Name: combined genetic and chemical capsid modifications of adenovirus-based gene transfer vectors for shielding and targeting
Uploaded: 2018-10-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combined Genetic and Chemical Capsid Modifications of Adenovirus-Based Gene Transfer Vectors for Shielding and Targeting at JoVE.com

Remarque : dans ce qui suit, un protocole pour PEGylation geneti-chimique d’une annonce vectorielle est décrite en détail. Pour activer le couplage spécifique de la portion de PEG, un vecteur Ad5 a été préalablement génétiquement modifié en introduisant un résidu cystéine dans la protéine hexon au hypervariables boucle 5 tel que décrit dans une précédente publication36et une cheville maléimide activé composé est utilisé comme composé de couplage.
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L’efficacité par lequel les cystéines génétiquement introduits peuvent être chimiquement modifiés est typiquement 80 à 99 %, et certaines variables influent sur ce rendement. Tout d’abord, il est primordial que les cystéines génétiquement introduites ne subissent pas d’oxydation prématurée. Tout en étant bien protégé dans l’environnement réducteur des cellules producteur, il est obligatoire de fournir un environnement sans oxydation après la sortie de vecteur de particules provenant des cellules ...

Adénovirus (Ad), membres de la famille des Adenoviridae, sont des virus à ADN non enveloppés de laquelle plus de 70 types jusqu'à présent ont été identifiés (http://hadvwg.gmu.edu). Selon les propriétés hemaglutination, structure du génome et résultats du séquençage, les types de 70 après JC se divisent en sept espèces (adénovirus humain A à G)1,2. Le génome humain des Ad est taille 38 Ko et encapsulé par une nucléocapside icosaédrique3. En raison de leur abondance, la capside protéine hexon, base de penton et fibre sont tous appelés protéines de capside majeure. La capside protéine hexon plus abondante et la plus grande forme 20 facettes de la capside, composés chacun de 12 hexon homotrimers4,5. Penton, situé sur chaque bord icosaédrique (sommet), se compose de pentamères d’une base de penton et représente le point de départ pour la pointe de vertex qui est construite de glycosylée fibre trimères5,6. L’entrée de cellule Ad natif est essentiellement composée de deux grandes étapes. Tout d’abord, le bouton de la fibre se lie au récepteur primaire. Types de publicité de l’espèce A, C, E et F, c’est le récepteur coxsackie et adénovirus (voiture). Cette interaction apporte le virion dans la proximité spatiale de la surface des cellules, ce qui facilite les interactions entre les intégrines cellulaires et RGD-motif dans la base de penton et par conséquent induisant des réponses cellulaires. En second lieu, les modifications du cytosquelette conduisent à internalisation du virion et transport de l' endosome7. Après un démontage partiel de l’endosome, le virion est libéré dans le cytoplasme und se rend finalement au noyau pour la réplication.
Alors que l’Ad peut être remis localement (e.g., pour la vaccination génétique), délivrance systémique par l’intermédiaire de la circulation sanguine selon les exigences de l’onco-virothérapie fait face à plusieurs obstacles. Tout en circulant dans le sang, les virions injectées rencontrent le système de défense du système immunitaire de l’hôte, conduisant à une neutralisation rapide les vecteurs de la base de virus et rendre les vecteurs de base Ad extrêmement inefficace dans les applications systémiques. En outre, l’hépatotropisme naturelle des Ad interfère avec délivrance systémique et doit être résolue pour rediriger Ad vers ses nouvelles cellules de cible.
Codé en lignée germinale des anticorps IgM naturelles du système immunitaire inné rapidement reconnaissent et lient des structures hautement répétitives sur la surface du virion8,9. Ces complexes immuns activent ensuite les voies classiques et non classiques du système du complément, conduisant à une neutralisation rapide médiée par le complément d’une grande partie des virions8. Une deuxième voie entraînant retrait majeur des virions Ad est médiée par les macrophages10 et associée aiguë toxique et hémodynamiques effets secondaires11,12. Dans le cas de la publicité en particulier, Kupffer, cellules résidant dans la foie se lient aux et phagocytically relever les Ad virions par charognard spécifique récepteurs, ainsi leur élimination du sang13,14,15 . Les récepteurs scavenger spécifiques ont également été identifiées sur les cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques (cellules LSE)16, et LSE cellules semblent également contribuer à vecteur élimination17, mais à quelle mesure doit encore être précisée. En outre, certains types de publicité et de leurs vecteurs dérivés sont efficacement piégées par les érythrocytes humains18 auxquels ils lient par voiture ou le récepteur du complément CR119. À noter, ce mécanisme séquestrant ne peut être étudié dans le système de modèle de souris comme en contraste avec les érythrocytes humains, les érythrocytes de souris n’expriment pas de voiture.
Des anticorps spécifiques anti-Ad générés par le système immunitaire adaptatif après exposition aux Ad, soit en raison d’infections antérieures avec Ad ou après la première livraison dans les applications systémiques lever un obstacle supplémentaire à l’usage effectif des vecteurs de l’Ad, et ils devraient être éludés dans délivrance systémique efficace.
Enfin, la forte hépatotropisme de certains types de publicité (y compris Ad5) sévèrement entrave demande d’Ad en thérapie systémique. Ce tropisme résultant dans la transduction des hépatocytes est en raison de la forte affinité du virion Ad de facteur de coagulation de sang X (FX), médiée par l’interaction de FX avec les Ad hexon protéines20,21,22. FX comble le virion à héparine sulfate glycanes (HSPGs) sur la surface des hépatocytes20,23,24,25. Un facteur crucial pour cette interaction semble être l’étendue exacte des N - et O-sulfatation des HSPGs dans les cellules hépatiques24, qui se distingue de la HSPGs sur d’autres types de cellules. En plus de ce mécanisme médié par FX, des études récentes suggèrent davantage les voies non encore identifiée qui aboutissent à la transduction Ad des hépatocytes26,27,28.
Récemment, il a été démontré que FX n’est pas impliquée dans la transduction des hépatocytes de Ad, mais aussi en se liant, le virion protège la particule de virus contre la neutralisation par le système de complément26. Réduction de la transduction de l’hépatocyte en empêchant la liaison de FX, par conséquent, créerait indésirable effet secondaire d’augmenter Ad neutralisation via le système immunitaire inné.
Une connaissance approfondie des interactions complexes entre les vecteurs et les organismes hôtes est donc nécessaire de développer les vecteurs plus efficaces pour les applications systémiques qui contournent les obstacles imposés par l’organisme de l’hôte.
Une stratégie qui a été initialement utilisée pour les protéines thérapeutiques a été adaptée pour les vecteurs d’Ad pour au moins partiellement surmonté les obstacles décrits ci-dessus. Antigénicité et l’immunogénicité de protéines thérapeutiques composés pourraient être réduits en accouplant au polyéthylène glycol (PEG)29,30. Par conséquent, le couplage covalent des polymères tels que le PEG ou poly [N-(2-hydroxypropyl) methacrylamid] (pHPMA) à la capside surface protège le vecteur de l’interaction hôte-vecteur non désirés. Communément, couplage polymer cible les groupes ε-aminé de résidus de lysine secondaires qui sont distribuées au hasard sur la surface de la capside. Particules de vecteur en solution sont, en raison de la nature hydrophile des polymères ci-joint, entourés d’une coquille d’eau stable qui réduit le risque de la reconnaissance des cellules immunitaires ou une dégradation enzymatique. En outre, vecteurs de PEGylated Ad apparaissaient d’éluder la neutralisation par les anticorps anti-hexon in vitro et dans des souris préalablement vaccinés en vivo31. Contrairement à la modification génétique capside, couplage chimique des polymères est effectué après la production et de purification, qui permet non seulement pour l’utilisation de cellules producteur classiques et des stocks de vecteur de titre élevé, mais aussi pour la production simultanée modification de milliers d’acides aminés sur la surface de la capside. Cependant, axés sur l’amine blindage se produit au hasard sur toute la surface de l’ensemble capside, résultant en des hétérogénéités hautes et ne permettant pas de modification des capsomères spécifiques. En outre, les fractions de polymère grand requises pour des effets bénéfiques altérer virus bioactivité32.
Pour surmonter ces limitations, Kreppel et al. 33 a introduit un concept de geneti chimiques pour vecteur re - et dépointage. Cystéines ont été génétiquement introduits dans la capside du virus aux positions exposés au solvant comme fibre HI-boucle33, protéine IX34et hexon35,,36. Bien que pas les vecteurs de Ad naturelle, cystéine-roulement peuvent être produites à des titres élevés dans les cellules normales de producteur. Ce qui est important, insertion des cystéines dans certains capsomères et dans différents postes au sein d’un seul capsomer permet des modifications très spécifiques des portions réagissant au groupe thiol. Cette approche geneti-chimique a été démontrée à surmonter les nombreux obstacles en dessin vectoriel Ad. La combinaison de base d’amines PEGylation dépointage et couplage thiol-basée de la transferrine sur la manette de la fibre que HI-boucle a fait ses preuves avec succès reciblez modifié vecteurs d’Ad pour voiture-deficient cellules33. Puisque hexon est impliqué dans des interactions plus indésirables (anticorps neutralisants, facteur de coagulation sanguine FX), stratégies axées sur le thiol modification donnèrent aussi leur hexon. Couplage des petites portions de PEG à HVR5 de hexon empêché particules vecteur Ad pour transduce SKOV-3 cellules en présence de FX, tandis que grandes portions de PEG augmenté hépatocyte transduction14,35. Particules de vecteur ad porteuses de mutations dans le bouton de fibre inhibant la liaison de la voiture et HVR7 inhibiteur liaison des FX (et roulement inséré cystéines dans HVR1 pour position spécifique PEGylation) se sont avérés éluder et complément-médiée par les anticorps de neutralisation, ainsi que l’absorption du piégeur médiée par les récepteurs sans perte d’infectiosité. Fait intéressant, malgré un manque du bouclier naturel de FX, PEGylation amélioré encore transduction des hépatocytes en fonction de la taille de cheville36. Cependant, il a été montré que covalent blindage a d’incidence sur les processus de trafic intracellulaires. Prill et al. comparé irréversible par rapport aux boucliers bioresponsive basé sur pHPMA et démontré que ni le mode de blindage ni co-polymère frais avait une incidence sur l’entrée de la cellule mais affecte traite des particules dans le noyau. Employant un bouclier bioresponsive avec pHPMA chargés positivement copolymères autorisés pour trafic de particules dans le noyau, en conservant l’efficacité élevée de transduction Ad vecteurs in vitro et in vivo37.
En résumé, ces données indiquent que, même en supposant que toutes les interactions-hôte-vecteur ont été connues et examinées, modifications de surface capside excessive sont nécessaires pour surmonter les obstacles liés à la prestation de vecteur systémique.
Ici, nous fournissons un protocole pour effectuer des modifications chimiques in sites des capsides vecteurs adénovirus pour blindage et/ou le reciblage des particules vecteurs adénovirus et virus oncolytiques axée sur les adénovirus. Le concept de cette technologie est décrite à la Figure 1. Il permet le blindage de certaines régions de la capside des interactions indésirables par covalente des polymères synthétiques. En même temps, il fournit également un moyen d’attacher des ligands et combiner le blindage et le ciblage. À l’aide de chimie simple, les expérimentateurs pourront modifier par covalence surface de vecteurs adénovirus avec une grande variété de molécules comprenant des peptides/protéines, glucides, lipides et d’autres petites molécules. En outre, le protocole prévoit un concept général la modification chimique des vecteurs de virus dérivé biologiquement actives au titre du maintien de leur intégrité biologique et activité.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vector purification and chemical modification</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Argon gas</td>
			<td>Air liquide</td>
			<td>local gas dealer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen</td>
			<td>Air liquide</td>
			<td>local gas dealer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup Express Plus 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706-10g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL (3mL) Norm Ject (syringes)</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4020.000V0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-Ject needles for single use (yellow 0.9 x 40 mm)</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4710009040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caesium chloride 99.999% Ultra Quality</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8627.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel beads</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A4569.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxypolyethylene glycol maleimide - 750 (PEG mal-750)</td>
			<td>Iris Biotech</td>
			<td></td>
			<td>store in silica gel beads at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13.2 mL Ultra Clear Ultracentrifuge Tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td>only open in hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD-10 size exclusion chromatography column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0851-01</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1069.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS Ultrapure</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1112,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1123.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material for cell-culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-03590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P10-0231SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Good</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P06-07100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosphere Filter Tips (various sizes)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes (various sizes)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reaction tubes (various sizes)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC plates 15cm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material for silver staining protocol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>1613,2500PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0820,2500PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 37%</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0877,0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1613,2500PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium thiosulfate</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>1,418,791,210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver nitrate</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3944.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3900,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Special Lab Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>5311-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megafuge 40</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roter for Megafuge TX750 + Adapter andLlids for 500 mL tubes</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Conventional</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge e.g. Optima XPN-80</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>suitable Ultrazentrifuge Rotor e.g. SW41</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH -Meter</td>
			<td>Conventional</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stand with clamps</td>
			<td>Conventional</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goose neck lamp</td>
			<td>Conventional</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Over-head rotor</td>
			<td>Conventional</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Block</td>
			<td>Conventional</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photometer (OD 260)</td>
			<td>Conventional</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combined genetic and chemical capsid modifications of adenovirus-based gene transfer vectors for shielding and targeting

Vecteurs adénovirus sont des outils puissants pour virothérapie génétique de vaccination et oncolytiques. Cependant, ils sont sujettes à des interactions hôte-vecteur indésirables multiples, surtout après la livraison de in vivo . C’est un consensus que les limites imposées par l’interaction hôte-vecteur non désirés ne peuvent être surmontés si les modifications définies de la surface de vecteur sont effectuées. Ces modifications incluent le blindage des particules à partir des interactions non désirées et le ciblage de l’introduction de nouveaux ligands. Le protocole présenté ici vise à permettre au lecteur de générer blindé et, si vous le souhaitez, reciblé vecteurs de transfert de gène humain adénovirus ou virus oncolytiques. Le protocole permettra aux chercheurs de modifier la surface des capsides vecteurs adénovirus par un lien chimique spécifique des polymères synthétiques, glucides, lipides ou autres moitiés biologiques ou chimiques. Il décrit la technologie de pointe des modifications combinées capside génétiques et chimiques, qui auraient dû être divulgués afin de faciliter la compréhension et le franchissement des barrières pour en vivo livraison des vecteurs adénovirus. Une description détaillée et commentée des étapes cruciales pour la réalisation de réactions chimiques spécifiques avec biologiquement actives virus ou virus dérivés des vecteurs est fournie. La technologie décrite dans le protocole est basée sur l’introduction de génétique de la cystéine (naturellement absent) résidus en boucles exposés au solvant de vecteurs adénovirus-dérivé. Ces résidus de cystéine fournissent une réactivité chimique spécifique, après la production de vecteurs à des titres élevés, exploitables pour le très spécifique et efficace de couplage covalent chimique des molécules d’une grande variété de classes de substance au vecteur particules. Ce qui est important, ce protocole peut s’adapter facilement pour effectuer une large variété de modifications chimiques (non thiol dotés) différentes, des capsides vecteurs adénovirus. Enfin, il est probable que vecteurs de transfert de gène de base de virus non enveloppés, autres que les adénovirus peuvent être modifiées de la base du présent protocole.

Figure 2 montre des exemples de l’effet cytopathogène (ECP) sur les 293 cellules (HEK 293) qui indique la production réussie de vecteur. Cellules devraient montrer la morphologie (Figure 2) 40 à 48 heures après l’inoculation avec le vecteur de virus. La droite validant pour la récolte est crucial pour ne pas perdre des particules virales par lyse cellulaire et empêche l’oxydation des groupes thiol génétiquement intr...

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Combined Genetic and Chemical Capsid Modifications of Adenovirus-Based Gene Transfer Vectors for Shielding and Targeting

Le protocole décrit ici permet aux chercheurs de modifier précisément capsides adénovirus dans certains sites de chimie simple. Particules de vecteurs adénovirus blindé et vecteurs de transfert de gène reciblées peuvent être générés et interactions hôte vecteur peuvent être étudiées.

Combinée de Modifications chimiques et génétiques de la capside des vecteurs de transfert de gènes axée sur les adénovirus pour le blindage et le ciblage

Adenovirus vectors are potent tools for genetic vaccination and oncolytic virotherapy. However, they are prone to multiple undesired vector-host ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la thérapie génique, de l’oncolyse et de la vaccination génétique. Il facilite la compréhension et la modulation des interactions des hôtes vecteurs des vecteurs de transfert de gènes adénovirus, le type de vecteur le plus fréquemment utilisé dans les essais cliniques à ce jour. Le principal avantage de cette technique est que les capsulats d’adénovirus peuvent être spécifiquement modifiés d’une manière très définie à des positions sélectionnées et dans une mesure variable en utilisant une chimie simple.Les implications de cette technique s’étendent vers la thérapie parce que la modification d’hôte vectoriel ne peut pas seulement être analysée mais également modulée d’une manière orientée vers le patient. Bien que cette méthode donne un aperçu des interactions spécifiques de l’hôte vectoriel, elle peut également être utilisée pour l’étiquetage et le suivi des particules virales dans les organismes vivants, tels que les souris. En général, les personnes nouvelles à cette méthode seront aux prises avec la combinaison unique de virologie et de cchimie organique qui nécessite des connaissances pratiques des deux domaines.La démonstration spéciale de cette technique est essentielle parce qu’ici les méthodes de chimie organique rencontrent des méthodes de biologie cellulaire et de virologie, y compris des tours de manipulation spécifiques au terrain. Pour commencer cette procédure préparer tous les tampons tels que décrits dans le protocole de texte. Pesez un millilitre de chaque tampon de gradient pour vérifier sa densité.Après avoir stérilisé tous les tampons, parsèmez les tampons contenant du TCEP avec du gaz argon pendant environ 30 secondes pour empêcher l’oxydation du TCEP. Conservez les flacons contenant le moiety en poudre solide de couplage dans de plus grands tubes, chacun rempli d’un coussin de perles de gel de silice, pour empêcher l’accumulation de l’eau de condensateur en décongelant les flacons. Placez ces tubes dans un dessiccateur.Retirer l’air dans le dessiccateur et le remplacer par du gaz argon. Fermez ensuite chaque tube hermétiquement et transférez-le dans un plus grand récipient avec des perles de gel de silice. Une fois que tous les tubes ont été transférés, fermez le récipient.Conserver le contenant à 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi. Lorsqu’il est prêt à décongeler, placer le récipient dans une couche de perles de silice dans un dessiccateur. Laissez le récipient chauffer lentement à température ambiante, puis ouvrez le récipient.Lorsque les cellules atteignent l’effet cytopathique optimal, recueillez-les en raclant les plaques et en transférant le supernatant dans des tubes de centrifugeuse. Faire tourner la suspension cellulaire à 400 fois G pendant 10 minutes. Ensuite, suspendez la pastille cellulaire en quatre millilitres de tampon ad contenant 10 millimolar TCEP et transférez la solution résultante dans un tube stérile de 50 millilitres.Congeler la solution dans de l’azote liquide, puis la décongeler dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius. Répétez ce cycle de dégel de gel trois fois pour sauver le vecteur. Centrifugeuse à 5000 G et quatre degrés Celsius pendant dix minutes.Tandis que le centrifugage a placé deux tubes ultra centrifugeuses pour commencer à préparer deux gradients égaux d’étape de chlorure de césium. Ajouter trois millilitres de la phase inférieure à chacun de ces tubes. Marquer le niveau de la phase inférieure sur le tube avant de charger la phase supérieure.Puis empilez soigneusement cinq millilitres de la phase supérieure jusqu’à la phase inférieure, le pipetting très lentement le long des murs du tube. Lorsque les gradients sont préparés et que la centrifugation est terminée, chargez également le supernatant de l’échantillon sur les deux gradients. Remplissez l’espace restant dans chaque tube de gradient avec ad-tampon contenant dix millimolar TCEP en s’assurant de remplir les tubes tout le chemin vers le haut.Réglez le poids des tubes opposés à une différence de poids zéro. Et modifier la centrifugeuse pour 176000 fois G et 4 degrés Celsius pendant deux heures. Après cela, utilisez une pince pour fixer un tube de centrifugation ultra à un support.S’assurer de laisser la zone autour du niveau de phase inférieure marqué accessible. Placez la lampe à col d’oie au-dessus du tube. Autour de la marque, à la frontière entre les phases inférieure et supérieure, une bande distincte doit être visible.Perforer le tube à l’aide d’une aiguille et aspirer la bande vectorielle dans une seringue pour recueillir le vecteur. Transférer les virons vecteurs collectés dans un tube de 15 millilitres et calculer la quantité de substrat de couplage nécessaire tel qu’il est décrit dans le protocole texte. Ensuite, transférez la solution vectorielle dans un tube de taille appropriée.Et la quantité calculée de raccordement composés solution stock. Mélanger délicatement par rotation aérienne pendant une heure à température ambiante. Ensuite, réglez le volume total de la solution vectorielle à six millilitres en ajoutant un tampon d’annonce.Purifier le vecteur de la moiety couplage non réagi à l’aide d’une deuxième étape de liaison au chlorure de césium tel que décrit dans le protocole de texte. Percer le tube à l’aide d’une aiguille et aspirer la bande vectorielle dans une seringue. Transférer les vecteurs collectés dans un tube de 15 millilitres.Si le combiné des deux tubes de gradient est inférieur à 2,5 millilitres, réglez le volume à 2,5 millilitres en ajoutant un tampon ad. Chargez les virons combinés sur une colonne améliorée égale et jetez le flux à travers. Ajoutez ensuite trois millilitres de tampon d’annonce à la colonne et recueillez le flux à travers.Ajouter 333 microlitres de glycérol au débit recueilli pour obtenir la concentration finale de dix pour cent. Divisez-les en aliquots appropriés. S’assurer d’inclure un aliquot de 20 microlitres pour une détermination plus serrée par la mesure OD 260.Conserver la solution vectorielle à 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit prête à l’emploi. Les résultats représentatifs des effets sur 293 cellules indiquent que la production vectorielle est réussie. Les cellules doivent présenter une morphologie 40-48 heures après avoir été inoculées avec le vecteur du virus.Le phage SDS taché d’argent est ensuite utilisé pour évaluer l’efficacité du couplage. Des vecteurs avec des Cystein introduits dans la base de pentone de capsomere avec l’hexon modifié et non modifié sont exécutés. Les bandes hexon présentent un décalage indiquant une modification réussie de plus de 90 pour cent des monomères par capside.Tout en essayant cette procédure, il est important d’assurer un environnement de réduction pour les particules vectorielles non modofiées. Après modification, une atmosphère régulière convient. Des calculs documentaires précis doivent assurer la modification quantitative de toutes les particules vectorielles.Le développement de cette technique aide la recherche dans le domaine de la thérapie génique à explorer davantage les stratégies sûres et déficientes pour la livraison vectorielle. Suivant cette procédure, d’autres méthodes comme le couplage des ligands pour le ciblage ou les colorants fluorescents pour l’étiquetage peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires comme l’utilisation des récepteurs et la biodissuration. S’il vous plaît assurez-vous d’obéir à vos OGM locaux et règlements sur la sécurité au travail.

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