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November 17th, 2018
DOI :
November 17th, 2018
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Title
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Administration of Antibiotics
2:29
Collection of Fecal Samples from Stool, Ileum Content and Ileum Wall
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Quantification of Intestinal Microbiota by qPCR
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Results: Quantification of Intestinal Microbiota by qPCR after Oral Antibiotic Treatment
7:51
Conclusion
Transcript
यह प्रोटोकॉल मौखिक एंटीबायोटिक प्रशासन के बाद चूहों की आंतों माइक्रोबायोटा परिवर्तनों की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक विश्वसनीय तरीका प्रदान करता है। यह माइक्रोबायल डिस्बायोसिस जैसे भड़काऊ आंत्र रोग से जुड़ी विकृतियों में अंतर्दृष्टि प्रदान करने वाले क्रॉस माइक्रोबायोटा इंटरैक्शन पर शोध में मदद कर सकता है। इन एंटीबायोटिक उपचार व्यवस्थाओं का मुख्य लाभ यह है कि वे चूहों को मौखिक एंटीबायोटिक प्रशासन से जुड़े सामान्य रूप से विशिष्ट वजन घटाने को रोकते हैं।
मौखिक gavage के माध्यम से एंटीबायोटिक उपचार को प्रीफॉर्म करने के लिए स्टॉक समाधान है कि तकनीकी प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में prepped किया गया है मिश्रण द्वारा एंटीबायोटिक दवाओं का एक कॉकटेल तैयार करते हैं । मिलीलीटर मिश्रण की मात्रा के लिए एम्पिसिलिन के 50 माइक्रोलीटर, जेंटामिसिन के 50 माइक्रोलीटर, नियोमाइसिन के 50 माइक्रोलीटर, मेट्रोनिडाजोल के 500 माइक्रोलीटर, वैनकोमाइसिन के 25 माइक्रोलीटर और पानी के 325 माइक्रोलीटर मिश्रण। किसी भी बुलबुले को नष्ट करने और एक उपयुक्त पण gavage सुई देते हुए एक मिलीलीटर सिरिंज पर एंटीबायोटिक मिश्रण लोड करें।
माउस कंधे पर त्वचा को मजबूती से पकड़ो और घेघा को सीधा करने के लिए सिर और गर्दन को फैलाएं। मुंह की छत के साथ और pharynx के पीछे की ओर खिला सुई की गेंद टिप प्रत्यक्ष। फिर धीरे-धीरे इसे घेघा में नीचे से गुजरती हैं और समाधान के 200 माइक्रोलीटर इंजेक्ट करती हैं।
प्रयोग की अवधि के लिए एक बार दैनिक एंटीबायोटिक कॉकटेल प्रशासन। वैकल्पिक रूप से पीने के पानी के माध्यम से एंटीबायोटिक दवाओं के प्रशासन के लिए, तकनीकी प्रोटोकॉल में वर्णित एंटीबायोटिक दवाओं का एक कॉकटेल तैयार करते हैं । एंटीबायोटिक मिश्रण में स्वीटनर को शामिल करना महत्वपूर्ण है क्योंकि यह चूहों को निर्जलीकरण को रोकने के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है।
प्रति बोतल लगभग 100 मिलीलीटर पर एक पानी की बोतल में एंटीबायोटिक कॉकटेल भरें। एक माउस पिंजरे में प्रकाश और जगह से बोतल की रक्षा करें। प्रयोग की अवधि के लिए सप्ताह में दो बार ताजा स्टॉक के साथ एंटीबायोटिक कॉकटेल की जगह ।
चूहों के वजन और सामान्य स्वास्थ्य स्थिति की सावधानीपूर्वक निगरानी एंटीबायोटिक प्रशासन में दैनिक रूप से पूर्वतक की जानी चाहिए। नमूना संग्रह के लिए दो मिलीलीटर ऑटोक्लेव ट्यूबों का वजन और लेबल करें। ताजा मल के नमूनों के संग्रह के लिए प्रत्येक माउस को निरोधक में रखें।
फिर एक संग्रह ट्यूब में गुदा से सीधे मल छर्रों को इकट्ठा करें। तकनीकी प्रोटोकॉल में वर्णित इच्छामृत्यु प्रदर्शन करने के बाद पेट के साथ एक माउस शव पूरी तरह से उजागर करें और पेट के क्षेत्र को 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें। निष्फल संदंश और कैंची का उपयोग किसी भी आंतरिक ऊतकों को नुकसान पहुंचाए बिना peratenium का पर्दाफाश करने के लिए पेट में एक विपरीत चीरा बनाते हैं।
पेरिटनियम उठाएं और आंतों को बेनकाब करने के लिए एक चीरा बनाएं। आंतों को संदंश और कैंची से निकालकर स्टरल पेट्री डिश में रखें। छोटी आंत को मेसेंटेरिक धमनियों और वसा से दूर चिढ़ाने के लिए संदंश का सावधानीपूर्वक उपयोग करें।
आंत का विस्तार करें और इसे एक साफ लैब वाइप पर रखें। एक शासक उपाय के साथ और छोटी आंत के डिस्टल इलियम के चार सेंटीमीटर काट लें। आंत के एक सेंटीमीटर को सीकम में काटें और त्यागें।
इलियम लेफ्ट का तीन सेंटीमीटर हिस्सा होगा जिसका इस्तेमाल आंतों के बैक्टीरिया को इकट्ठा करने के लिए किया जाएगा । एक दो मिलीलीटर बाँझ ट्यूब पर ileum भाग पकड़ो। आंत को सीधे बाहर निकालकर और ट्यूब में नमूना एकत्र करके आंतों की सामग्री एकत्र करें।
इस सैंपल में इलियम कंटेंट से बैक्टीरिया होंगे। कोल्ड फॉस्फेट बफर खारा के साथ एक 20 मिलीलीटर सिरिंज तैयार करें और प्रवाह को त्यागने वाले इलियम भाग को फ्लश करें। एक बाँझ पेट्री डिश पर ileum भाग रखें और कैंची के साथ इसे देशांतर खोलें।
एक स्केलपेल के साथ इलियम दीवार के अंदर परिमार्जन। एक साफ अपकेंद्रित्र ट्यूब पर पीबीएस के एक मिलीलीटर के साथ इसे धोकर स्केलपेल पर किसी भी बैक्टीरिया को इकट्ठा करें। बैक्टीरिया को गोली मारने के लिए पांच मिनट के लिए आठ हजार बार जी पर स्पिन करें।
अपकेंद्री के बाद सुपरनैंट त्यागें। इस सैंपल में इलियम वॉल से बैक्टीरिया होंगे। मल और इलियम से नमूनों वाली ट्यूबों का वजन करें।
प्रत्येक नमूने में मल वजन प्राप्त करने के लिए खाली ट्यूबों से वजन घटाना। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करके मल, इलियम सामग्री और इलियम दीवार के नमूनों से बैक्टीरियल डीएनए निकालें। उपयोग होने तक डीएनए नमूनों को शून्य से 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
बर्फ पर एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट से क्यूपीसीआर मानक, मल नमूना डीएनए और क्यूपीसीआर रिएजेंट्स को पिघलाएं। बाँझ डीएनए मुक्त पानी में मानक को पतला करने के लिए एक सीमा में 10 से सात से 10 माइक्रोलीटर प्रति दो प्रतियां । मल नमूना डीएनए को एक आधा, एक पांचवां और एक दसवां सांद्रता को पतला करें।
फिर प्रतिक्रियाओं की कुल संख्या के लिए एक मास्टर मिश्रण प्रतिक्रिया करें। मास्टर मिक्स के 30 माइक्रोलीटर और टेम्पलेट के 5 माइक्रोलीटर मिलाएं, जो नकारात्मक नियंत्रण के लिए या तो मानक, नमूना या पानी है। फिर 384 अच्छी तरह से ऑप्टिकल क्यूपीसीआर प्लेट में प्रत्येक कुएं में इस मिश्रण के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें।
ट्रिपलीकेट में प्रत्येक प्रतिक्रिया करें। क्यूपीसीआर प्लेट और सेंट्रलाइज को संक्षेप में सील करें। फिर क्यूपीसीआर मशीन पर प्लेट लोड करें जिसे तकनीकी प्रोटोकॉल में सूचीबद्ध के रूप में प्रोग्राम किया जाता है।
अंत में मल नमूनों के लिए 16S rDNA कॉपी संख्या की गणना से पहले मानक और नमूनों के लिए चक्र दहलीज मूल्यों को प्राप्त करें । प्रतिनिधि परिणाम मौखिक गैवेज द्वारा या पीने के पानी के माध्यम से एंटीबायोटिक दवाओं के प्रशासन के बाद चूहों में वजन घटाने दिखाते हैं। मौखिक गैवेज द्वारा एंटीबायोटिक दवाओं को प्राप्त करने वाले चूहों में कोई ध्यान देने योग्य वजन घटाने का पता नहीं चला है।
जब चूहों को पीने के पानी में एंटीबायोटिक दवाओं के साथ इलाज किया जाता है तो वे उपचार के पहले कुछ दिनों के भीतर अपने शरीर के वजन का लगभग 10% ढीला करते हैं लेकिन उसके बाद सामान्य वजन प्राप्त करते हैं। मल के नमूनों में बैक्टीरिया के मात्राकरण के लिए क्यूपीसीआर में प्राप्त सी-टी मूल्यों बनाम मानक के लिए कॉपी नंबर के लॉगरिथम की साजिश रचने से प्राप्त मानक वक्र के उपयोग की आवश्यकता होती है। रैखिक सीमा के भीतर प्रतिगमन विश्लेषण समीकरण मल नमूनों के भीतर 16S rDNA बहुतायत के मात्राकरण सक्षम बनाता है।
जैसा कि मल, छोटी आंत की सामग्री और छोटी आंत की दीवार के नमूनों के लिए यहां दिखाया गया है। मौखिक एंटीबायोटिक प्रशासन के पांच या 10 दिनों के बाद एंटीबायोटिक इलाज चूहों से मल के नमूनों में बैक्टीरिया के घनत्व में एक मजबूत कमी है । हालांकि एंटीबायोटिक प्रशासन के एक सप्ताह बाद सामान्य स्तर तक बरामद मल में बैक्टीरिया का घनत्व बंद हो गया है ।
पीने के पानी में एंटीबायोटिक दवाओं के मौखिक गैवेज और प्रशासन दोनों इलाज चूहों में मल जीवाणु भार को संक्षेप में कम करते हैं। शोधकर्ताओं ने व्यक्तिगत विधि है कि बेहतर प्रयोगात्मक आवश्यकताओं जैसे उपचार की लंबाई के रूप में कारकों पर विचार फिट बैठता है का चयन करें । बैक्टीरिया की मात्रा के लिए क्यूपीसीआर विधि को विशिष्ट प्राइमर का उपयोग करके व्यक्तिगत बैक्टीरियल टैक्सा की मात्रा निर्धारित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है।
इससे माइक्रोबायोम साइज और कंपोजीशन के बारे में मात्रात्मक और गुणकारी दोनों तरह की जानकारी मिलेगी।
यहाँ हम चूहों के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के मौखिक प्रशासन के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान, मल के नमूनों का संग्रह, डीएनए निष्कर्षण और qPCR द्वारा मल बैक्टीरिया की ठहराव.
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