Name: combined genetic and chemical capsid modifications of adenovirus-based gene transfer vectors for shielding and targeting
Uploaded: 2018-10-26T14:30:00
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Nota: In seguito, un protocollo per la PEGilazione geneti-chimico di un annuncio di vettore è descritto al dettaglio. Per attivare specifico accoppiamento della parte di PEG, un vettore di Ad5 in anticipo era geneticamente modificato dall'introduzione di un residuo di cisteina nella proteina hexon al loop ipervariabili 5 come descritto in una precedente pubblicazione36e un piolo maleimide-attivato composto è utilizzato come composto di accoppiamento.
1. preparazione del...

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L'efficienza con cui le cisteine geneticamente introdotte possono essere modificate chimicamente è in genere 80-99%, e determinate variabili influenzano questa efficienza. In primo luogo, è fondamentale che le cisteine geneticamente introdotte non subiscono l'ossidazione prematura. Pur essendo ben protetto in ambiente riducente delle cellule del produttore, è obbligatorio fornire un ambiente non ossidativo dopo rilasciando particelle di vettore dalle cellule di produttore e durante la modificazione chimica. A tal fine...

Adenovirus (annuncio), membri della famiglia Adenoviridae, sono virus a DNA senza involucro di cui più di 70 tipi finora sono stati identificati (http://hadvwg.gmu.edu). Seconda hemaglutination proprietà, struttura del genoma e risultati di sequenziamento, i tipi di 70 annunci possono essere diviso in sette specie (Adenovirus umano A G)1,2. Il genoma umano di annuncio è di 38 kb e incapsulato da un nucleocapside icosahedral3. A causa della loro abbondanza, il hexon di proteina del capside, penton base e fibra sono tutti appresso proteine del capside principali. Il hexon di proteine più abbondanti e più grande capside forma 20 sfaccettature del capsid, ciascuno composto da 12 hexon homotrimers4,5. Penton, situato su ogni bordo icosahedral (vertice), si compone di pentameri di una base di penton e rappresenta la base per il picco di vertice che è costruito di glicosilata fibra trimeri5,6. La voce di cella Ad nativa è sostanzialmente composto da due fasi principali. In primo luogo, la manopola di fibra si lega al recettore primario. In tipi di annunci da specie A, C, E e F, questo è il recettore di coxsackie e adenovirus (auto). Questa interazione porta il virione in prossimità spaziale della superficie delle cellule, facilitando in tal modo le interazioni tra le integrine cellulare e RGD-motivo nel penton base e di conseguenza l'induzione delle risposte cellulari. In secondo luogo, cambiamenti nel citoscheletro conducono alla interiorizzazione del virione e trasporto alla endosoma7. Su smontaggio parziale nell'endosoma, il virione è rilasciato al citoplasma und viaggia in definitiva al nucleo per la replica.
Mentre l'annuncio possa essere recapitato localmente (ad es., per la vaccinazione genetica), sistemica consegna attraverso il flusso sanguigno come richiesto per onco-Oncolitica deve affrontare diversi ostacoli. Mentre circolano nella circolazione sanguigna, iniettati virioni ritrovarvi con il sistema di difesa del sistema immunitario dell'ospite, che porta alla rapida neutralizzazione dei vettori basati su virus e vettori basati su annuncio di rendering estremamente inefficiente in applicazioni sistemiche. Inoltre, la hepatotropism naturale dell'annuncio interferisce con la consegna sistematica e devono essere risolti per reindirizzare Ad a sue nuove cellule bersaglio.
Germinale-codificato gli anticorpi di IgM naturali del sistema immunitario innato rapidamente riconoscono e legano strutture altamente ripetitive sulla superficie del virione8,9. Questi complessi immuni quindi attivano le vie di classiche e non classica del sistema del complemento, che conduce velocemente complemento-mediata di neutralizzazione di una gran parte dei virioni8. Una seconda via conseguente rimozione principali dei virions di annuncio è mediata dai macrofagi10 e connessi con acuta tossica ed emodinamici effetti collaterali11,12. Nel caso di annuncio in particolare, Kupffer cellule residenti nel fegato associare a e phagocytically occupano l'annuncio virioni tramite specifici recettori scavenger, quindi eliminarli dal sangue13,14,15 . Recettori scavenger specifiche sono stati identificati anche su cellule endoteliali sinusoidali del fegato (cellule di LSE)16, e le cellule LSE sembrano anche contribuire al vettore eliminazione17, ma a che punto ha ancora bisogno di chiarimenti. Inoltre, alcuni tipi di annunci e dei loro vettori derivate in modo efficiente sono sequestrati da eritrociti umani18 a cui si legano tramite auto o il recettore del complemento CR119. Di nota, questo meccanismo sequestrante non può essere studiato nel sistema modello del mouse come in contrasto con gli eritrociti umani, gli eritrociti del mouse non esprimono auto.
Anticorpi specifici anti-annuncio generati dal sistema immunitario adattativo dopo l'esposizione a questo annuncio a causa di precedenti infezioni con l'annuncio o dopo la prima consegna in applicazioni sistemiche sollevare un ulteriore ostacolo all'efficace uso di vettori Ad, ed essi dovrebbero essere eluso in consegna efficiente e sistematica.
Infine, il forte hepatotropism di alcuni tipi di annunci (compresi Ad5) gravemente ostacola applicazione dell'annuncio in terapia sistemica. Questo tropismo conseguente trasduzione dell'epatocita è dovuto l'alta affinità del virione annuncio per il fattore di coagulazione di sangue X (FX), mediato dall'interazione di FX con l'annuncio del hexon proteina20,21,22. FX colma il virione di eparina solfato glicani (HSPGs) sulla superficie di epatociti20,23,24,25. Un fattore cruciale per questa interazione sembra essere la misura specifica di N - e O-solfatazione di HSPGs in cellule di fegato24, che è distinta da HSPGs su altri tipi di cellule. Oltre a questa via FX-mediata, gli studi recenti suggeriscono ulteriori percorsi non ancora identificati che si traducano in trasduzione di annuncio di epatociti26,27,28.
Recentemente, risulta che FX non è solo coinvolto nella trasduzione degli epatociti dell'annuncio, ma anche dall'associazione, il virione scudi la particella virale contro neutralizzazione dal sistema complemento26. Riduzione della trasduzione dell'epatocita impedendo l'associazione FX, pertanto, creerebbe l'effetto collaterale indesiderato di crescente annuncio neutralizzazione tramite il sistema immunitario innato.
Una profonda conoscenza delle complesse interazioni tra vettori e organismi ospite è quindi necessaria sviluppare vettori più efficiente per le applicazioni sistemiche che aggirare gli ostacoli imposti dall'organismo dell'ospite.
Una strategia che è stato originariamente utilizzata per le proteine terapeutiche è stata adattata per i vettori Ad almeno parzialmente superare le barriere descritte sopra. Antigenicità ed immunogenicità dei composti di proteine terapeutiche potrebbe essere ridotto dall'accoppiamento di polietilenglicole (PEG)29,30. Quindi, l'accoppiamento covalente di polimeri quali PEG o poli [N-(2-idrossipropil) methacrylamid] (pHPMA) per le proteine del capside superficie protegge il vettore da interazioni indesiderate vettore-ospite. Comunemente, polimero gruppi ε-amminici obiettivi di accoppiamento da residui di lisina laterali che sono distribuite in modo casuale sulla superficie del capside. Particelle di vettore in soluzione sono, a causa della natura idrofila dei polimeri allegati, circondate da un guscio di acqua stabile che riduce il rischio di riconoscimento delle cellule immuni o degradazione enzimatica. Inoltre, vettori di PEGylated annuncio sono stati indicati per eludere la neutralizzazione di anticorpi anti-hexon in vitro e in topi pre-immunizzati in vivo31. In contrasto con le modifiche genetiche del capsid, accoppiamento chimico dei polimeri viene eseguita dopo la produzione e purificazione, permettendo non solo per l'uso di convenzionale produttore cellule e produzione delle scorte di alto titolo vettoriale, ma anche per simultanea modifica di migliaia di aminoacidi sulla superficie del capside. Tuttavia, ammina-regia di schermatura si verifica in modo casuale su tutta la superficie intera del capsid, alta eterogeneità e non consentendo per la modifica di specifici capsomers. Inoltre, le moiety polimero grande necessarie per gli effetti benefici compromettere virus bioattività32.
Per superare queste limitazioni, Kreppel et al. 33 ha introdotto un concetto di geneti-chimiche per re - vettore e de-targeting. Cisteine geneticamente sono stati introdotti il capside del virus alle posizioni esposte al solvente come fibra HI-ciclo33, proteina IX34e hexon35,36. Anche se non naturale, cisteina-cuscinetto vettori di annuncio possono presentarsi ad alti titoli in cellule normali produttore. D'importanza, inserimento delle cisteine in determinate capsomers e in diverse posizioni all'interno di un singolo capsomer consente di effettuare modifiche altamente specifiche di moiety gruppo reattivo del tiolo. Questo approccio geneti-chimica ha dimostrato di superare numerosi ostacoli nel disegno vettoriale di annuncio. La combinazione di base ammina PEGilazione tiolo-basato di accoppiamento della transferrina alla manopola fibra che Hi-ciclo è stato provato con successo reimpostare per volta vettori di annuncio per auto-carenti cellule33e detargeting. Dal hexon è coinvolto nelle interazioni più indesiderati (neutralizzando gli anticorpi, FX di fattore di coagulazione del sangue), strategie di modificazione del tiolo-base vengono applicate anche ad hexon. Piccolo PEG moiety di accoppiamento a HVR5 del hexon ha impedito le particelle di vettore di annuncio per trasdurre cellule SKOV-3 in presenza di FX, mentre grande PEG moiety aumentato dell'epatocita trasduzione14,35. Particelle di vettore di annuncio che trasportano le mutazioni nella manopola fibra inibendo il legame auto e HVR7 legame d'inibizione della FX (e cuscinetto inserito cisteine in HVR1 per posizione-specifiche PEGilazione) sono state indicate per eludere la neutralizzazione degli anticorpi e complemento-mediata, così come assorbimento di mediata dal recettore scavenger senza perdita di infettività. È interessante notare che, malgrado una mancanza dello scudo naturale FX, PEGilazione nuovamente migliorato trasduzione degli epatociti in funzione della PEG dimensioni36. Tuttavia, è stato dimostrato che la schermatura covalente hanno un impatto sui processi di traffici intracellulari. Prill et al. rispetto irreversibile contro scudi bioresponsive basato su pHPMA e ha dimostrato che né la modalità di carica schermatura né co-polimero ha avuto un impatto su immissione di cella ma ha colpito la particella traffico al nucleo. Impiegando uno scudo bioresponsive con carica positiva pHPMA co-polimeri ammessi per traffico di particelle nel nucleo, mantenendo l'efficienza di trasduzione alta dell'annuncio vettori in vitro e in vivo37.
In sintesi, questi dati indicano che, anche sotto l'ipotesi che tutte le interazioni-ospite-vettore erano conosciute e considerate, capside eccessiva superficie sono necessarie modifiche per superare gli ostacoli connessi con consegna sistemica vettoriale.
Qui forniamo un protocollo per eseguire modifiche chimiche site-specifiche di capsidi vettoriale dell'adenovirus per schermatura e/o di retargeting di particelle di vettore dell'adenovirus e virus oncolitici basati sull'adenovirus. Il concetto di questa tecnologia è descritta nella Figura 1. Permette la schermatura di alcune regioni del capsid da interazioni indesiderate dal legame covalente di polimeri sintetici. Allo stesso tempo, fornisce anche un mezzo per collegare ligandi e combinare schermatura e targeting. Utilizzando chimica semplice, sperimentatori sarà in grado di modificare covalentemente superficie vettoriale dell'adenovirus con una grande varietà di molecole tra cui peptidi e proteine, carboidrati, lipidi e altre piccole molecole. Inoltre, il protocollo prevede un concetto generale per la modificazione chimica di vettori di virus-derivati biologicamente attivi sotto mantenimento della loro integrità biologica e attività.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vector purification and chemical modification</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Argon gas</td>
			<td>Air liquide</td>
			<td>local gas dealer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen</td>
			<td>Air liquide</td>
			<td>local gas dealer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup Express Plus 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706-10g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL (3mL) Norm Ject (syringes)</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4020.000V0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-Ject needles for single use (yellow 0.9 x 40 mm)</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4710009040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caesium chloride 99.999% Ultra Quality</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8627.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel beads</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A4569.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxypolyethylene glycol maleimide - 750 (PEG mal-750)</td>
			<td>Iris Biotech</td>
			<td></td>
			<td>store in silica gel beads at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13.2 mL Ultra Clear Ultracentrifuge Tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td>only open in hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD-10 size exclusion chromatography column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0851-01</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1069.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS Ultrapure</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1112,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1123.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material for cell-culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-03590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P10-0231SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Good</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P06-07100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosphere Filter Tips (various sizes)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes (various sizes)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reaction tubes (various sizes)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC plates 15cm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material for silver staining protocol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>1613,2500PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0820,2500PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 37%</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0877,0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1613,2500PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium thiosulfate</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>1,418,791,210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver nitrate</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3944.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3900,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Special Lab Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>5311-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megafuge 40</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roter for Megafuge TX750 + Adapter andLlids for 500 mL tubes</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Conventional</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge e.g. Optima XPN-80</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>suitable Ultrazentrifuge Rotor e.g. SW41</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH -Meter</td>
			<td>Conventional</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stand with clamps</td>
			<td>Conventional</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goose neck lamp</td>
			<td>Conventional</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Over-head rotor</td>
			<td>Conventional</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Block</td>
			<td>Conventional</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photometer (OD 260)</td>
			<td>Conventional</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combined genetic and chemical capsid modifications of adenovirus-based gene transfer vectors for shielding and targeting

L'adenovirus vettori sono potenti strumenti per Oncolitica di vaccinazione e oncolytic genetica. Tuttavia, sono inclini a più interazioni indesiderate vettore-ospite, soprattutto dopo la consegna in vivo . È un consenso che i limiti imposti dalle interazioni indesiderate vettore-ospite possono solo essere superata se vengono eseguite modifiche definite della superficie vettoriale. Tali modifiche includono targeting tramite l'introduzione di nuovi ligandi e schermatura delle particelle da interazioni indesiderate. L'obiettivo del protocollo presentato qui è quello di consentire al lettore di generare schermato e, se lo si desidera, reindirizzati adenovirus umano gene transfer vettori o virus oncolitici. Il protocollo consentirà ai ricercatori di modificare la superficie di capsidi vettoriale dell'adenovirus da allegato specifico chimica di polimeri sintetici, carboidrati, lipidi o altre molecole biologiche o chimiche. Esso descrive la tecnologia all'avanguardia di modifiche combinato del capsid genetica e chimica, che sono stati indicati per facilitare la comprensione e il superamento delle barriere per la consegna in vivo di vettori dell'adenovirus. Viene fornita una descrizione dettagliata e commentata delle fasi cruciali per l'esecuzione di specifiche reazioni chimiche con virus biologicamente attivi o vettori derivati dal virus. La tecnologia descritta nel protocollo si basa sull'introduzione genetica della cisteina (naturalmente assente) residui in solvente-esposti cicli di vettori derivati dell'adenovirus. Questi residui di cisteina forniscono una specifica reattività chimica che, dopo la produzione dei vettori per gli alti titoli, è utilizzabile per altamente specifico ed efficiente accoppiamento chimico covalente di molecole da una vasta gamma di classi di sostanze al vettore particelle. D'importanza, questo protocollo può essere facilmente adattato per eseguire un'ampia varietà di differenti modificazioni chimiche (non-tiolo-base) di capsidi vettoriale dell'adenovirus. Infine, è probabile che vettori di trasferimento non capsulati genica basati su virus diverso da quello dell'adenovirus può essere modificato dalla base del presente protocollo.

Nella figura 2 vengono illustrati esempi dell'effetto citopatico (CPE) su 293 cellule (HEK 293) che indica la produzione di successo vettoriale. Le cellule dovrebbero mostrare morfologia (Figura 2) 40-48 ore dopo l'inoculazione con il vettore di virus. Timepoint giusto per la raccolta è fondamentale per non perdere le particelle del virus di lisi cellulare e impedendo l'ossidazione dei gruppi tiolici geneticamente introdotto. Se...

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Combined Genetic and Chemical Capsid Modifications of Adenovirus-Based Gene Transfer Vectors for Shielding and Targeting

Il protocollo descritto qui consente ai ricercatori di modificare specificamente capsidi adenovirus su siti selezionati dalla chimica semplice. Schermato adenovirus vettori particelle e gene bersagliamento trasferimento vettori possono essere generati, e interazioni ospite vettoriale possono essere studiati.

Combinate le modifiche genetiche e chimiche del Capsid di vettori basati su Adenovirus Gene Transfer per schermatura e Targeting

Adenovirus vectors are potent tools for genetic vaccination and oncolytic virotherapy. However, they are prone to multiple undesired vector-host ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della terapia genica, dell'oncolisi e della vaccinazione genetica. Facilita la comprensione e la modulazione delle interazioni vettoriali degli ospiti dei vettori di trasferimento genico adenovirus, il tipo vettoriale più frequentemente utilizzato negli studi clinici aggiornati. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i capsulati di adenovirus possono essere specificamente modificati in modo altamente definito in posizioni selezionate e in misura variabile utilizzando una semplice chimica.Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la terapia perché la modifica dell'ospite vettoriale non può solo essere analizzata ma anche modulata in modo orientato al paziente. Sebbene questo metodo fornisca informazioni su specifiche interazioni vettoriali dell'ospite, può anche essere utilizzato per l'etichettatura e il tracciamento delle particelle virali negli organismi viventi, come i topi. Generalmente, gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà con la combinazione unica di virologia e biochimica organica che richiede conoscenze pratiche da entrambi i campi.La dimostrazione speciale di questa tecnica è fondamentale perché qui i metodi di Chimica Organica incontrano i metodi di Biologia Cellulare e Virologia, inclusi i trucchi di manipolazione specifici sul campo. Per iniziare questa procedura, preparare tutti i buffer come descritto nel protocollo di testo. Pesare un millilitro di ogni buffer di gradiente per controllarne la densità.Dopo aver sterilizzato tutti i tamponi, sparge i tamponi contenenti TCEP con gas argon per circa 30 secondi per prevenire l'ossidazione del TCEP. Conservare le fiale contenenti la fossa di accoppiamento in polvere solida in tubi più grandi, ognuno riempito con un cuscino di perline in gel di silice, per evitare l'accumulo di acqua di condensazione durante lo scongelamento delle fiale. Mettere questi tubi in un essiccatore.Rimuovere l'aria nell'essiccatore e sostituirla con gas argon. Quindi chiudere saldamente ogni tubo e trasferirlo in un contenitore più grande con perline in gel di silice. Una volta che tutti i tubi sono stati trasferiti, chiudere il contenitore.Conservare il contenitore a 80 gradi Celsius fino a quando non è pronto per l'uso. Quando è pronto per scongelarsi, posizionare il contenitore in uno strato di perline di silice in un essiccatore. Lasciare riscaldare lentamente il contenitore a temperatura ambiente e quindi aprire il contenitore.Quando le cellule raggiungono l'effetto citopatico ottimale, raccoglierle raschiando le piastre e trasferendo il supernatante in tubi di centrifuga. Ruotare la sospensione cellulare a 400 volte G per 10 minuti. Successivamente, sospendere di nuovo il pellet cellulare in quattro millilitri di Ad buffer contenente TCEP da 10 millimolare e trasferire la soluzione risultante in un tubo sterile da 50 millilitri.Congelare la soluzione in azoto liquido e quindi scongelarla in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Ripeti questo ciclo di disgelo di congelamento tre volte per salvare il vettore. Centrifuga a 5000 G e quattro gradi Celsius per dieci minuti.Durante la centrifugazione impostare due tubi ultra centrifuga per iniziare a preparare due gradienti uguali di passo cloruro di cesio. Aggiungere tre millilitri della fase inferiore a ciascuno di questi tubi. Contrassegnare il livello della fase inferiore sul tubo prima di caricare la fase superiore.Quindi impilare con cura cinque millilitri della fase superiore fino alla fase inferiore, tubazione molto lentamente lungo le pareti del tubo. Quando i gradienti sono preparati e la centrifugazione è completa caricare il supernatante dal campione equamente sulle due sfumature. Riempire lo spazio rimanente in ogni tubo sfumato con Ad-buffer contenente dieci TCEP millimolare assicurandosi di riempire i tubi fino in cima.Regolare il peso dei tubi opposti in base a una differenza di peso zero. E alterare la centrifuga per 176000 volte G e 4 gradi Celsius per due ore. Successivamente, utilizzare un morsetto per fissare un tubo di ultra centrifugazione a un supporto.Assicurarsi di lasciare accessibile l'area intorno al livello della fase inferiore contrassegnata. Posizionare la lampada dal collo d'oca sopra il tubo. Intorno al segno, al confine tra le fasi inferiore e superiore, dovrebbe essere visibile una banda distinta.Forare il tubo con un ago e aspirare la banda vettoriale in una siringa per raccogliere il vettore. Trasferire i viron vettoriali raccolti in un tubo da 15 millilitri e calcolare la quantità di substrato di accoppiamento necessaria come delineato nel protocollo di testo. Quindi, trasferire la soluzione vettoriale in un tubo di dimensioni appropriate.E la quantità calcolata di composti di accoppiamento soluzione stock. Mescolare delicatamente con rotazione aerea per un'ora a temperatura ambiente. Quindi, regola il volume totale della soluzione vettoriale in sei millilitri aggiungendo ad buffer.Purificare il vettore dalla moietà di accoppiamento non transazionale usando un secondo passo di legame del cloruro di cesio come delineato nel protocollo di testo. Forare il tubo con un ago e aspirare la banda vettoriale in una siringa. Trasferire i vettori raccolti in un tubo da 15 millilitri.Se la combinazione da entrambi i tubi gradiente è inferiore a 2,5 millilitri, regolare il volume a 2,5 millilitri aggiungendo ad buffer. Caricare i viron combinati su una colonna Pd aggiornata uguale ed eliminare il flusso. Quindi aggiungere tre millilitri di Buffer annuncio alla colonna e raccogliere il flusso attraverso.Aggiungere 333 microlitri di glicerolo al flusso raccolto attraverso per ottenere la concentrazione finale del dieci per cento. Dividili in aliquote adatte. Assicurarsi di includere un'aliquota di 20 microlitri per una determinazione più rigorosa mediante misurazione OD 260.Conservare la soluzione vettoriale a 80 gradi Celsius fino a quando non è pronta per l'uso. I risultati rappresentativi degli effetti su 293 cellule indicano che la produzione vettoriale ha successo. Le cellule devono mostrare morfologia 40-48 ore dopo essere state inoculate con il vettore virale.Il fago SDS macchiato d'argento viene quindi utilizzato per valutare l'efficienza di accoppiamento. Vengono eseguiti vettori con Cistein introdotti nella base pentone capsomere sia con l'esagono modificato che non modificato. Le bande hexon mostrano uno spostamento che indica una modifica riuscita di oltre il 90% dei monomeri per capsid.Durante il tentativo di questa procedura è importante garantire un ambiente riducente per particelle vettoriali non modificate. Dopo la modifica, è adatta un'atmosfera regolare. Precisi calcoli documentali devono garantire la modifica quantitativa di tutte le particelle vettoriali.Lo sviluppo di questa tecnica aiuta la ricerca nel campo della terapia genica a esplorare ulteriormente strategie sicure e carenti per la consegna vettoriale. Seguendo questa procedura possono essere eseguiti altri metodi come l'accoppiamento di ligandi per il targeting o coloranti fluorescenti per l'etichettatura al fine di rispondere a domande aggiuntive come l'uso del recettore e la bio distribuzione. Assicurati di rispettare le normative locali in materia di OGM e sicurezza sul lavoro.

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