Name: combined genetic and chemical capsid modifications of adenovirus-based gene transfer vectors for shielding and targeting
Uploaded: 2018-10-26T14:30:00
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Nota: em seguida, um protocolo para PEGylation geneti-química de um anúncio de vetor é descrito com detalhe. Para habilitar o acoplamento específico da fracção de PEG, um vetor Ad5 previamente foi geneticamente modificado por introduzir um resíduo de cisteína da proteína hexon no loop hipervariável 5 conforme descrito na publicação anterior36e um PEG maleimide-ativado composto é usado como composto de acoplamento.
1. preparação de Buffers para a purificaç?...

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A eficiência, pelo qual as cisteínas geneticamente introduzidas podem ser quimicamente modificadas normalmente é 80-99%, e certas variáveis influenciam essa eficiência. Em primeiro lugar, é fundamental que as cisteínas geneticamente introduzidas não sofrem oxidação prematura. Apesar de ser bem protegida no ambiente de redução das células de produtor, é obrigatório para fornecer um ambiente não-oxidativo após liberar partículas de vetor de células o produtor e durante a modificação química. Para este...

Adenovírus (Ad), membros da família Adenoviridae, são vírus de DNA não-envelope de que mais de 70 tipos até agora têm sido identificadas (http://hadvwg.gmu.edu). Dependendo hemaglutination Propriedades, estrutura do genoma e resultados de sequenciamento, os tipos de 70 Ad podem ser divididos em sete espécies (adenovírus humano À G)1,2. Genoma humano Ad é 38 kb em tamanho e encapsulado por um nucleocapsídeo icosahedral3. Devido à sua abundância, o hexon de proteínas do capsídeo, penton base e fibra são todos referidos como proteínas do capsídeo principais. O mais abundante e a maior hexon de proteínas do capsídeo forma 20 facetas do capsídeo, cada um composto por 12 hexon homotrimers4,5. Penton, localizado em cada borda icosaédrica (vértice), consiste em pentamers de uma base de penton e representa a base para o pico de vértice que é construído de glicosilados fibra trímeros5,6. A entrada da pilha nativa do Ad é composta basicamente de duas etapas principais. Primeiro, o botão de fibra liga-se ao receptor primário. Tipos de anúncio da espécie A, C, E e F, este é o receptor de coxsackie e adenovírus (carro). Essa interação traz o vírion em proximidade espacial da superfície celular, facilitando interações entre integrinas celulares e RGD-motif na penton base e consequentemente induzindo respostas celulares. Em segundo lugar, as alterações no citoesqueleto levam a internalização do virion e transporte para o endossomo7. Após desmontagem parcial no endossomo, o vírion é liberado para o citoplasma und, finalmente, viaja para o núcleo para replicação.
Enquanto Ad pode ser entregues localmente (ex., para a vacinação genética), entrega sistêmica através da corrente sanguínea conforme necessário para onco-virotherapy enfrenta várias barreiras. Ao circular na corrente sanguínea, injetados virions encontram o sistema de defesa da imunidade do hospedeiro, levando a rápida neutralização dos vectores baseados em vírus e renderização baseada em Ad-vetores extremamente ineficiente em aplicações sistêmicas. Além disso, o hepatotropism natural de Ad interfere com entrega sistêmica e deve ser resolvido para redirecionar Ad para suas novas células alvo.
Germline codificado IgM anticorpos naturais do sistema imunitário inato rapidamente reconhecem e vincular estruturas altamente repetitivas na superfície do virion8,9. Estes complexos imunes, em seguida, ativar as vias clássicas e não-clássica do sistema complemento, levando a neutralização rápido mediada por complemento de uma grande parcela do virions8. Um segundo caminho resultando em grande remoção de virions Ad é mediado por macrófagos10 e associado com aguda tóxico e hemodinâmicas efeitos colaterais11,12. No caso de anúncio em particular, Kupffer células que residem no fígado bind e phagocytically ocupam os Ad virions através ao tesouro específicos receptores, assim eliminando-os de sangue13,14,15 . Receptores específicos ao tesouro também foram identificados em células endoteliais sinusoidais fígado (células LSE)16, e células LSE também parecem contribuir para eliminação de vetor17, mas a que medida ainda precisa de esclarecimento. Além disso, alguns tipos de anúncio e seus vetores derivadas são eficientemente isolados por eritrócitos humanos18 a que se ligam através de carro ou o receptor do complemento CR119. Digno de nota, esse mecanismo de isolamento não pode ser estudado no sistema modelo de rato como em contraste com eritrócitos humanos, eritrócitos de rato não expressar o carro.
Anticorpos antianúncios específicos gerados pelo sistema imune adaptativo, após a exposição ao anúncio ou devido a infecções anteriores com Ad ou após a primeira entrega em aplicações sistêmicas levantem uma barreira mais eficaz utilização de vetores de Ad, e eles devem ser evitados em entrega eficiente e sistêmica.
Finalmente, o hepatotropism forte de alguns tipos de anúncio (incluindo Ad5) severamente dificulta a aplicação da Ad em terapia sistêmica. Este tropismo resultando na transdução de hepatócito é devido a alta afinidade do vírion a Ad de fator de coagulação de sangue X (FX), mediada pela interação de FX com a Ad hexon proteína20,21,22. FX pontes o vírion para os glicanos de sulfato de heparina (HSPGs) na superfície dos hepatócitos20,23,24,25. Um fator crucial para esta interação parece ser a medida específica de N - e O-sulfatação dos HSPGs em células do fígado,24, que é distinta da HSPGs em outros tipos de células. Além desta via mediada por FX, estudos recentes sugerem ainda mais vias ainda não identificaram que resultam na transdução de anúncio de hepatócitos26,,27,28.
Recentemente, ficou demonstrado que FX não é apenas envolvido na transdução de hepatócitos de Ad, mas também pela ligação, o vírion protege a partícula do vírus contra a neutralização pelo sistema de complemento26. Redução de transdução do hepatócito, impedindo a ligação de FX, portanto, criaria o efeito colateral indesejado de aumentar Ad neutralização através do sistema imunitário inato.
Um profundo conhecimento das complexas interações entre vetores e organismos host, portanto, é necessário desenvolver mais eficientes vetores para aplicações sistêmicas que contornar os obstáculos impostos pelo organismo do hospedeiro.
Uma estratégia que foi originalmente usada para proteínas terapêuticas foi adaptada para vetores de Ad para pelo menos parcialmente, ultrapassar as barreiras descritas acima. Antigenicidade e imunogenicidade de compostos de proteínas terapêuticas poderiam ser reduzidos pelo acoplamento com polietileno glicol (PEG)29,30. Daí, o acoplamento covalente de polímeros tais como PEG ou poli [N-(2-hidroxipropil) methacrylamid] (pHPMA) para o capsídeo superfície protege o vetor de interações indesejadas vetor-hospedeiro. Comumente, o acoplamento de polímero destinos grupos ε-amino dos resíduos de lisina lado aleatoriamente distribuídos na superfície do capsídeo. Partículas de vetor em solução são, devido à natureza hidrofílica dos polímeros anexados, rodeadas por uma concha de água estável que reduz o risco de reconhecimento imune celular ou degradação enzimática. Além disso, vetores peguilado Ad foram mostrados para iludir a neutralização por anti-hexon anticorpos em vitro e em camundongos previamente imunizado na vivo31. Em contraste com modificações genéticas capsídeo, acoplamento químico de polímeros é executado após a produção e purificação, permitindo não apenas para o uso de células de produtor convencional e produção das unidades populacionais de vetor de alta concentração, mas também para simultânea modificação de milhares de aminoácidos na superfície do capsídeo. No entanto, Amina-dirigido blindagem ocorre aleatoriamente em toda a superfície inteira do capsídeo, resultando em altas heterogeneidades e não permitindo a modificação de capsomers específico. Além disso, as metades de polímero grande exigidos para efeitos benéficos prejudicam vírus Bioatividade32.
Para superar essas limitações, Kreppel et al. 33 introduziu um conceito geneti-químicas para vetor re - e de orientação. Cisteínas introduzidas geneticamente o capsídeo do vírus em posições expostas ao solvente como fibra HI-laço33, proteína IX34e35,de hexon36. Embora não ocorrem naturalmente, cisteína-rolamento vetores Ad podem ser produzidos em títulos elevados em células normais do produtor. Importante, inserção de cisteínas em certas capsomers e em posições diferentes dentro de um único capsomer permite modificações altamente específicas de metades reativa-grupo tiol. Esta abordagem geneti-químicas foi mostrada para superar inúmeros obstáculos no design do vetor Ad. A combinação de baseado em amina PEGylation para acoplamento thiol-baseado da transferrina para o botão de fibra que Hi-laço tem sido comprovada com êxito redirecionar modificado vetores de anúncio de carro-deficiente células33e detargeting. Desde que o hexon está envolvido em interações mais indesejáveis (neutralizando anticorpos, fator de coagulação do sangue FX), estratégias de modificação thiol-baseado também foram aplicadas a hexon. Acoplamento de pequenas partes de PEG para HVR5 de hexon impediu partículas de vetor Ad para transduce SKOV-3 células na presença de FX, Considerando que grandes partes de PEG aumentaram hepatócito transdução14,35. Partículas de vetor de anúncio carregando mutações no botão de fibra, inibindo a ligação do carro e no HVR7 inibindo vinculação de FX (e cisteínas rolamento inserido em HVR1 para posição específica PEGylation) foram mostradas para iludir a neutralização mediada por anticorpos e complemento, assim como a captação de mediada ao tesouro sem perda de infecciosidade. Curiosamente, apesar da falta do escudo natural FX, PEGylation novamente melhorado transdução dos hepatócitos em função da PEG tamanho36. No entanto, foi demonstrado que a blindagem covalente tem um impacto sobre os processos de tráfico intracelulares. Prill et al. comparado irreversível contra escudos bioresponsive baseado no pHPMA e demonstrou que nem o modo de carga de blindagem nem co polímero teve um impacto na entrada da pilha, mas afetou a partícula tráfico para o núcleo. Empregar um escudo de bioresponsive com pHPMA carregados positivamente co polímeros permitidos para tráfico de partícula no núcleo, mantendo a eficiência elevada transdução de Ad vectores in vitro e in vivo37.
Em resumo, estes dados indicam que, mesmo sob a suposição de que todo vetor-hospedeiro-interações foram conhecidas e consideradas, modificações de superfície capsídeo excessiva são necessárias para superar os obstáculos associados com vetor sistêmica de entrega.
Aqui nós fornecemos um protocolo para realizar modificações químicas específicas de capsids do vetor de adenovírus para blindagem e/ou redirecionamento de partículas de vetor de adenovírus e vírus Oncolíticos baseados em adenovírus. O conceito desta tecnologia é descrito na Figura 1. Ele permite que a blindagem de certas regiões do capsídeo de interações indesejadas por ligação covalente de polímeros sintéticos. Ao mesmo tempo, ele também fornece um meio de anexar ligantes e combinam a blindagem e direcionamento. Usando simples química, experimentadores será capazes de modificar covalentemente a superfície de vetor adenovírus com uma grande variedade de moléculas incluindo peptídeos/proteínas, hidratos de carbono, lípidos e outras moléculas pequenas. Além disso, o protocolo prevê a modificação química de vetores de vírus-derivado biologicamente ativos sob a manutenção da sua integridade biológica e atividade a um conceito geral.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vector purification and chemical modification</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Argon gas</td>
			<td>Air liquide</td>
			<td>local gas dealer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen</td>
			<td>Air liquide</td>
			<td>local gas dealer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup Express Plus 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706-10g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL (3mL) Norm Ject (syringes)</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4020.000V0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-Ject needles for single use (yellow 0.9 x 40 mm)</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4710009040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caesium chloride 99.999% Ultra Quality</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8627.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel beads</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A4569.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxypolyethylene glycol maleimide - 750 (PEG mal-750)</td>
			<td>Iris Biotech</td>
			<td></td>
			<td>store in silica gel beads at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13.2 mL Ultra Clear Ultracentrifuge Tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td>only open in hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD-10 size exclusion chromatography column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0851-01</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1069.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS Ultrapure</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1112,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1123.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material for cell-culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-03590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P10-0231SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Good</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P06-07100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosphere Filter Tips (various sizes)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes (various sizes)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reaction tubes (various sizes)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC plates 15cm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material for silver staining protocol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>1613,2500PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0820,2500PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 37%</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0877,0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1613,2500PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium thiosulfate</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>1,418,791,210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver nitrate</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3944.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3900,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Special Lab Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>5311-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megafuge 40</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roter for Megafuge TX750 + Adapter andLlids for 500 mL tubes</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Conventional</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge e.g. Optima XPN-80</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>suitable Ultrazentrifuge Rotor e.g. SW41</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH -Meter</td>
			<td>Conventional</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stand with clamps</td>
			<td>Conventional</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goose neck lamp</td>
			<td>Conventional</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Over-head rotor</td>
			<td>Conventional</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Block</td>
			<td>Conventional</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photometer (OD 260)</td>
			<td>Conventional</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combined genetic and chemical capsid modifications of adenovirus-based gene transfer vectors for shielding and targeting

Vetores adenovírus são potentes ferramentas para virotherapy de vacinação e Oncolíticos genética. No entanto, eles são propensos a várias interações indesejáveis vetor-hospedeiro, especialmente após a entrega na vivo . É um consenso que as limitações impostas pela interação vetor-hospedeiro indesejado só podem ser superada se definidas modificações da superfície do vetor são executadas. Essas modificações incluem a blindagem das partículas de interações indesejadas e direcionamento pela introdução de novos ligantes. O objetivo do protocolo aqui apresentado é permitir que o leitor gerar protegido e, se desejado, redirecionados vetores de transferência de gene humano adenovírus ou vírus Oncolíticos. O protocolo permitirá que pesquisadores modificar a superfície do capsids do vetor de adenovírus pelo específico acessório químico de polímeros sintéticos, carboidratos, lipídios ou outras partes biológicas ou químicas. Descreve a tecnologia de ponta de modificações de capsídeo combinada de genética e química, que têm sido mostrados para facilitar a compreensão e superação das barreiras para entrega na vivo de vetores adenovírus. É fornecida uma descrição detalhada e comentada dos passos cruciais para a realização de reações químicas específicas com vírus biologicamente ativos ou vetores de vírus-derivado. A tecnologia descrita no protocolo baseia-se na introdução genética de cisteína (naturalmente ausente) resíduos em ciclos expostas ao solvente de vetores adenovírus-derivado. Estes resíduos de cisteína fornecem uma reatividade química específica que pode, após a produção dos vetores de altos títulos, ser explorada para altamente específico e eficiente acoplamento químico covalente de moléculas de uma grande variedade de classes de substância para o vetor partículas. Importante, este protocolo pode facilmente ser adaptado para executar uma ampla variedade de diferentes (não-tiol-baseado) as modificações químicas de capsids do vetor de adenovírus. Finalmente, é provável que esse vetores de transferência do gene de baseados em vírus não-envelopado além de adenovírus podem ser modificadas desde a base do presente protocolo.

A Figura 2 mostra exemplos do efeito citopático (CPE) em 293 células (HEK 293) que indica a produção bem sucedida do vetor. As células devem mostrar morfologia (Figura 2) 40-48 horas após a inoculação com o vetor de vírus. O Commit certo para a colheita é crucial para não perder as partículas do vírus por lise celular e impedindo a oxidação dos grupos tiol geneticamente introduzido. Se partículas de vetor são lib...

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Combined Genetic and Chemical Capsid Modifications of Adenovirus-Based Gene Transfer Vectors for Shielding and Targeting

O protocolo descrito aqui permite que pesquisadores especificamente modificar capsids adenovírus em locais seleccionados pela química simples. Adenovírus blindado vectores partículas e vetores de transferência do gene redirecionada podem ser gerados, e interações do anfitrião de vetor podem ser estudadas.

Combinação de modificações genéticas e químicas de capsídeos em vetores de transferência gênica baseados em adenovírus para blindagem e direcionamento

Adenovirus vectors are potent tools for genetic vaccination and oncolytic virotherapy. However, they are prone to multiple undesired vector-host ...

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo da Terapia Genética, Oncolise e Vacinação Genética. Facilita a compreensão e modulação das interações de vetores dos vetores de transferência de genes adenovírus, o tipo vetorial mais usado em ensaios clínicos atualizados. A principal vantagem desta técnica é que os capsulados de adenovírus podem ser especificamente modificados de forma altamente definida em posições selecionadas e em proporção variável usando química simples.As implicações dessa técnica se estendem para a terapia porque a modificação do hospedeiro vetorial não pode ser apenas analisada, mas também modulada de forma orientada ao paciente. Embora este método forneça informações sobre interações específicas de hospedeiros vetoriais, ele também pode ser usado para rotular e rastrear partículas de vírus em organismos vivos, como ratos. Geralmente, indivíduos novos neste método lutarão com a combinação única de Virologia e Cquímica Orgânica que requer conhecimento prático de ambos os campos.A demonstração especial desta técnica é fundamental porque aqui os métodos da Química Orgânica atendem métodos da Biologia Celular e Virologia, incluindo truques de manuseio específicos de campo. Para iniciar este procedimento, prepare todos os buffers conforme descrito no protocolo de texto. Pesar um mililitro de cada tampão de gradiente para verificar sua densidade.Depois de esterilizar todos os buffers, esparge os tampões contendo TCEP com gás argônio por cerca de 30 segundos para evitar a oxidação do TCEP. Armazene os frascos contendo o moiety de acoplamento em pó sólido em tubos maiores, cada um cheio com uma almofada de contas de gel de sílica, para evitar o acúmulo de água condensada ao descongelar os frascos. Coloque esses tubos em um dessecador.Remova o ar no desiccator e substitua-o por gás argônio. Em seguida, feche cada tubo firmemente e transfira-o para um recipiente maior com contas de gel de sílica. Uma vez que todos os tubos tenham sido transferidos, feche o recipiente.Armazene o recipiente a 80 graus Celsius até estar pronto para usar. Quando estiver pronto para descongelar, coloque o recipiente em uma camada de contas de sílica em um dessecante. Deixe o recipiente aquecer lentamente até a temperatura ambiente e, em seguida, abra o recipiente.Quando as células atingirem o efeito citopático ideal, colete-as raspando as placas e transferindo o supernatante para tubos centrífugas. Gire a suspensão do celular a 400 vezes G por 10 minutos. Em seguida, suspenda a cápsula celular em quatro mililitros de tampão de anúncio contendo 10 mililitros de TCEP e transfira a solução resultante para um tubo estéril de 50 mililitros.Congele a solução em nitrogênio líquido e descongele-a em um banho de água a 37 graus Celsius. Repita este ciclo de congelamento três vezes para resgatar o vetor. Centrífuga a 5000 G e 4 graus Celsius por 10 minutos.Enquanto a centrifugação estabeleceu dois tubos ultra centrífugas para começar a preparar dois gradientes de passo de cloreto de césio iguais. Adicione três mililitros da fase inferior a cada um desses tubos. Marque o nível da fase inferior no tubo antes de carregar a fase superior.Em seguida, empilhar cuidadosamente cinco mililitros da fase superior até a fase inferior, pipetando-o muito lentamente para baixo ao longo das paredes do tubo. Quando os gradientes são preparados e a centrifugação é completa carregar o sobrenante da amostra igualmente sobre os dois gradientes. Encha o espaço restante em cada tubo de gradiente com tampão de anúncio contendo dez milimões de TCEP certificando-se de encher os tubos até o topo.Ajuste o peso dos tubos opostos para uma diferença de peso zero. E alterar centrífuga por 176000 vezes G e 4 graus Celsius por duas horas. Depois disso, use um grampo para fixar um tubo de ultra centrifugação em um suporte.Certificando-se de deixar a área ao redor do nível de fase inferior marcado acessível. Coloque a lâmpada de pescoço de ganso acima do tubo. Ao redor da marca, na borda entre as fases inferior e superior, uma faixa distinta deve ser visível.Puna o tubo com uma agulha, e aspire a banda vetorial em uma seringa para coletar o vetor. Transfira os vernos vetoriais coletados para um tubo de 15 mililitros e calcule a quantidade de substrato de acoplamento necessário conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, transfira a solução vetorial para um tubo de tamanho apropriado.E a quantidade calculada de acoplamento compostos solução de estoque. Misture suavemente por rotação aérea durante uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, ajuste o volume total da solução vetorial para seis mililitros adicionando buffer de anúncio.Purifique o vetor da moiety de acoplamento não redigido usando uma segunda etapa de ligação de cloreto de césio, conforme descrito no protocolo de texto. Perfure o tubo com uma agulha e aspire a banda vetorial em uma seringa. Transfira os vetores coletados para um tubo de 15 mililitros.Se o combinado de ambos os tubos de gradiente for inferior a 2,5 mililitros, ajuste o volume para 2,5 mililitros adicionando tampão de anúncio. Carregue os virons combinados até uma coluna Pd igualmente atualizada e descarte o fluxo através. Em seguida, adicione três mililitros de tampão de anúncios à coluna e colete o fluxo através.Adicione 333 microliters de glicerol ao fluxo coletado para obter a concentração final de 10%. Divida-os em alíquotas adequadas. Certificando-se de incluir uma alíquota de 20 microliters para uma determinação mais rigorosa pela medição de OD 260.Armazene a solução vetorial a 80 graus Celsius até estar pronta para uso. Resultados representativos dos efeitos em 293 células indicam que a produção de vetores é bem sucedida. As células devem mostrar morfologia 40-48 horas depois de serem inoculadas com o vetor do vírus.A phage SDS manchada de prata é então usada para avaliar a eficiência do acoplamento. Vetores com Cysteins introduzidos na base de pentonita capsomere, tanto com o hexônio modificado como não modificados são executados. As bandas Hexon exibem uma mudança indicando modificação bem sucedida de mais de 90% dos monômeros por capsídeo.Ao tentar este procedimento, é importante garantir um ambiente de redução para partículas vetoriais não esfladas. Após a modificação, uma atmosfera regular é adequada. Cálculos documentais precisos têm que garantir a modificação quantitativa de todas as partículas vetoriais.O desenvolvimento dessa técnica ajuda a pesquisar no campo da Terapia Genética para explorar ainda mais estratégias seguras e deficientes para a entrega de vetores. Após este procedimento, outros métodos como o acoplamento de ligantes para direcionamento ou corantes fluorescentes para rotulagem podem ser realizados a fim de responder a perguntas adicionais como uso de receptores e distribuição biológica. Por favor, certifique-se de obedecer suas normas locais de OGM e segurança de trabalho.

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