 그런 다음 저해상도 현미경 렌즈를 사용하여 반투명 밴드로서 SG 뉴런 영역을 식별합니다. 고해상도 목표를 사용하여 표적 세포로서 밝고 매끄러운 멤브레인이 있는 3차원 형상을 특징으로 하는 건강한 뉴런을 선택하고 비디오 모니터 화면의 중심으로 조정한다.마이크로 파이펫을 적절한 양의 칼륨 이온을 기반으로 하거나 세포내 용액을 기반으로 하는 카이슘 이온을 채웁니다. 그런 다음 마이크로 파이펫을 전극 홀더에 삽입하고 세포 내 용액이 홀더 내부의 실버 와이어에 접촉하고 있는지 확인합니다. 마이크로 파이펫을 초점으로 가져와 마이크로 조작기를 사용하여 ACSF에 담가 둡니다.가벼운 양압을 적용하여 먼지와 이물질을 강제로 제거합니다. 점차적으로 표적 뉴런쪽으로 마이크로 파이펫을 이동합니다. 파이펫이 뉴런과 뉴런 멤브레인에 매우 작은 보조개 형태에 도달하면 양압을 방출하여 기가실을 형성합니다.세포의 생리적 휴식 막 잠재력에 가까운 마이너스 70 밀리볼트에 보유 잠재력을 변경합니다. 그런 다음 마이크로 파이펫에 일시적이고 부드러운 흡입을 적용하여 멤브레인을 파열시키고 좋은 전체 세포 구성을 만듭니다. 현 클램프에서 각 뉴런의 발사 패턴을 테스트하여 25~150개의 피코앰프를 25~150개의 피코암과 함께 현 클램프의 각 뉴런의 발사 패턴을 테스트하여 25개의 피코암증증을 증분하여 현막 전위전위에서 발사 특성을 기록한다.체세포 하위 임계값 전류를 기록하려면 전압 클램프 모드에서 멤브레인 전위를 마이너스 50 밀리볼트로 유지한 다음 1초 지속 시간의 초극광 전압 펄스를 마이너스 60 밀리볼트에서 10밀리볼트 감소로 마이너스 120밀리볼트로 적용합니다. 마이너스 70 밀리볼트의 보유 잠재력에서 전압 클램프 모드에서 세포내 용액을 기반으로 칼륨 이온을 기반으로 하는 흥분 후 전류를 기록합니다. IPSC의 기록을 위한 세포내 용액을 기반으로 한 세슘 이온을 사용하여 IPSC를 기록하십시오.약 5 분 동안 마이너스 70 밀리볼트에서 멤브레인 잠재력을 유지 한 후 점차적으로 유지 잠재력을 0 밀리볼트로 변경합니다. 안정화를 위해 몇 분 간 기다린 다음 IPSC 이벤트를 기록하기 시작합니다. 휴식 막 잠재력에서 SG 뉴런에 1초 의 탈극화 전류 펄스를 연이어 주입하여 결정된 발사 패턴은 강장제 발사, 지연 발사, 갭 발사, 초기 버스트, 단계파열, 단일 스파이크 및 마지 못해발사로 분류될 수 있다.이 이미지는 전압 클램프의 하위 임계값 전류에 대한 호출 프로토콜을 보여 주어 있습니다. 이러한 대표적인 추적은 IH, IA 및 IT로 분류된 과극화 전류 주입에 대한 반응을 보여줍니다. 이것은 50 마이크로 몰러 APV및 20 마이크로 몰러 CNQX의 부재 와 존재에 마이너스 70 밀리볼트에서 SG 뉴런에서 기록 된 SEPSC의 대표적인 흔적이다. 이 추적은 확장된 기간에 APV 및 CNQX를 추가하기 전에 기록된 SEPC를 보여줍니다.이 절차에 따라 페어링 된 패치 클램프 기록 또는 광유전학과 같은 방법은 실질적인 젤라틴에 특정 뉴런 미세 회로를 특성화하는 것과 같은 추가 질문에 대답하기 위해 수행 될 수있다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

급성 뇌 조각에서 신경 세포의 미세 회로의 전기 생리 및 형태 학적 특성은 페어 패치 클램프 녹음을 사용하여

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

연구

신경과학

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

뇌 조각에서 전체 셀 패치 클램프 녹음

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

복부 루트 자극에 대한 사선 척수 조각의 준비

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Channelrhodopsins에서 이온 선택성의 전기 생리 학적 결정을위한 전체 셀 패치 - 클램프 기록

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

뇌 조각에서 뉴런 연구를위한 자동 이미지 유도 패치 클램프의 적용

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

청각 Brainstem 응답 및 출생 후 쥐에 외부 머리 세포 전체 셀 패치 클램프 기록

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

준비 및 Xenopus laevis Tectal 신경의 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 프로토콜

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology

전기 생리학 전체 셀 패치 클램프를 사용 하 여 시 냅 스 다양성의 평가

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic ...

Preparation of Acute Slices from Dorsal Hippocampus for Whole-Cell Recording and Neuronal Reconstruction in the Dentate Gyrus of Adult Mice

성인 마우스의 덴테이트 자이루스에서 전신 기록 및 신경 재건을위한 등산 해마에서 급성 슬라이스의 준비

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in ...

Hypothalamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings

시상하부 키스펩틴 뉴런은 전체 세포 패치 클램프 기록의 표적입니다.

Kisspeptins are essential for the maturation of the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis and fertility. Hypothalamic kisspeptin neurons located in ...