Name: preparation of acute spinal cord slices for whole-cell patch-clamp recording in substantia gelatinosa neurons
Uploaded: 2019-01-18T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons at JoVE.com

Bu eser hibe Ulusal Doğal Bilim Vakfı, Çin'den (No 81560198, 31660289) tarafından desteklenmiştir.

Açıklanan tüm deneysel protokoller hayvan Etik Komitesi, Nanchang üniversite tarafından (Nanchang, PR Çin, etik No.2017-010) kabul edildi. Tüm çabaları stres ve deneysel hayvan ağrı en aza indirmek için yapılmıştır. Burada yapılan elektrofizyolojik kayıtlar oda sıcaklığında (RT, 22-25 ° C) gerçekleştirilmiştir.
1. hayvanlar
<ol><li>Her iki cinsiyetten Sprague-Dawley rat (3-5 hafta eski) kullanın. 12 h koyu döngüsü altında hayvanlar ev ve onlara ad libitum</...

<ol>
	<li>Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+circuitry+for+pain+processing+in+the+dorsal+horn.">Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).</li><li>Yoshimura, M., Nishi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blind+patch-clamp+recordings+from+substantia+gelatinosa+neurons+in+adult+rat+spinal+cord+slices:+pharmacological+properties+of+synaptic+currents.">Blind patch-clamp recordings from substantia gelatinosa neurons in adult rat spinal cord slices: pharmacological properties of synaptic currents.</a> Neuroscience. 53 (2), 519-526 (1993).</li><li>Maxwell, D. J., Belle, M. D., Cheunsuang, O., Stewart, A., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+of+inhibitory+and+excitatory+interneurons+in+superficial+laminae+of+the+rat+dorsal+horn.">Morphology of inhibitory and excitatory interneurons in superficial laminae of the rat dorsal horn.</a> The Journal of Physiology. 584 (Pt. 2, 521-533 (2007).</li><li>Grudt, T. J., Perl, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlations+between+neuronal+morphology+and+electrophysiological+features+in+the+rodent+superficial+dorsal+horn.">Correlations between neuronal morphology and electrophysiological features in the rodent superficial dorsal horn.</a> The Journal of Physiology. 540 (Pt 1), 189-207 (2002).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+feed-forward+spinal+cord+glycinergic+neural+circuit+gates+mechanical+allodynia.">A feed-forward spinal cord glycinergic neural circuit gates mechanical allodynia.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (9), 4050-4062 (2013).</li><li>Zheng, J., Lu, Y., Perl, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+neurones+of+the+spinal+substantia+gelatinosa+mediate+interaction+of+signals+from+primary+afferents.">Inhibitory neurones of the spinal substantia gelatinosa mediate interaction of signals from primary afferents.</a> The Journal of Physiology. 588 (Pt 12), 2065-2075 (2010).</li><li>Balasubramanyan, S., Stemkowski, P. L., Stebbing, M. J., Smith, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sciatic+chronic+constriction+injury+produces+cell-type-specific+changes+in+the+electrophysiological+properties+of+rat+substantia+gelatinosa+neurons.">Sciatic chronic constriction injury produces cell-type-specific changes in the electrophysiological properties of rat substantia gelatinosa neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 96 (2), 579-590 (2006).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+signal-regulated+kinase+(ERK)+activation+is+required+for+itch+sensation+in+the+spinal+cord.">Extracellular signal-regulated kinase (ERK) activation is required for itch sensation in the spinal cord.</a> Molecular Brain. 7, 25 (2014).</li><li>Kopach, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+alters+trafficking+of+extrasynaptic+AMPA+receptors+in+tonically+firing+lamina+II+neurons+of+the+rat+spinal+dorsal+horn.">Inflammation alters trafficking of extrasynaptic AMPA receptors in tonically firing lamina II neurons of the rat spinal dorsal horn.</a> Pain. 152 (4), 912-923 (2011).</li><li>Takasu, K., Ono, H., Tanabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+cation+channels+at+primary+afferent+terminals+contribute+to+chronic+pain.">Spinal hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channels at primary afferent terminals contribute to chronic pain.</a> Pain. 151 (1), 87-96 (2010).</li><li>Iura, A., Takahashi, A., Hakata, S., Mashimo, T., Fujino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reductions+in+tonic+GABAergic+current+in+substantia+gelatinosa+neurons+and+GABAA+receptor+delta+subunit+expression+after+chronic+constriction+injury+of+the+sciatic+nerve+in+mice.">Reductions in tonic GABAergic current in substantia gelatinosa neurons and GABAA receptor delta subunit expression after chronic constriction injury of the sciatic nerve in mice.</a> European Journal of Pain. 20 (10), 1678-1688 (2016).</li><li>Alles, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve+injury+increases+contribution+of+L-type+calcium+channels+to+synaptic+transmission+in+spinal+lamina+II:+Role+of+alpha2delta-1+subunits.">Peripheral nerve injury increases contribution of L-type calcium channels to synaptic transmission in spinal lamina II: Role of alpha2delta-1 subunits.</a> Molecular Pain. 14, 1-12 (2018).</li><li>Santos, S. F., Rebelo, S., Derkach, V. A., Safronov, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitatory+interneurons+dominate+sensory+processing+in+the+spinal+substantia+gelatinosa+of+rat.">Excitatory interneurons dominate sensory processing in the spinal substantia gelatinosa of rat.</a> The Journal of Physiology. 581 (Pt 1), 241-254 (2007).</li><li>Lu, Y., Perl, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+organization+of+excitatory+circuits+between+neurons+of+the+spinal+superficial+dorsal+horn+(laminae+I+and+II).">Modular organization of excitatory circuits between neurons of the spinal superficial dorsal horn (laminae I and II).</a> The Journal of Neuroscience. 25 (15), 3900-3907 (2005).</li><li>Hantman, A. W., van den Pol, A. N., Perl, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+physiological+features+of+a+set+of+spinal+substantia+gelatinosa+neurons+defined+by+green+fluorescent+protein+expression.">Morphological and physiological features of a set of spinal substantia gelatinosa neurons defined by green fluorescent protein expression.</a> The Journal of Neuroscience. 24 (4), 836-842 (2004).</li><li>Yasaka, T., Tiong, S. Y., Hughes, D. I., Riddell, J. S., Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Populations+of+inhibitory+and+excitatory+interneurons+in+lamina+II+of+the+adult+rat+spinal+dorsal+horn+revealed+by+a+combined+electrophysiological+and+anatomical+approach.">Populations of inhibitory and excitatory interneurons in lamina II of the adult rat spinal dorsal horn revealed by a combined electrophysiological and anatomical approach.</a> Pain. 151 (2), 475-488 (2010).</li><li>Yin, H., Park, S. A., Han, S. K., Park, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+5-hydroxytryptamine+on+substantia+gelatinosa+neurons+of+the+trigeminal+subnucleus+caudalis+in+immature+mice.">Effects of 5-hydroxytryptamine on substantia gelatinosa neurons of the trigeminal subnucleus caudalis in immature mice.</a> Brain Research. 1368, 91-101 (2011).</li><li>Hu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lidocaine+Inhibits+HCN+Currents+in+Rat+Spinal+Substantia+Gelatinosa+Neurons.">Lidocaine Inhibits HCN Currents in Rat Spinal Substantia Gelatinosa Neurons.</a> Anesthesia and Analgesia. 122 (4), 1048-1059 (2016).</li><li>Peng, H. Z., Ma, L. X., Lv, M. H., Hu, T., Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minocycline+enhances+inhibitory+transmission+to+substantia+gelatinosa+neurons+of+the+rat+spinal+dorsal+horn.">Minocycline enhances inhibitory transmission to substantia gelatinosa neurons of the rat spinal dorsal horn.</a> Neuroscience. 319, 183-193 (2016).</li><li>Peng, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+presynaptic+HCN+channels+to+excitatory+inputs+of+spinal+substantia+gelatinosa+neurons.">Contribution of presynaptic HCN channels to excitatory inputs of spinal substantia gelatinosa neurons.</a> Neuroscience. 358, 146-157 (2017).</li><li>Liu, N., Zhang, D., Zhu, M., Luo, S., Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minocycline+inhibits+hyperpolarization-activated+currents+in+rat+substantia+gelatinosa+neurons.">Minocycline inhibits hyperpolarization-activated currents in rat substantia gelatinosa neurons.</a> Neuropharmacology. 95, 110-120 (2015).</li><li>Brown, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+whole-cell+recording+from+visually+preselected+neurons+of+perirhinal+cortex+in+brain+slices+from+young+and+aging+rats.">Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats.</a> Journal of Neuroscience Methods. 86 (1), 35-54 (1998).</li><li>Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurotoxicity+of+excitatory+amino+acids+is+produced+by+passive+chloride+influx.">The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx.</a> The Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).</li><li>Rice, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+ascorbate+in+the+preparation+and+maintenance+of+brain+slices.">Use of ascorbate in the preparation and maintenance of brain slices.</a> Methods. 18 (2), 144-149 (1999).</li><li>Takasu, K., Ogawa, K., Minami, K., Shinohara, S., Kato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injury-specific+functional+alteration+of+N-type+voltage-gated+calcium+channels+in+synaptic+transmission+of+primary+afferent+C-fibers+in+the+rat+spinal+superficial+dorsal+horn.">Injury-specific functional alteration of N-type voltage-gated calcium channels in synaptic transmission of primary afferent C-fibers in the rat spinal superficial dorsal horn.</a> European Journal of Pharmacology. 772, 11-21 (2016).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitatory+synaptic+transmission+in+the+spinal+substantia+gelatinosa+is+under+an+inhibitory+tone+of+endogenous+adenosine.">Excitatory synaptic transmission in the spinal substantia gelatinosa is under an inhibitory tone of endogenous adenosine.</a> Neuroscience Letters. 477 (1), 28-32 (2010).</li><li>Funai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+dexmedetomidine+augments+inhibitory+synaptic+transmission+in+the+superficial+dorsal+horn+through+activation+of+descending+noradrenergic+control:+an+in+vivo+patch-clamp+analysis+of+analgesic+mechanisms.">Systemic dexmedetomidine augments inhibitory synaptic transmission in the superficial dorsal horn through activation of descending noradrenergic control: an in vivo patch-clamp analysis of analgesic mechanisms.</a> Pain. 155 (3), 617-628 (2014).</li><li>Yamasaki, H., Funai, Y., Funao, T., Mori, T., Nishikawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+tramadol+on+substantia+gelatinosa+neurons+in+the+rat+spinal+cord:+an+in+vivo+patch-clamp+analysis.">Effects of tramadol on substantia gelatinosa neurons in the rat spinal cord: an in vivo patch-clamp analysis.</a> PLoS One. 10 (5), e0125147 (2015).</li><li>Furue, H., Narikawa, K., Kumamoto, E., Yoshimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responsiveness+of+rat+substantia+gelatinosa+neurones+to+mechanical+but+not+thermal+stimuli+revealed+by+in+vivo+patch-clamp+recording.">Responsiveness of rat substantia gelatinosa neurones to mechanical but not thermal stimuli revealed by in vivo patch-clamp recording.</a> The Journal of Physiology. 521 (Pt 2), 529-535 (1999).</li><li>Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+brain+slice+methods+for+adult+and+aging+animals:+application+of+targeted+patch+clamp+analysis+and+optogenetics.">Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics.</a> Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).</li><li>Ting, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Acute+Brain+Slices+Using+an+Optimized+N-Methyl-D-glucamine+Protective+Recovery+Method.">Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e53825 (2018).</li><li>Li, J., Baccei, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+Tissue+Damage+Promotes+Spike+Timing-Dependent+Synaptic+Long-Term+Potentiation+in+Adult+Spinal+Projection+Neurons.">Neonatal Tissue Damage Promotes Spike Timing-Dependent Synaptic Long-Term Potentiation in Adult Spinal Projection Neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (19), 5405-5416 (2016).</li><li>Ford, N. C., Ren, D., Baccei, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NALCN+channels+enhance+the+intrinsic+excitability+of+spinal+projection+neurons.">NALCN channels enhance the intrinsic excitability of spinal projection neurons.</a> Pain. , (2018).</li><li>Cui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+synaptic+transmission+from+primary+afferents+to+spinal+substantia+gelatinosa+neurons+by+group+III+mGluRs+in+GAD65-EGFP+transgenic+mice.">Modulation of synaptic transmission from primary afferents to spinal substantia gelatinosa neurons by group III mGluRs in GAD65-EGFP transgenic mice.</a> Journal of Neurophysiology. 105 (3), 1102-1111 (2011).</li><li>Yang, K., Ma, R., Wang, Q., Jiang, P., Li, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optoactivation+of+parvalbumin+neurons+in+the+spinal+dorsal+horn+evokes+GABA+release+that+is+regulated+by+presynaptic+GABAB+receptors.">Optoactivation of parvalbumin neurons in the spinal dorsal horn evokes GABA release that is regulated by presynaptic GABAB receptors.</a> Neuroscience Letters. , 55-59 (2015).</li></ol>

Bu protokolü ayrıntıları Biz başarıyla bütün hücreli yama-kelepçe deneyler SG nöronlar18,19,20,21tarihinde gerçekleştirirken kullanılan spinal kord dilimleri hazırlanması için adımları. Bu yöntemi uygulayarak, biz son zamanlarda o minosiklin rapor tetrasiklin, ikinci nesil belirgin geliştirmek inhibitör sinaptik iletimi SG nöronlar19presynaptic bir...

Gözlemliyorum gelatinosa (SG, lamina II. spinal dorsal boynuz), verici ve duyusal bilgileri düzenleyen bir tartışmasız önemli geçiş merkezidir. Birincil afferent lifler, yerel interneurons ve endojen azalan inhibitör sistem1girdileri almak eksitatör ve inhibitör interneurons oluşur. Akut omurilik dilim hazırlık gelişimi ve bütün hücreli yama-kelepçe kayıt gelişiyle SG nöronlar2, iç elektrofizyolojik ve morfolojik özellikleri çeşitli çalışmalar son yıllarda etkin 3 , 4 gibi çalışmalar yerel devresi SG5,6. Ayrıca, vitro omurilik dilim hazırlık kullanarak, araştırmacılar nöronal excitabilities7,8değişiklikleri yorumlamak,9,10, iyon fonksiyonu kanalları ve sinaptik aktiviteleri11,12 çeşitli patolojik şartlar altında. Bu çalışmalar kronik ağrı ve nöropatik kaşıntı bakım ve SG nöronlar gelişiminde oynadığı rol bizim anlayış derinleştirdi.
Esasen, nöronal soma ve ideal bütün hücreli akut spinal kord dilimleri kullanarak yama açık bir görselleştirme elde etmek için anahtar sağlıklı ve tamsayı nöronlar elde edilebilir bu yüzden dilimleri mükemmel kalitesini garanti etmek için ön koşuldur. Ancak, spinal kord dilimleri hazırlanıyor ventral laminektomi gerçekleştirme ve sağlıklı dilimleri elde engeller olabilir pia-araknoid membran kaldırma gibi birkaç adımdan oluşur. Spinal kord dilimleri hazırlamak kolay olmasa da, kayıtları vitro omurilik dilimleri gerçekleştirme birçok avantajı vardır. Hücre kültür hazırlıkları için karşılaştırıldığında, spinal kord dilimleri kısmen bir fizyolojik ilgili durumdadır doğasında sinaptik bağlantıları koruyabilirsiniz. Buna ek olarak, tüm hücreli yama-kelepçe kayıt omurilik dilimleri kullanarak Çift Kişilik yama kelepçe13,14, morfolojik araştırmalar15,16 ve tek hücreli RT-PCR gibi diğer teknikleri ile kombine 17. bu nedenle, bu teknik belirli bir bölge içindeki anatomik ve genetik farklılıkların karakterize üzerinde daha fazla bilgi sağlar ve yerel devresi bileşimi incelenmesi için izin verir.
Burada, akut spinal kord dilimleri hazırlama ve bütün hücreli yama-kelepçe kayıtları SG nöronlar edinme için bizim Yöntem, temel ve ayrıntılı açıklamasını sağlamak.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF and PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60130</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF, and K+-based intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71500</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF and PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5080</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5280</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7631</td>
			<td>Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7903</td>
			<td>Used for the preparation of sucrose-ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-gluconate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>169-11835</td>
			<td>Used for the preparation of K+-based intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2-Phosphocreatine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1937</td>
			<td>Used for the preparation of intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td>Used for the preparation of intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td>Used for the preparation of intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187</td>
			<td>Used for the preparation of intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Li-GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5884</td>
			<td>Used for the preparation of intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsMeSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1426</td>
			<td>Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CsCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3011</td>
			<td>Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEA-Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2265</td>
			<td>Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobiotin 488</td>
			<td>Vector</td>
			<td>SP-1145</td>
			<td>0.05% neurobiotin 488 could be used for morphological studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7002</td>
			<td>3% agar block was used in our protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>4% paraformaldehyde was used for immunohistochemical processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Hengxing Chemical Reagents</td>
			<td></td>
			<td>Used for the preparation of PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mount Coverslipping Medium</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>18606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urethan</td>
			<td>National Institute for Food and Drug Control</td>
			<td>30191228</td>
			<td>1.5 g/kg, i.p.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW150F-4</td>
			<td>1.5 mm OD, 1.12 mm ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Used for the preparation of micropipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table</td>
			<td>Technical Manufacturing Corporation</td>
			<td>63544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared CCD camera</td>
			<td>Dage-MIT</td>
			<td>IR-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch-clamp amplifier</td>
			<td>HEKA</td>
			<td>EPC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MP-285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Y stage</td>
			<td>Burleigh</td>
			<td>GIBRALTAR X-Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer</td>
			<td>Advanced</td>
			<td>FISKE 210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>FE20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocol microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 700</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of acute spinal cord slices for whole-cell patch-clamp recording in substantia gelatinosa neurons

Bütün hücreli yama-kelepçe çalışmalar gözlemliyorum gelatinosa (SG) nöronlar gelen duyusal iletim, nosiseptif yönetmelik ve kronik ağrı ve kaşıntı geliştirme temel spinal mekanizmaları hakkında bilgi büyük gövdeli hazırladık. Uygulamaları ile birlikte akut spinal kord dilimleri yardımcı programında temel morfolojik araştırmalar elektrofizyolojik kayıtlar daha da nöronal özellikleri anlayışımızı ve SG yerel devre bileşimi iyileştirilmiştir. Burada, spinal kord dilimleri ve gösteri temsilcisi bütün hücreli kayıt ve morfolojik sonuçları hazırlanması için detaylı ve pratik bir rehber mevcut. Bu iletişim kuralı ideal nöronal koruma izni ve in vivo koşullar belli bir ölçüde taklit edebilirsiniz. Özetle, spinal kord dilimleri vitro hazırlanması elde etmek için yeteneği sağlar istikrarlı akım ve gerilim kelepçe kayıtları ve böylece içsel membran özellikleri, yerel devresi detaylı soruşturma kolaylaştırabilir ve nöronal yapısı çeşitli deneysel yaklaşımlar kullanarak.

Akut omurilik dilimleri Şekil 1' de gösterilen diyagramı göre hazırlanmıştır. Dilimleme ve kurtarma sonra spinal kord dilim kayıt odasına transfer edildi. Sağlıklı nöronlar IR-DIC mikroskobu kullanılarak soma görünüşüne göre tespit edilmiştir. SG nöronlar Aksiyon potansiyelleri geçerli bakliyat (1 s süresi) depolarize bir dizi tarafından daha sonra elde edildi nöronlar RMP otelde yapıldı. Şekil 2, a?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons at JoVE.com

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Akut omurilik dilimleri hazırlanması gözlemliyorum Gelatinosa nöronlar bütün hücreli yama-kelepçe kayıt için

Burada, vitro omurilik dilim nöronlarda gözlemliyorum gelatinosa (SG) yapılan bütün hücreli yama-kelepçe kayıtları için gerekli adımları açıklar. Bu yöntem, içsel membran özelliklerini, sinaptik iletimi ve morfolojik belirlenmesi için SG nöronlar karakterizasyonu sağlar.

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

Bu yöntem, duyusal iletim, nosiseptif regülasyon ve kronik ağrı veya ağrı gelişimi altında yatan spinal mekanizmaları nnetilmesine yardımcı olabilir Bu tekniğin ana avantajı ideal nöronal korunmasına izin verebilir ve belirli bir ölçüde in-vivo koşulları taklit edebilirsiniz. Bir kılcal puller kullanarak borosilikat cam mikrokapiller kayıt elektrotları çekerek başlayın. Daha sonra, 2,0 santimetre agar blok tarafından 1,5 santimetre 1,2 santimetre hazırlamak için erimiş agar ile bir kalıp doldurun.Enine bölümler planlıyorsanız, bloğu merkezi bir kanala sahip olacak şekilde kırpın. Ya da parasagittal kesitler için bloğun kenarı ile bir kanal eti. Transkardiyal profüzyon ve omurilik ekstraksiyonundan önce 500 mililitre sakaroz bazlı ACSF hazırlayın.Çözeltiyi buz soğuğuna soğutun ve %95 O2 ve %5 CO2 ile dengeleyin. Buz üzerindeki tüm diseksiyon araçlarını soğutun. Kaudal'dan rostral'a kadar arka deride beş santimetrelik uzunlamasına bir kesi yapın.Sonra, her iki tarafta omurga ve kaburga arasında göğüs kafesi ile kesti. Omurganın kaudal ucunda bir kesim yapmak için makas kullanın. Sonra çevreleyen dokuları kesip hızlı bir şekilde omurganın lumbosacral segmenti izole.Lumbosakral segmenti buz gibi sakaroz bazlı ACSF içeren cam bir tabağa aktarın. Ventral tarafı yukarı doğru ile, vertebral pedikül ile iki taraflı kesmek ve dikkatle omurilik maruz ince makas kullanın. Lumbosakral genişleme ile omuriliğin iki santimetre uzunluğundaki bölümünü izole edin ve omurilik bölümünü soğuk sakaroz ACSF ile dolu başka bir cam tabağa aktarın.Menenjler ve pia araknoid membran kaldırmak için bir diseksiyon mikroskop altında çalışın. Mümkün olduğunca çabuk uzak tüm ventral ve dorsal kökleri kesin. Menenjler ve omurilik kökleri çıkarırken omurilik, özellikle dorsal boynuz yaralanmasını önlemek için özen gösterin.Daha önce kesilmiş agar blok üzerinde omurilik yerleştirin. Enine dilimler hazırlamak için, omuriliğin ventral tarafını sırt tarafı ile agar'a saplayın. Parasagittal dilimler hazırlamak için, ventral tarafı süper yapıştırıcı ile agar'a dikey yönde takın.Sonra, superglue ile bir vibratom bir platforma agar blok monte. Ve saniyede 0,025 milimetre ve titreşim frekansı 80 Hertz gelişmiş bir hız ile 300 ila 500 mikron enine veya parasagittal dilimler hazırlayın. Omurilik dorso-ventrally dilimlenmiş olmalıdır.En iyi sonuçlar için dilim 15-20 dakika içinde hazırlanmalıdır. Omurilik kalınlığı hücre görünürlüğünü karşılamak için en fazla 600 mikron olmalıdır. Dilimleri 32 santigrat derecede sürekli oksijenli ACSF içeren bir depolama odasında naylon kafesüzerine aktarmak için plastik kesilmiş pipet kullanın.Substantia jelatinosa veya SG nöronlardan tam hücre yama kıskaç kayıtları yapmak için, sadece inhibitör post-sinaptik akımların kaydı için sezyum katyon bazlı çözelti uygularken kayıt için potasyum iyon bazlı hücre içi solüsyonlar kullanın. Omurilik dilimini yavaşça kayıt odasına taşıyın. Ve sonra optimum dilim stabilitesi için naylon iplikleri ile U şeklinde platin tel ile sıkıca stabilize.Oda sıcaklığında kabarcıklı ACSF ile sürekli bol dilim ve yeterli oksijenasyon elde etmek için dakikada 2-4 mililitre profüzyon oranı ayarlayın. Daha sonra, düşük çözünürlüklü mikroskop lens kullanarak, yarı saydam bir bant olarak SG nöronların bölge belirlemek. Yüksek çözünürlüklü hedefi kullanarak hedef hücre olarak parlak ve pürüzsüz bir membran ile üç boyutlu bir şekil ile karakterize sağlıklı bir nöron seçin ve video monitör ekranın ortasına ayarlayın.Bir mikro pipeti uygun miktarda potasyum iyon bazlı veya sezyum iyon bazlı hücre içi solüsyonile doldurun. Daha sonra mikro pipeti elektrot tutucuya takın ve hücre içi çözeltinin tutucunun içindeki gümüş telle temas ettiğinden emin olun. Mikro pipeti odak haline getirin ve mikromanipülörü kullanarak ACSF'ye daldırın.Herhangi bir kir ve enkaz uzak zorlamak için hafif bir pozitif basınç uygulayın. Yavaş yavaş hedeflenen nörona doğru mikro pipet hareket ettirin. Pipet nörona yaklaştıktan sonra nöronal membranda çok küçük bir gamze oluşur, bir gigaseal oluşturmak için pozitif basınç bırakın.Bir hücrenin fizyolojik istirahat membran potansiyeline yakın eksi 70 milivolt, tutma potansiyelini değiştirin. Daha sonra, membran yırtmak ve iyi bir bütün hücre yapılandırmaoluşturmak için mikro pipet geçici ve nazik emme uygulayın. Her bir nöronun ateşleme paternini, istirahat membran potansiyelinde 25 pikoamp artışlı 25 ila 150 pikoamptan oluşan bir dizi ikinci bir depolarize akım darbeserisiyle mevcut kıskaçta test ederek atış özelliklerini kaydedin.Somatik alt eşik akımlarını kaydetmek için membran potansiyelini voltaj kelepçesi modunda eksi 50 milivolt olarak tutun ve ardından eksi 60 milivolttan eksi 120 milivolta kadar bir saniyelik hiperpolarize voltaj darbeleri uygulayın. Eksi 70 milivolt tutma potansiyelinde voltaj kelepçesi modunda potasyum iyon bazlı hücre içi çözeltiile uyarıcı post-sinaptik akımları kaydedin. IPSC'nin sezyum iyon bazlı hücre içi solüsyonu kullanarak IPSC'leri kaydedin.Membran potansiyelini eksi 70 milivoltta yaklaşık beş dakika tuttuktan sonra, yavaş yavaş tutma potansiyelini sıfır milivolta çevirin. Sabitleme için birkaç dakika bekleyin ve ardından IPSC olaylarını kaydetmeye başlayın. Dinlenme membran potansiyelinde bir SG nörona bir dizi saniyelik depolarize akım darbeleri enjekte edilerek belirlenen ateşleme desenleri tonik ateşleme, gecikmeli-ateşleme, boşluk atışı, ilk patlama, phasik patlama, tek ani ve isteksiz-ateş olarak sınıflandırılabilir.Bu resim, voltaj kıskacındaki eşik altı akımlar için çağrıştıran protokolü gösterir. Bu temsili izler, IH, IA ve BT olarak sınıflandırılan hiperpolarize akım enjeksiyonuna verilen yanıtı göstermektedir. Bu SEPSC'nin SG nöronlarından eksi 70 milivoltluk 50 mikromolar APV ve 20 mikromolar CNQX varlığında kaydedilmiş temsilcisi bir izdir. Bu izleme, genişletilmiş bir zaman ölçeğinde APV ve CNQX eklenmesinden önce kaydedilen SEPC'leri gösterir.Bu prosedürü takiben eşleştirilmiş yama kıskaç kayıtları veya optogenetik gibi yöntemler substantia jelatinosa belirli nöronal mikrodevreler karakterize gibi ek sorulara cevap olarak yapılabilir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

Akut Beyin Dilimleri nöronal Mikro şemalar Elektrofizyolojik ve Morfolojik Karakterizasyonu Eşleştirilmiş Patch-Kelepçe Kayıtlar Kullanma

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Beyin Dilimleri tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Ventral Kök Stimulation için eğik Omurilik Dilimleri hazırlanması

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Channelrhodopsins&#39;teki İyon Seçiciliğinin Elektrofizyolojik Olarak Belirlenmesi için Tam Hücreli Yama Kelepçesi Kayıtları

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Beyin dilimlerinde nöronların çalışması için otomatik görüntü yönlendirmeli Yama Kelepçesi Uygulaması

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

İşitsel Beyin Sapı Davranım Odyometrisi ve dış saç hücre bütün hücreli yama kelepçe kayıt Doğum sonrası sıçanlarda

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Ürünleri ve tüm hücre yama kelepçe kayıt Xenopus laevis Tectal nöronlar için iletişim kuralları

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology

Sinaptik çeşitlilik bütün hücreli yama-kelepçe Elektrofizyoloji kullanarak değerlendirilmesi

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic ...

Preparation of Acute Slices from Dorsal Hippocampus for Whole-Cell Recording and Neuronal Reconstruction in the Dentate Gyrus of Adult Mice

Yetişkin Farelerin Dentat Girusunda Tüm Hücre Kaydı ve Nöronal Rekonstrüksiyon için Dorsal Hipokampustan Akut Dilimlerin Hazırlanması

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in ...

Hypothalamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings

Tüm hücre yama-kelepçe kayıtları için bir hedef olarak hipotalamik kisspeptin nöronları

Kisspeptins are essential for the maturation of the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis and fertility. Hypothalamic kisspeptin neurons located in ...