Polimerase quantitativos baseados na reação em cadeia análises de murino Microbiota Intestinal após o tratamento antibiótico Oral

Este protocolo fornece um método confiável para quantificar as alterações é a microbiota intestinal de camundongos após a administração de antibióticos orais. Isso pode ajudar a pesquisar sobre interações de microbiota cruzada fornecendo insights sobre as patologias associadas à disbiose microbiana, como a doença inflamatória intestinal. A principal vantagem desses regimes de tratamento de antibióticos é que eles previnem a perda de peso característica normalmente associada à administração de antibióticos orais aos camundongos.

Para pré-formar o tratamento com antibióticos através de gavage oral prepare um coquetel de antibióticos misturando soluções de estoque que foram preparadas como descrito no protocolo técnico. Para um volume de mililitros misturam 50 microliters de ampicilina, 50 microliters de gentamicina, 50 microliters de neomicina, 500 microliters de metronidazole, 25 microliters de vancomicina e 325 microliters de água. Carregue a mistura de antibióticos em uma seringa de um mililitro, eliminando quaisquer bolhas e conecte uma agulha de gavage de gálada apropriada.

Pegue a pele sobre o ombro do rato firmemente e estique a cabeça e o pescoço para endireitar o esôfago. Direcione a ponta da bola da agulha de alimentação ao longo do céu da boca e para a parte de trás da faringe. Em seguida, passe-o suavemente para o esôfago e injete os 200 microliters de solução.

Administre o coquetel antibiótico uma vez por dia durante o experimento. Alternativamente para administrar antibióticos através da água potável, prepare um coquetel de antibióticos como descrito no protocolo técnico. É importante incluir adoçante na mistura de antibióticos, pois este é um fator crucial para evitar a desidratação dos camundongos.

Encha o coquetel antibiótico em uma garrafa de água a aproximadamente 100 mililitros por garrafa. Proteja a garrafa da luz e coloque em uma gaiola de rato. Substitua o coquetel antibiótico por estoque fresco duas vezes por semana durante a duração do experimento.

O monitoramento cuidadoso do peso dos camundongos e o estado geral de saúde devem ser pré-formados diariamente durante toda a administração de antibióticos. Pesar e rotular dois tubos de autoclave mililitro para coleta de amostras. Para a coleta de amostras de fezes frescas coloque cada rato em um contidor.

Em seguida, colete pelotas fecais diretamente do ânus em um tubo de coleta. Após a realização da eutanásia, conforme descrito no protocolo técnico, havia uma carcaça de rato com o abdômen totalmente exposta e pulverizar a área abdominal com 70% de etanol. O uso de fórceps esterilizados e tesouras fazem uma incisão transversal no abdômen para expor o peratenium sem danificar nenhum tecido interno.

Levante o peratenium e faça uma incisão para expor os intestinos. Remova os intestinos com as fórceps e a tesoura e coloque-o em uma placa de Petri estéril. Use cuidadosamente fórceps para provocar o intestino delgado longe das artérias mesentéricas e gordura.

Estenda o intestino e coloque-o em uma limpeza de laboratório limpa. Com uma medida de régua e corte quatro centímetros do íleo distal do intestino delgado. Corte e descarte o centímetro do intestino proximal ao ceco.

Restará uma porção de três centímetros de íleo que será usada para coletar bactérias intestinais. Segure a porção de ímuo sobre um tubo estéril de dois mililitros. Colete o conteúdo intestinal extrudando diretamente o intestino e coletando a amostra no tubo.

Esta amostra terá bactérias do conteúdo de íleo. Prepare uma seringa de 20 mililitros com soro fisátil tamponado de fosfato frio e lave a porção de íleo descartando o fluxo. Coloque a porção de ímuto em uma placa de Petri estéril e abra-a longitudinalmente com uma tesoura.

Raspe o interior da parede do íleo com um bisturi. Colete qualquer bactéria no bisturi lavando-a com um mililitro de PBS sobre um tubo de centrífuga limpo. Gire a oito mil vezes G por cinco minutos para pelotar as bactérias.

Após a centrifugação descartar o supernante. Esta amostra conterá bactérias da parede do íleo. Pese os tubos contendo as amostras de fezes e íleo.

Subtraia o peso dos tubos vazios para obter o peso fecal em cada amostra. Extrair DNA bacteriano de fezes, conteúdo de íleo e amostras de parede de íleo usando kits disponíveis comercialmente. Armazene as amostras de DNA a menos 20 graus Celsius até usar.

Descongele o padrão qPCR, DNA de amostra fecal e reagentes qPCR de um kit comercialmente disponível no gelo. Diluir o padrão em água livre de DNA estéril em uma faixa de 10 a 7 a 10 até as duas cópias por microliter. Diluir o DNA da amostra fecal para metade, um quinto e um décimo de concentrações.

Em seguida, faça uma reação de mixagem mestre para o número total das reações mais uma. Misture 30 microliters da mistura mestre e 5 microliters do modelo, que é o padrão, amostra ou água para o controle negativo. Em seguida, adicione 10 microliters deste mix a cada poço em uma placa qPCR 384 bem óptica.

Realize cada reação em triplicado. Sele brevemente a placa qPCR e centrífuga. Em seguida, carregue a placa na máquina qPCR que está programada como listada no protocolo técnico.

Finalmente obtenha os valores do limiar de ciclo para o padrão e amostras antes de calcular os números de cópia 16S rDNA para amostras fecais. Os resultados representativos mostram perda de peso em camundongos após a administração de antibióticos por gavage oral ou através da água potável. Nenhuma perda de peso perceptível é detectada em camundongos que recebem antibióticos por gavage oral.

Quando os camundongos são tratados com antibióticos na água potável, eles perdem cerca de 10% de seu peso corporal nos primeiros dias de tratamento, mas recuperam o ganho normal de peso posteriormente. A quantificação de bactérias em amostras fecais requer o uso de uma curva padrão obtida pelo plotagem do logaritmo do número da cópia para o padrão versus os valores C-T obtidos no qPCR. Dentro da faixa linear, a equação de análise de regressão permite quantificação da abundância de rDNA 16S dentro das amostras fecais.

Como mostrado aqui para fezes, conteúdo de intestino delgado e amostras de parede de intestino delgado. Após cinco ou dez dias de administração de antibióticos orais, há uma forte diminuição na densidade de bactérias em amostras de fezes de camundongos tratados com antibióticos. No entanto, a densidade de bactérias nas fezes se recuperou para níveis normais uma semana após a administração de antibióticos ser interrompida.

Tanto o gavage oral quanto a administração de antibióticos na água potável diminuem brevemente a carga bacteriana fecal em camundongos tratados. Pesquisadores que selecionam o método individual que melhor se encaixa nos requisitos experimentais considerando fatores como a duração do tratamento. O método qPCR para quantificação de bactérias pode ser modificado para quantificar a taxa bacteriana individual usando primers específicos.

Isso fornecerá informações quantitativas e qualitivas sobre o tamanho e a composição do microbioma.