Name: unraveling key players of humoral immunity: advanced and optimized lymphocyte isolation protocol from murine peyer's patches
Uploaded: 2018-11-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Unraveling Key Players of Humoral Immunity: Advanced and Optimized Lymphocyte Isolation Protocol from Murine Peyer's Patches at JoVE.com

Wij wil Laura Strauss en Peter Sage dank voor nuttige discussies en steunen met stroom cytometry analyses.

Alle studies en experimenten beschreven in dit protocol werden uitgevoerd onder richtlijnen volgens institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van Beth Israël diaken Medical Center.
1. de ontwerpen van experimentele opstelling en muis groepen
<ol><li>(Optioneel) Samen het huis van de experimentele muizen om horizontale overdracht van darmflora tussen experimentele muizen en om niet-specifieke variabiliteit binnen PP lymfocyten. Daarnaast gebruiken littermate besturingselementen v...

<ol>
	<li>van den Berg, T. K., van der Schoot, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+&#8216;self&#8217;+recognition:+a+role+for+CD47-SIRP&#945;+interactions+in+hematopoietic+stem+cell+transplantation.">Innate immune &#8216;self&#8217; recognition: a role for CD47-SIRP&#945; interactions in hematopoietic stem cell transplantation.</a> Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).</li><li>Mowat, A. M., Agace, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+specialization+within+the+intestinal+immune+system.">Regional specialization within the intestinal immune system.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).</li><li>Reboldi, A., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peyer&#8217;s+patches:+Organizing+B-cell+responses+at+the+intestinal+frontier.">Peyer&#8217;s patches: Organizing B-cell responses at the intestinal frontier.</a> Immunological Reviews. 271 (1), 230-245 (2016).</li><li>Heel, K. A., McCauley, R. D., Papadimitriou, J. M., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+Peyer&#8217;s+patches.">Review: Peyer&#8217;s patches.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 12 (2), 122-136 (1997).</li><li>Fagarasan, S., Kinoshita, K., Muramatsu, M., Ikuta, K., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+class+switching+and+differentiation+to+IgA-producing+cells+in+the+gut+lamina+propria.">In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria.</a> Nature. 413 (6856), 639-643 (2001).</li><li>Hopkins, S. A., Niedergang, F., Corthesy-Theulaz, I. E., Kraehenbuhl, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recombinant+Salmonella+typhimurium+vaccine+strain+is+taken+up+and+survives+within+murine+Peyer&#8217;s+patch+dendritic+cells.">A recombinant Salmonella typhimurium vaccine strain is taken up and survives within murine Peyer&#8217;s patch dendritic cells.</a> Cellular Microbiology. 2 (1), 59-68 (2000).</li><li>Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholera+toxin+induces+migration+of+dendritic+cells+from+the+subepithelial+dome+region+to+T-+and+B-cell+areas+of+Peyer's+patches.">Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer's patches.</a> Infection and Immunity. 71 (1), 504-509 (2003).</li><li>Sato, A., Iwasaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peyer&#8217;s+patch+dendritic+cells+as+regulators+of+mucosal+adaptive+immunity.">Peyer&#8217;s patch dendritic cells as regulators of mucosal adaptive immunity.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1333-1338 (2005).</li><li>Bemark, M., Boysen, P., Lycke, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+gut+IgA+production+through+T+cell-dependent+and+T+cell-independent+pathways.">Induction of gut IgA production through T cell-dependent and T cell-independent pathways.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1247 (1), 97-116 (2012).</li><li>Fagarasan, S., Kawamoto, S., Kanagawa, O., Suzuki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+Immune+Regulation+in+the+Gut:+T+Cell-Dependent+and+T+Cell-Independent+IgA+Synthesis.">Adaptive Immune Regulation in the Gut: T Cell-Dependent and T Cell-Independent IgA Synthesis.</a> Annual Review of Immunology. 28, 243-273 (2010).</li><li>Hase, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+through+glycoprotein+2+of+FimH+++bacteria+by+M+cells+initiates+mucosal+immune+response.">Uptake through glycoprotein 2 of FimH + bacteria by M cells initiates mucosal immune response.</a> Nature. 462 (7270), 226-230 (2009).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Inhibitory+Role+for+the+Transcription+Factor+Stat3+in+Controlling+IL-4+and+Bcl6+Expression+in+Follicular+Helper+T+Cells.">An Inhibitory Role for the Transcription Factor Stat3 in Controlling IL-4 and Bcl6 Expression in Follicular Helper T Cells.</a> Journal of Immunology. 195 (5), 2080-2089 (2015).</li><li>Vinuesa, C. G., Tangye, S. G., Moser, B., Mackay, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+B+helper+T+cells+in+antibody+responses+and+autoimmunity.">Follicular B helper T cells in antibody responses and autoimmunity.</a> Nature Reviews Immunology. 5 (11), 853-865 (2005).</li><li>Victora, G. D., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germinal+Centers.">Germinal Centers.</a> Annual Review of Immunology. 30, 429-457 (2012).</li><li>Vaeth, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Store-Operated+Ca2+Entry+in+Follicular+T+Cells+Controls+Humoral+Immune+Responses+and+Autoimmunity.">Store-Operated Ca2+Entry in Follicular T Cells Controls Humoral Immune Responses and Autoimmunity.</a> Immunity. 44 (6), 1350-1364 (2016).</li><li>Meli, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Integrin+LFA-1+Controls+T+Follicular+Helper+Cell+Generation+and+Maintenance.">The Integrin LFA-1 Controls T Follicular Helper Cell Generation and Maintenance.</a> Immunity. 45 (4), 831-846 (2016).</li><li>Fu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+in+T+follicular+regulatory+cells+promotes+autoimmunity.">Deficiency in T follicular regulatory cells promotes autoimmunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 815-825 (2018).</li><li>Esp&#233;li, M., Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> T follicular helper cells - Methods and Protocols. , (2015).</li><li>Couter, C. J., Surana, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Flow+Cytometric+Characterization+of+Murine+Small+Intestinal+Lymphocytes.">Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes.</a> Journal of Visual Experiments. (111), e54114 (2016).</li><li>De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+And+Immunostaining+Lymphocytes+and+Dendritic+Cells+from+Murine+Peyer&#8217;s+Patches.">Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer&#8217;s Patches.</a> Journal of Visual Experiments. (73), e50167 (2013).</li><li>Pastori, C., Lopalco, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+in+vitro+Activation+of+Mouse+Peyer&#8217;s+Patch+Cells+from+Small+Intestine+Tissue.">Isolation and in vitro Activation of Mouse Peyer&#8217;s Patch Cells from Small Intestine Tissue.</a> Bio-protocol. 4 (21), e1282 (2014).</li><li>Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+Mouse+Ligated+Peyer&#8217;s+Patch+Intestinal+Loop+Assay+to+Evaluate+Bacterial+Uptake+by+M+cells.">Application of a Mouse Ligated Peyer&#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells.</a> Journal of Visual Experiments. (58), 3225 (2011).</li><li>Naito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germinal+Center+Marker+GL7+Probes+Activation-Dependent+Repression+of+N-Glycolylneuraminic+Acid,+a+Sialic+Acid+Species+Involved+in+the+Negative+Modulation+of+B-Cell+Activation.">Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (8), 3008-3022 (2007).</li><li>Bollig, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+{IRF4}+determines+germinal+center+formation+through+follicular+T-helper+cell+differentiation.">Transcription factor {IRF4} determines germinal center formation through follicular T-helper cell differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Science of U. S. A. 109 (22), 8664-8669 (2012).</li><li>P&#233;rez-Mazliah, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+Helper+T+Cells+are+Essential+for+the+Elimination+of+Plasmodium+Infection.">Follicular Helper T Cells are Essential for the Elimination of Plasmodium Infection.</a> EBioMedicine. 24, 216-230 (2017).</li><li>Sage, P. T., Sharpe, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+follicular+regulatory+cells+in+the+regulation+of+B+cell+responses.">T follicular regulatory cells in the regulation of B cell responses.</a> Trends Immunology. 36 (7), 410-418 (2015).</li><li>Van Damme, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+agents+and+enzymes+used+for+the+extraction+of+gut+lymphocytes+influence+flow+cytometric+detection+of+T+cell+surface+markers.">Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers.</a> Journal of Immunological Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).</li><li>Meenan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+expression+of+alpha+4+beta+7,+a+gut+homing+integrin,+by+circulating+and+mucosal+T+cells+in+colonic+mucosal+inflammation.">Altered expression of alpha 4 beta 7, a gut homing integrin, by circulating and mucosal T cells in colonic mucosal inflammation.</a> Gut. 40 (2), 241-246 (1997).</li><li>Cao, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+(IL)+-21+promotes+intestinal+IgA+response+to+microbiota.">Interleukin (IL) -21 promotes intestinal IgA response to microbiota.</a> Mucosal Immunology. 8 (5), 1072-1082 (2015).</li><li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+enforces+functional+integrity+of+regulatory+T+cells+by+coupling+environmental+cues+and+metabolic+homeostasis.">Autophagy enforces functional integrity of regulatory T cells by coupling environmental cues and metabolic homeostasis.</a> Nature Immunology. 17 (3), 277-285 (2016).</li><li>Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+enzymatic+tissue+disintegration+on+the+level+of+surface+molecule+expression+and+immune+cell+function.">Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function.</a> European Journal of Microbiology &amp; Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).</li><li>Trapecar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Optimized+and+Validated+Method+for+Isolation+and+Characterization+of+Lymphocytes+from+HIV++Human+Gut+Biopsies.">An Optimized and Validated Method for Isolation and Characterization of Lymphocytes from HIV+ Human Gut Biopsies.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. 33 (S1), (2017).</li><li>Bergqvist, P., Gardby, E., Stensson, A., Bemark, M., Lycke, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+IgA+Class+Switch+Recombination+in+the+Absence+of+CD40+Does+Not+Occur+in+the+Lamina+Propria+and+Is+Independent+of+Germinal+Centers.">Gut IgA Class Switch Recombination in the Absence of CD40 Does Not Occur in the Lamina Propria and Is Independent of Germinal Centers.</a> Journal of Immunology. 177 (11), 7772-7783 (2006).</li><li>Keil, B., Gilles, A. M., Lecroisey, A., Hurion, N., Tong, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+collagenase+from+Achromobacter+iophagus.">Specificity of collagenase from Achromobacter iophagus.</a> FEBS Letters. 56 (2), 292-296 (1975).</li><li>Mora, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imprinting+of+gut-homing+T+cells+by+Peyer&#8217;s+patch+dendritic+cells.">Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer&#8217;s patch dendritic cells.</a> Nature. 424 (6944), 88-93 (2003).</li><li>Reboldi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+immunology:+IgA+production+requires+B+cell+interaction+with+subepithelial+dendritic+cells+in+Peyer&#8217;s+patches.">Mucosal immunology: IgA production requires B cell interaction with subepithelial dendritic cells in Peyer&#8217;s patches.</a> Science. 352 (6287), (2016).</li></ol>

Hier beschrijven we een protocol dat is geoptimaliseerd voor de karakterisering van het cytometrische van de stroom van TFH en GC B cellen. Een van de grote voordelen van onze protocol is dat hierdoor het isolement van maximaal 107 (gemiddeld 4-5 x 106 cellen) totale PP cellen uit een enkele muis (C57BL/6-stam) zonder enige spijsvertering proces. We hebben vastgesteld dat de cel Totaal opbrengst was positief gecorreleerd met het aantal PPs en van de volgende eenvoudige vergelijking die nuttig is voo...

Het hele maagdarmkanaal vanaf het begin tot het einde is versierd met een uitgebreid lymfoïde netwerk dat immune cellen meer dan enig andere orgel in mens en muis1 bevat. Peyer de patches (KKS) vormen een belangrijk onderdeel van de intestinale tak van deze cellulaire immuun organisatie, zogenaamde gut-geassocieerde lymfoïde weefsel (GALT)2,3. Binnen PPs, duizenden miljoenen antigenen afgeleid van dieet materialen, commensale microbiota en pathogenen worden continu bemonsterd en wanneer nodig passende immuunrespons naar hen zijn gemonteerd dus handhaving intestinale immuun homeostase. In die zin kunnen de KKS worden genoemd als "amandelen van de dunne darm". KKS bestaan uit grote sub compartimenten: subepithelial koepel (SED), grote B-cel follikel zones; de bovenliggende follikel-geassocieerde epitheel (FAE) en de interfollicular regio (IFR) waar T-cellen gelegen4 zijn. Deze unieke compartimentering van PPs maakt het mogelijk verschillende effector cel deelverzamelingen om samen te werken, verleent dus immunocompetence in de darm.
KKS ontbreken afferent lymfatische, en vanwege deze reden niet antigenen vervoerd naar PPs van de dunne darm worden uitgevoerd via de lymfevaten in tegenstelling tot de meeste van de andere lymfoïde organen. In plaats daarvan, gespecialiseerde epitheliale cellen gelegen in FAE, zogenaamde M-cellen, zijn verantwoordelijk voor de overdracht van luminal antigenen in de KKS-5. Vervolgens, de vervoerde hoeveelheden antigenen worden opgepikt door de dendritische cellen (DC's) en fagocyten die zich in de regio subepithelial koepel (SED) onder de FAE6,7 bevinden. Dit proces antigeen sorteren door DCs in de PP is cruciaal voor het initiëren van de aanpassings immune reactie8 en latere generaties van IgA dat cellen9.
Als gevolg van de zware last die antigene commensale flora en dieet materiaal, KKS host endogeen geactiveerd effector T en B-cel deelverzamelingen in grote abundanties zoals TFH en IgA+ GC B cellen10, suggereren dat PPs een site van actieve immune vertegenwoordigen antwoord11. Detectie van tot 20-25% TFH cellen binnen de totale CD4+ T cel compartiment en tot 10-15% GC B binnen totaal aantal B-cellen cellen is mogelijk in KKS verzameld van unimmunized jonge C57BL/6 muizen12. In tegenstelling tot de soorten van andere T-helper cellen (dwz., Th1, Th2, Th17 cellen), TFH cellen Toon unieke tropisme in B-cel follikels voornamelijk ten gevolge van CXCR5 expressie, die TFH cel homing langs CXCL13 kleurovergang13 bevordert. In de B-cel follikel zones van PPs induceren TFH cellen IgA klasse schakelaar recombinatie en somatische hypermutation in geactiveerde B-cellen waaruit hoge-affiniteit IgA producerende cellen14 onderscheiden. Vervolgens deze plasmacellen antilichaam-afscheidende migreren naar de lamina propria (LP) en immuun homeostase in de darm10regelen.
Identificatie en karakterisering van TFH en GC B-cel populaties binnen PPs onderzoekers te onderzoeken van de dynamiek van de humorale immuunreacties onder steady-state omstandigheden zonder de behoefte aan tijdrovende immunisatie modellen in staat kunnen stellen traditioneel gebruikt in TFH-GC B cel studies15,16,17,18. Analyseren van TFH cellen binnen PPs is niet zo eenvoudig als andere cel subsets. Technische uitdagingen omvatten ideale weefsel voorbereiding voorwaarden, oppervlakte antilichaam-marker combinatie, identificeren, alsmede passende positieve en negatieve controles selecteren. Zowel TFH en PP onderzoeksgebieden vertonen grote variabiliteit in termen van de experimentele procedures en zijn verre van overdracht van een consensus om gestandaardiseerde protocollen als gevolg van verschillende redenen. Ten eerste neiging elke deelverzameling van de cel binnen PPs om differentieel door weefsel voorbereiding factoren vereisen verdere wijzigingen in een cel deelverzameling-specifieke manier worden beïnvloed. Ten tweede, is er een significante discrepantie tussen de gerapporteerde methoden met betrekking tot de details voor cel bereiding op basis van PPs. derde, het aantal protocol gebaseerde vergelijkende studies onderzoeken ideaal weefsel voorbereiding technieken en proefomstandigheden voor PP en TFH is onderzoek vrij beperkt.
Huidige protocol gebaseerde studies voorgesteld voor PP cel voorbereiding19,20,21,22 waren niet TFH- of GC B-cel-georiënteerd. Bovendien, sommige weefsel voorbereiding voorwaarden aanbevolen voor PPs19,20 zoals collagenase gebaseerde spijsvertering bleken de uitkomst van TFH identificatie negatief beïnvloeden door stroom cytometry18. Op deze basis redeneerde wij dat een geoptimaliseerde, gestandaardiseerde en reproduceerbare protocol dat kan worden gebruikt voor het bestuderen van TFH en GC B cel dynamiek binnen PPs zou waardevol zijn onderzoekers bezig met dit onderwerp. Deze behoefte gaf ons de impuls voor het genereren van een verbeterde en bijgewerkte protocol voor de isolatie en de karakterisering van PP lymfocyten die fijn is geoptimaliseerd voor cellulaire herstel, levensvatbaarheid en efficiëntie voor de karakterisering van het cytometrische van de stroom van verschillende T en B deelverzamelingen van de cel. We wilde ook uitsluiten van de verschillende stappen van de moeizame voorbereiding voorgesteld in eerdere protocollen, daardoor, vermindering van de vereiste manipulaties en tijd voor de voorbereiding van de weefsels en cellen van PPs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD4 antibody</td>
			<td>eBioscience, Biolegend*</td>
			<td>17-0041-81 ,10054*</td>
			<td>For detailed information see Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD19 antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>MA5-16536</td>
			<td>For detailed information see Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse PD-1 antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>61-9985-82</td>
			<td>For detailed information see Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse ICOS antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-9942-82</td>
			<td>For detailed information see Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse GL7 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>144610</td>
			<td>For detailed information see Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CXCR5 antibody</td>
			<td>Biolegend*, BD Bioscience</td>
			<td>145512*, 551960</td>
			<td>For detailed information see Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse BCL-6 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>358512</td>
			<td>For detailed information see Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse Foxp3 antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-5773-82</td>
			<td>For detailed information see Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-BV421</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>563259</td>
			<td>For detailed information see Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FixableViability Dye</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>L34957</td>
			<td>For detailed information see Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7AAD</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420404</td>
			<td>For detailed information see Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcBlock (CD16/32)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553141</td>
			<td>For detailed information see Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-5523-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well,12-well &#38; 96-well plates</td>
			<td>Falcon/Corning</td>
			<td>353046,353043/3596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml syringe-plunger</td>
			<td>Exel INT</td>
			<td>26265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Model 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved-end scissor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Serrated Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small curved scissor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

unraveling key players of humoral immunity: advanced and optimized lymphocyte isolation protocol from murine peyer's patches

In de mucosa van de darm vormen immune cellen een unieke immunologische entiteit, die, immuun tolerantie stimuleert terwijl gelijktijdig overdracht van het immuunsysteem verdediging tegen ziekteverwekkers. Het is reeds lang gevestigd dat Peyer van patches (KKS) een essentiële rol in de mucosal immune netwerk hebben door het hosten van verschillende effector T en B-cel subsets. Een bepaalde fractie van deze effector cellen, folliculaire T-helper (TFH) en germinal center (GC) B-cellen worden geprofessionaliseerd in de regulering van de Humorale immuniteit. Vandaar, omvat de karakterisering van deze deelverzamelingen van de cel binnen PPs in termen van hun differentiatie programma en functionele eigenschappen kan leveren belangrijke informatie over mucosale immuniteit. Daartoe zou een eenvoudig toepassing, efficiënte en reproduceerbare methode van lymfocyt isolatie van PPs waardevol voor onderzoekers. In deze studie, we gericht op het genereren van een effectieve methode om te isoleren van lymfocyten van muis PPs met hoge cel opbrengst. Onze aanpak bleek dat eerste weefsel verwerking zoals het gebruik van spijsvertering reagentia en weefsel agitatie, evenals cel kleuring voorwaarden en selectie van antilichaam panelen, grote invloed hebben op de kwaliteit en de identiteit van de geïsoleerde lymfocyten en op experimentele resultaten.
Hier beschrijven we een protocol waarmee onderzoekers efficiënt isoleren lymfocyt populaties van PPs waardoor reproduceerbare stroom cytometry gebaseerde beoordeling van T en B-cel subsets voornamelijk gericht op TFH en GC B cel subsets.

In tegenstelling tot een vorige protocol20, wij hebben geconstateerd dat PPs niet gelijkelijk zijn verdeeld in de SI maar meer dichtbevolkte zijn gelokaliseerd aan de uiteinden van het distale en proximale van de SI zoals in figuur 1A. Stroom cytometrische analyse toonde aan dat, indien correct gevolgd, ons protocol geeft een PP lymfocyten bevolking waaruit naar voren-naast scatter distributie vergeli...

Watch this Scientific Journal Video about Unraveling Key Players of Humoral Immunity: Advanced and Optimized Lymphocyte Isolation Protocol from Murine Peyer's Patches at JoVE.com

Unraveling Key Players of Humoral Immunity: Advanced and Optimized Lymphocyte Isolation Protocol from Murine Peyer's Patches

Ontrafeling van de hoofdrolspelers van de Humorale immuniteit: geavanceerde en geoptimaliseerd lymfocyt isolatie Protocol van RattenUitrustingen Peyer van Patches

In deze studie presenteren we een roman en effectieve protocol voor de isolatie van lymfocyten van Peyer van Patches (PPs), die vervolgens kunnen worden gebruikt voor in vivo en in vitro Functionele assays evenals stroom cytometrische studies van folliculaire T helper en germinal center B cellen.

In the gut mucosa, immune cells constitute a unique immunological entity, which promotes immune tolerance while concurrently conferring immune defense ...

Deze methode kan belangrijke vragen beantwoorden over het fenotype van de patch van Muis Peyer geïsoleerd T- en B-celsubsets. In het bijzonder, folliculaire T helper en kiedel centrum B cel populaties. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het afziet van verschillende moeizame voorbereidingsstappen zoals collagenase gebaseerde spijsvertering die de kwaliteit en identiteit van de geïsoleerde lymfocyten in gevaar brengen.Begin met het plaatsen van een muis in de supine positie en steriliseren van de buik met 70%ethanol. Maak een middellijn buikincisie door de huid en buikvlies van de schaambeen naar de ribbenkast om de peritineale holte te openen en het cecum en de ileocecale verbinding te lokaliseren. Maak zo distaal mogelijk gesneden op de kruising om de dunne darm te scheiden van de cecum.Snijd het mesenterie met een schaar om de hele dunne darm voorzichtig te verwijderen tot aan de pylorische sluitspier. Knip de verbinding tussen de pylorus en de twaalfvingerige darm volledig los om de dunne darm volledig los te maken van de buikholte en plaats de geïsoleerde dunne darm in een put van een 6-bron plaat met koud RPMI-medium aangevuld met 10%foetaal runderserum, of FBS, op ijs. Vervolgens, voorzichtig roeren de weefsels handmatig totdat alle segmenten worden ondergedompeld in het koude medium.Wanneer alle darmen zijn geoogst, gebruik tangen om het mesenterische vet van een rand van de darm te grijpen en het monster, mesenterische kant naar beneden, op een papieren handdoek te plaatsen. Bevochtig het hele darmsegment met RPMI 10%FBS om weefseluitdroging en kleverigheid te voorkomen en de patches van de Peyer te lokaliseren, die verschijnen als witte multilobulated aggregaten met een bloemkoolachtige vorm aan de anti-mesenterische kant van de darmwand. Om de peyer patches te oogsten, gebruik maken van gebogen chirurgische schaar met de curve naar boven gericht om zachtjes accijnzen elke patch van zijn distale en proximale grenzen, het verzorgen van de omliggende darmweefsel uit te sluiten, en plaats de Peyer patches in individuele putten van een 12-well plaat met ijskoude RPMI 10% FBS op ijs als ze worden verzameld.Wanneer alle patches zijn verworven, gebruik een schaar om de punt van een 1 millimeter micro pipette tip te snijden, zodat de diameter groot genoeg is om individuele Peyer's patches aan te trekken en de Peyer's patches over te brengen in 150 millimeter conische buizen per muis met 25 milliliter van 37 graden Celsius RPMI 10%FBS. Plaats de buis vervolgens in een orbitale shaker op 37 graden Celsius met continue agitatie bij 125-150 RPM gedurende 10 minuten. Breng aan het einde van de agitatie de pleisters van de Peyer over op 140 micrometercelzeef per muis en gebruik het rubberen uiteinde van een spuitzuiger van 10 milliliter per dier om de proeiers van de Peyer voorzichtig door het gaas te verstoren in individuele 50 milliliter conische buizen.Spoel de strainers met 15-20 milliliter koude RPMI 10%FBS en verzamel de cellen door middel van centrifugatie. Na het zorgvuldig weggooien van de supernatant, resuspend de cellen op een ongeveer 1 keer 10 tot de 7e cellen per milliliter van RPMI 10%FBS concentratie voor het tellen. Breng vervolgens 2-2,5 keer 10 naar de 6e cellen per 200 microliter van medium naar elke put van een 96-goed ronde bodemplaat en pellet de cellen door centrifugatie.Na het weggooien van de supernatant met zachte flicking, centrifuge wassen de cellen in 200 microliters van staande buffer. Label de cellen in 100 microliter van fixable heidskleurstof, verdund in eiwitvrije buffer gedurende 30 minuten bij 4 graden Celsius, beschermd tegen licht, gevolgd door 2 wasbeurten en verse kleuringbuffer. Na het weggooien van de supernatant, resuspend de pellets in 20 microliters van FC blok voor 15 minuten incubatie bij 4 graden Celsius, gevolgd door de toevoeging van 80 microliters van primaire oppervlakte antilichaam cocktail van belang, gedurende 30 minuten op ijs, beschermd tegen licht.Aan het einde van de oppervlakte antilichaam incubatie, centrifuge wassen de cellen twee keer in een overmatig volume van kleuring buffer, en resuspend de pellets in 100 microliters van secundaire oppervlakte kleuring oplossing, aangevuld met streptavidin. Na 15 minuten op ijs beschermd tegen licht, centrifuge wassen de cellen 2 keer in verse kleuring buffer en resuspend de pellets in 200 microliter van fixatie, permeablisatie werkoplossing voor een niet meer dan 20 minuten incubatie op ijs, beschermd tegen licht. Aan het einde van de incubatie, centrifugeren de plaat onmiddellijk, gevolgd door een centrifuge was in 200 microliters van permeablisatie buffer per goed.Vervolgens, resuspend de cellen in 20 microliters van FC blok, verdund in permeablisatie buffer zoals aangetoond, gevolgd door de toevoeging van 80 microliters van de intracellulaire antilichaam cocktail van belang, gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Was de cellen met 100 microliter permeablisatiebuffer, gevolgd door een tweede wasbeurt in 200 microliter van permeablisatiebuffer. Vervolgens, resuspend de pellets in 200 microliter van kleuring buffer, en breng de cellen naar de juiste overeenkomstige 5 milliliter stroom cytometrische analyse buizen, in een uiteindelijk volume van 400 microliters van kleuring buffer per buis.Peyer's patches zijn niet gelijkmatig verdeeld over de dunne darm, maar zijn dichter gelokaliseerd naar de distale en proximale uiteinden van het weefsel. Dit protocol vergemakkelijkt de isolatie van een Peyer patch lymfocyten populatie die een forward-side verspreide verdeling aantoont, vergelijkbaar met die waargenomen voor splenocyten, met een meer dan 95% cel levensvatbaarheid. CD4 CD19 Double Positive cellen vormen ongeveer 1% van de totale Peyer's patch lymfocyten populatie.Deze hoge niveaus van CXCR5 en GL7, die, wanneer niet uitgesloten, kan leiden tot vals-positieve resultaten in de gating van T-helper folliculaire en kiminale centrum B cel, respectievelijk. Vergeleken met andere secundaire lymfoïde organen vertonen peyer's patches een aanzienlijk hogere verhouding van kiemcentrum B-cellen, op een bereik van 2-10% van de totale B-celpopulatie onder steady state omstandigheden. Net als kiemcentrum B-cellen varieert de folliculaire T-helper celfractie ook in individuele niet-geïmmuniseerde muizen, met een bereik van 10-20% van het totaal, de PATCH T-lymfocytenpopulatie van de CD4 Positive Peyer.Collagenase gebaseerde enzymatische spijsvertering leidt tot massale vermindering van CXCR5 T-helper folliculaire celexpressie, terwijl het verlaten van de expressie van andere oppervlaktemoleculen onaangetast. Na deze ontwikkeling, deze techniek maakte de weg vrij voor de identificatie van de belangrijkste cellulaire factoren binnen de patches van de Peyer die betrokken zijn bij mucosale en humerale immuniteit.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

Een gedetailleerd protocol voor het karakteriseren van het Muizen C1498 Cell Line en de bijbehorende Leukemie muismodel

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Een muismodel van vermoeidheid geïnduceerd door Peripheral Bestraling

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

One-step Protocol for Evaluation of the Mode of Radiation-induced Clonogenic Cell Death by Fluorescence Microscopy

One-Step Protocol voor evaluatie van de wijze van straling veroorzaakte de Clonogenic celdood door fluorescentie microscopie

Research on ionizing radiation (IR)-induced clonogenic cell death is important for understanding the effect of IR on malignant tumors and normal tissues. ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolatie en karakterisering van tumor initiërende cellen uit Sarcoom patiënt-afgeleide xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Protocol van de isolatie van muis monocyt-afgeleide dendritische cellen en hun latere In Vitro activatie met Tumor immuuncomplexen

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

Isolatie van menselijke endotheliale cellen van normale Colon en colorectaal carcinoom - een verbeterde Protocol

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping van Orthotopic Homograft (Syngeneic) van de alvleesklier ductaal adenocarcinoom lymfkliertest primaire KPC door Stroom Cytometry

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Synthesis and Characterization of Placental Chondroitin Sulfate A (plCSA)-Targeting Lipid-Polymer Nanoparticles

Synthesis and Characterization of Placental Chondroitin Sulfate A plCSA-Targeting Lipid-Polymer Nanoparticles

Synthese en karakterisering van placenta Chondroitin sulfaat een (plCSA) - Targeting lipide - polymeer nanodeeltjes

An effective cancer therapeutic method reduces and eliminates tumors with minimal systemic toxicity. Actively targeting nanoparticles offer a promising ...

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

Ruimtelijke en temporele controle van muizen melanoom initiatie van mutant melanocyt stamcellen

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles

Isolatie van primaire kanker-geassocieerde fibroblasten uit een syngenetisch muizenmodel van borstkanker voor de studie van gerichte nanodeeltjes

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are key actors in the context of the tumor microenvironment. Despite being reduced in number as compared to tumor ...