Name: unraveling key players of humoral immunity: advanced and optimized lymphocyte isolation protocol from murine peyer's patches
Uploaded: 2018-11-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Unraveling Key Players of Humoral Immunity: Advanced and Optimized Lymphocyte Isolation Protocol from Murine Peyer's Patches at JoVE.com

Vorremmo ringraziare Laura Strauss e Peter Sage per utili discussioni e supporto con analisi di citometria a flusso.

Tutti gli studi e gli esperimenti descritti in questo protocollo sono state condotte sotto le linee guida secondo istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC) del Beth Israel Deaconess Medical Center.
1. progettazione di set-up sperimentale e Mouse gruppi
<ol><li>(Opzionale) Co-casa topi sperimentali per facilitare la trasmissione orizzontale del microbiota dell'intestino tra topi sperimentali e per ridurre la variabilità non specifici all'interno di linfociti PP. Inoltre, è possibil...

<ol>
	<li>van den Berg, T. K., van der Schoot, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+&#8216;self&#8217;+recognition:+a+role+for+CD47-SIRP&#945;+interactions+in+hematopoietic+stem+cell+transplantation.">Innate immune &#8216;self&#8217; recognition: a role for CD47-SIRP&#945; interactions in hematopoietic stem cell transplantation.</a> Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).</li><li>Mowat, A. M., Agace, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+specialization+within+the+intestinal+immune+system.">Regional specialization within the intestinal immune system.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).</li><li>Reboldi, A., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peyer&#8217;s+patches:+Organizing+B-cell+responses+at+the+intestinal+frontier.">Peyer&#8217;s patches: Organizing B-cell responses at the intestinal frontier.</a> Immunological Reviews. 271 (1), 230-245 (2016).</li><li>Heel, K. A., McCauley, R. D., Papadimitriou, J. M., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+Peyer&#8217;s+patches.">Review: Peyer&#8217;s patches.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 12 (2), 122-136 (1997).</li><li>Fagarasan, S., Kinoshita, K., Muramatsu, M., Ikuta, K., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+class+switching+and+differentiation+to+IgA-producing+cells+in+the+gut+lamina+propria.">In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria.</a> Nature. 413 (6856), 639-643 (2001).</li><li>Hopkins, S. A., Niedergang, F., Corthesy-Theulaz, I. E., Kraehenbuhl, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recombinant+Salmonella+typhimurium+vaccine+strain+is+taken+up+and+survives+within+murine+Peyer&#8217;s+patch+dendritic+cells.">A recombinant Salmonella typhimurium vaccine strain is taken up and survives within murine Peyer&#8217;s patch dendritic cells.</a> Cellular Microbiology. 2 (1), 59-68 (2000).</li><li>Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholera+toxin+induces+migration+of+dendritic+cells+from+the+subepithelial+dome+region+to+T-+and+B-cell+areas+of+Peyer's+patches.">Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer's patches.</a> Infection and Immunity. 71 (1), 504-509 (2003).</li><li>Sato, A., Iwasaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peyer&#8217;s+patch+dendritic+cells+as+regulators+of+mucosal+adaptive+immunity.">Peyer&#8217;s patch dendritic cells as regulators of mucosal adaptive immunity.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1333-1338 (2005).</li><li>Bemark, M., Boysen, P., Lycke, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+gut+IgA+production+through+T+cell-dependent+and+T+cell-independent+pathways.">Induction of gut IgA production through T cell-dependent and T cell-independent pathways.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1247 (1), 97-116 (2012).</li><li>Fagarasan, S., Kawamoto, S., Kanagawa, O., Suzuki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+Immune+Regulation+in+the+Gut:+T+Cell-Dependent+and+T+Cell-Independent+IgA+Synthesis.">Adaptive Immune Regulation in the Gut: T Cell-Dependent and T Cell-Independent IgA Synthesis.</a> Annual Review of Immunology. 28, 243-273 (2010).</li><li>Hase, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+through+glycoprotein+2+of+FimH+++bacteria+by+M+cells+initiates+mucosal+immune+response.">Uptake through glycoprotein 2 of FimH + bacteria by M cells initiates mucosal immune response.</a> Nature. 462 (7270), 226-230 (2009).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Inhibitory+Role+for+the+Transcription+Factor+Stat3+in+Controlling+IL-4+and+Bcl6+Expression+in+Follicular+Helper+T+Cells.">An Inhibitory Role for the Transcription Factor Stat3 in Controlling IL-4 and Bcl6 Expression in Follicular Helper T Cells.</a> Journal of Immunology. 195 (5), 2080-2089 (2015).</li><li>Vinuesa, C. G., Tangye, S. G., Moser, B., Mackay, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+B+helper+T+cells+in+antibody+responses+and+autoimmunity.">Follicular B helper T cells in antibody responses and autoimmunity.</a> Nature Reviews Immunology. 5 (11), 853-865 (2005).</li><li>Victora, G. D., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germinal+Centers.">Germinal Centers.</a> Annual Review of Immunology. 30, 429-457 (2012).</li><li>Vaeth, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Store-Operated+Ca2+Entry+in+Follicular+T+Cells+Controls+Humoral+Immune+Responses+and+Autoimmunity.">Store-Operated Ca2+Entry in Follicular T Cells Controls Humoral Immune Responses and Autoimmunity.</a> Immunity. 44 (6), 1350-1364 (2016).</li><li>Meli, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Integrin+LFA-1+Controls+T+Follicular+Helper+Cell+Generation+and+Maintenance.">The Integrin LFA-1 Controls T Follicular Helper Cell Generation and Maintenance.</a> Immunity. 45 (4), 831-846 (2016).</li><li>Fu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+in+T+follicular+regulatory+cells+promotes+autoimmunity.">Deficiency in T follicular regulatory cells promotes autoimmunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 815-825 (2018).</li><li>Esp&#233;li, M., Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> T follicular helper cells - Methods and Protocols. , (2015).</li><li>Couter, C. J., Surana, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Flow+Cytometric+Characterization+of+Murine+Small+Intestinal+Lymphocytes.">Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes.</a> Journal of Visual Experiments. (111), e54114 (2016).</li><li>De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+And+Immunostaining+Lymphocytes+and+Dendritic+Cells+from+Murine+Peyer&#8217;s+Patches.">Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer&#8217;s Patches.</a> Journal of Visual Experiments. (73), e50167 (2013).</li><li>Pastori, C., Lopalco, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+in+vitro+Activation+of+Mouse+Peyer&#8217;s+Patch+Cells+from+Small+Intestine+Tissue.">Isolation and in vitro Activation of Mouse Peyer&#8217;s Patch Cells from Small Intestine Tissue.</a> Bio-protocol. 4 (21), e1282 (2014).</li><li>Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+Mouse+Ligated+Peyer&#8217;s+Patch+Intestinal+Loop+Assay+to+Evaluate+Bacterial+Uptake+by+M+cells.">Application of a Mouse Ligated Peyer&#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells.</a> Journal of Visual Experiments. (58), 3225 (2011).</li><li>Naito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germinal+Center+Marker+GL7+Probes+Activation-Dependent+Repression+of+N-Glycolylneuraminic+Acid,+a+Sialic+Acid+Species+Involved+in+the+Negative+Modulation+of+B-Cell+Activation.">Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (8), 3008-3022 (2007).</li><li>Bollig, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+{IRF4}+determines+germinal+center+formation+through+follicular+T-helper+cell+differentiation.">Transcription factor {IRF4} determines germinal center formation through follicular T-helper cell differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Science of U. S. A. 109 (22), 8664-8669 (2012).</li><li>P&#233;rez-Mazliah, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+Helper+T+Cells+are+Essential+for+the+Elimination+of+Plasmodium+Infection.">Follicular Helper T Cells are Essential for the Elimination of Plasmodium Infection.</a> EBioMedicine. 24, 216-230 (2017).</li><li>Sage, P. T., Sharpe, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+follicular+regulatory+cells+in+the+regulation+of+B+cell+responses.">T follicular regulatory cells in the regulation of B cell responses.</a> Trends Immunology. 36 (7), 410-418 (2015).</li><li>Van Damme, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+agents+and+enzymes+used+for+the+extraction+of+gut+lymphocytes+influence+flow+cytometric+detection+of+T+cell+surface+markers.">Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers.</a> Journal of Immunological Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).</li><li>Meenan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+expression+of+alpha+4+beta+7,+a+gut+homing+integrin,+by+circulating+and+mucosal+T+cells+in+colonic+mucosal+inflammation.">Altered expression of alpha 4 beta 7, a gut homing integrin, by circulating and mucosal T cells in colonic mucosal inflammation.</a> Gut. 40 (2), 241-246 (1997).</li><li>Cao, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+(IL)+-21+promotes+intestinal+IgA+response+to+microbiota.">Interleukin (IL) -21 promotes intestinal IgA response to microbiota.</a> Mucosal Immunology. 8 (5), 1072-1082 (2015).</li><li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+enforces+functional+integrity+of+regulatory+T+cells+by+coupling+environmental+cues+and+metabolic+homeostasis.">Autophagy enforces functional integrity of regulatory T cells by coupling environmental cues and metabolic homeostasis.</a> Nature Immunology. 17 (3), 277-285 (2016).</li><li>Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+enzymatic+tissue+disintegration+on+the+level+of+surface+molecule+expression+and+immune+cell+function.">Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function.</a> European Journal of Microbiology &amp; Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).</li><li>Trapecar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Optimized+and+Validated+Method+for+Isolation+and+Characterization+of+Lymphocytes+from+HIV++Human+Gut+Biopsies.">An Optimized and Validated Method for Isolation and Characterization of Lymphocytes from HIV+ Human Gut Biopsies.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. 33 (S1), (2017).</li><li>Bergqvist, P., Gardby, E., Stensson, A., Bemark, M., Lycke, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+IgA+Class+Switch+Recombination+in+the+Absence+of+CD40+Does+Not+Occur+in+the+Lamina+Propria+and+Is+Independent+of+Germinal+Centers.">Gut IgA Class Switch Recombination in the Absence of CD40 Does Not Occur in the Lamina Propria and Is Independent of Germinal Centers.</a> Journal of Immunology. 177 (11), 7772-7783 (2006).</li><li>Keil, B., Gilles, A. M., Lecroisey, A., Hurion, N., Tong, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+collagenase+from+Achromobacter+iophagus.">Specificity of collagenase from Achromobacter iophagus.</a> FEBS Letters. 56 (2), 292-296 (1975).</li><li>Mora, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imprinting+of+gut-homing+T+cells+by+Peyer&#8217;s+patch+dendritic+cells.">Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer&#8217;s patch dendritic cells.</a> Nature. 424 (6944), 88-93 (2003).</li><li>Reboldi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+immunology:+IgA+production+requires+B+cell+interaction+with+subepithelial+dendritic+cells+in+Peyer&#8217;s+patches.">Mucosal immunology: IgA production requires B cell interaction with subepithelial dendritic cells in Peyer&#8217;s patches.</a> Science. 352 (6287), (2016).</li></ol>

Qui, descriviamo un protocollo ottimizzato per la caratterizzazione di cytometric di flusso delle cellule TFH e GC B. Uno dei vantaggi principali del nostro protocollo è che permette l'isolamento di fino a 10 cellule PP totale7 (media 4 – 5 x 106 cellule) da un singolo mouse (ceppo C57BL/6) senza alcun processo digestivo. Abbiamo osservato che la resa totale delle cellule è stata correlata positivamente con il numero di PPs e poteva essere stimata dalla seguente equazione semplice che è utile p...

L'intero tratto gastrointestinale dall'inizio alla fine è addobbato con una vasta rete di linfoide che contiene le cellule immunitarie più di qualsiasi altro organo in essere umano e del mouse1. Peyer di patch (PPs) costituiscono una componente importante del ramo intestinale di questa organizzazione immune cellulare, cosiddetto tessuto linfoide associato all'intestino (GALT)2,3. All'interno di PPs, migliaia di milioni di antigeni derivati da materiali dietetici, agenti patogeni e commensale microbiota sono campionati continuamente e quando necessarie e appropriato le risposte immunitarie verso di loro sono montato così mantenere immunitario intestinale omeostasi. In questo senso, PPs può essere denominata come "tonsille del piccolo intestino". PPs sono costituiti principali sub-compartimenti: cupola subepiteliale (SED), ampie zone di B-cellula del follicolo; l'epitelio sovrastante follicolo-collegata (FAE) e la regione interfollicular (IFR) dove le cellule T sono situati4. Questa compartimentazione unica di PPs sottoinsiemi di cellule effettrici diverse consente di cooperare, conferisce quindi, immunocompetenza nell'intestino.
PPs mancano vasi linfatici afferenti, e proprio per questo motivo, gli antigeni trasportati in PPs dal piccolo intestino non sono stati condotti attraverso i vasi linfatici in contrasto con la maggior parte degli altri organi linfoidi. Invece, le cellule epiteliali specializzate situate in FAE, cosiddette cellule M, sono responsabili per il trasferimento degli antigeni luminal in PPs5. Successivamente, gli antigeni trasportati sono stati prelevati dalle cellule dendritiche (DCs) e fagociti che si trovano nella regione subepiteliale cupola (SED) sotto la FAE6,7. Questo processo di cernita di antigene da DCs in PP è fondamentale per avviare la generazione successiva di IgA che secerne le cellule9e risposta immunitaria adattativa8 .
Dovuto il pesante fardello antigenico da flora commensale e materiale alimentare, PPs host in modo endogeno attivato T effettrici e sottoinsiemi di cellule B in grande abbondanza come TFH e IgA+ GC B cellule10, suggerendo che il PPs rappresentano un sito di attivo immune risposta di11. Rilevazione di fino a 20 – 25% cellule TFH all'interno totale CD4+ T cell vano e fino a 10 – 15% GC B cellule all'interno di cellule B totali è possibile in PPs raccolti da non immunizzati giovane di topi C57BL/612. A differenza di altri tipi di cellula dell'assistente di T (cioè., Th1, Th2, Th17 cellule), TFH cellule mostrano tropismo unico in follicoli di cellule B principalmente a causa di espressione CXCR5, che promuove l'homing delle cellule TFH lungo gradienti CXCL1313. Nelle zone delle cellule di B del follicolo di PPs, TFH cellule inducono IgA classe interruttore ricombinazione e ipermutazione somatica in cellule di B attivate da cui ad alta affinità IgA producendo cellule differenziano14. Successivamente, queste cellule di plasma disecrezione migrare verso la lamina propria (LP) e regolano l'omeostasi immune nell' intestino10.
Identificazione e caratterizzazione di popolazioni di cellule TFH e GC B all'interno di PPs potrebbe consentire ai ricercatori di studiare la dinamica della risposta immunitaria umorale sotto condizioni di stato stazionario senza la necessità di modelli di immunizzazione richiede molto tempo utilizzato tradizionalmente in TFH-GC B cella studi15,16,17,18. Analizzando le cellule TFH entro PPs non è così semplice come altri sottoinsiemi di cellule. Sfide tecniche includono identificare condizioni di tessuto ideale preparazione, combinazione di anticorpo-indicatore della superficie, così come la selezione di appropriati controlli positivi e negativi. Campi di ricerca sia TFH e PP presentano grande variabilità in termini di procedure sperimentali e sono tutt'altro che conferisce un consenso per stabilire protocolli standardizzati per diversi motivi. In primo luogo, ogni sottoinsieme delle cellule all'interno di PPs tende a risentire differenzialmente condizioni di preparazione dei tessuti che richiedono ulteriori modifiche nel modo di sottoinsieme specifico delle cellule. In secondo luogo, c'è una discrepanza significativa tra i metodi segnalati per quanto riguarda i dettagli della preparazione delle cellule da PPS. terzo, il numero di studi comparativi basati su protocollo studiando tecniche di preparazione del tessuto ideale e condizioni sperimentali per PP e TFH ricerca è piuttosto limitato.
Attuali studi basati su protocollo suggeriti per PP cella preparazione19,20,21,22 non erano TFH - o GC delle cellule di B-oriented. Inoltre, alcune condizioni di preparazione del tessuto consigliati per PPs19,20 come digestione basati su collagenosi sono stati trovati per influenzare negativamente il risultato dell'identificazione di TFH tramite flusso cytometry18. Su questa base, abbiamo ragionato che un protocollo ottimizzato, standardizzato e riproducibile che può essere utilizzato per studiare la dinamica cellulare TFH e GC B all'interno di PPs sarebbe prezioso per gli investigatori lavorando su questo argomento. Questa necessità ci ha dato l'impulso per generare un protocollo migliorato e aggiornato per l'isolamento e la caratterizzazione dei linfociti PP finemente ottimizzato per recupero cellulare, redditività ed efficienza per la caratterizzazione di cytometric di flusso delle diverse T e B sottoinsiemi di cellule. Abbiamo anche mirato a escludere diversi passaggi di laboriosa preparazione suggeriti nei precedenti protocolli, quindi, riducendo le opportune manipolazioni e i tempi per la preparazione di tessuti e cellule da PPs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD4 antibody</td>
			<td>eBioscience, Biolegend*</td>
			<td>17-0041-81 ,10054*</td>
			<td>For detailed information see Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CD19 antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>MA5-16536</td>
			<td>For detailed information see Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse PD-1 antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>61-9985-82</td>
			<td>For detailed information see Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse ICOS antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-9942-82</td>
			<td>For detailed information see Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse GL7 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>144610</td>
			<td>For detailed information see Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse CXCR5 antibody</td>
			<td>Biolegend*, BD Bioscience</td>
			<td>145512*, 551960</td>
			<td>For detailed information see Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse BCL-6 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>358512</td>
			<td>For detailed information see Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse Foxp3 antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-5773-82</td>
			<td>For detailed information see Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-BV421</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>563259</td>
			<td>For detailed information see Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FixableViability Dye</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>L34957</td>
			<td>For detailed information see Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7AAD</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420404</td>
			<td>For detailed information see Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcBlock (CD16/32)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553141</td>
			<td>For detailed information see Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-5523-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well,12-well &#38; 96-well plates</td>
			<td>Falcon/Corning</td>
			<td>353046,353043/3596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml syringe-plunger</td>
			<td>Exel INT</td>
			<td>26265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Model 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved-end scissor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Serrated Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small curved scissor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

unraveling key players of humoral immunity: advanced and optimized lymphocyte isolation protocol from murine peyer's patches

Nella mucosa dell'intestino, cellule immunitarie costituiscono un'entità unica immunologica, che promuove la tolleranza immunitaria mentre contemporaneamente conferimento difesa immunitaria contro gli agenti patogeni. È affermato che di Peyer (PPs) hanno un ruolo essenziale nella rete immune mucosa ospitando diversi T effettrici e sottoinsiemi delle cellule B. Una certa frazione di queste cellule effettrici, follicolare T helper (TFH) e cellule di B del centro germinativo (GC) sono professionalizzata nella regolazione dell'immunità umorale. Quindi, la caratterizzazione di questi sottoinsiemi di cellule all'interno di PPs in termini di loro programma di differenziazione e proprietà funzionali può fornire informazioni importanti sull'immunità mucosale. A tal fine, un metodo facilmente applicabile, efficace e riproducibile di isolamento dei linfociti da PPs sarebbe prezioso per i ricercatori. In questo studio, abbiamo mirato a generare un metodo efficace per isolare i linfociti da mouse PPs con resa elevata delle celle. Il nostro approccio ha rivelato che l'elaborazione come l'uso di reagenti digestivi e agitazione del tessuto, il tessuto iniziale così come colorazione condizioni e selezione dei pannelli di anticorpo delle cellule, hanno una grande influenza sulla qualità e identità dei linfociti isolati e il risultati sperimentali.
Qui, descriviamo un protocollo che consente ai ricercatori di isolare in modo efficiente popolazioni linfocitarie da PPs permettendo la valutazione di base di citometria a flusso riproducibile dei sottoinsiemi di cellule T e B concentrandosi soprattutto su sottoinsiemi di cellule TFH e GC B.

In contrasto con un precedente protocollo20, abbiamo osservato che PPs non sono distribuiti uniformemente in tutto il SI, ma sono localizzati più densamente verso l'estremità distale e prossimale del SI, come mostrato Figura 1A. L'analisi cytometric di flusso ha mostrato che, se seguite correttamente, il nostro protocollo dà una popolazione di linfociti PP che illustra la distribuzione di forward-s...

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Unraveling Key Players of Humoral Immunity: Advanced and Optimized Lymphocyte Isolation Protocol from Murine Peyer's Patches

Unraveling i giocatori chiave di immunità umorale: avanzata e ottimizzata protocollo di isolamento del linfocita da Patches murino placche di Peyer

In questo studio, presentiamo un romanzo e un efficace protocollo per l'isolamento dei linfociti da placche di Peyer (PPs), che può essere utilizzati successivamente per saggi funzionali in vivo ed in vitro come pure gli studi cytometric di flusso di follicolare T Helper e cellule centro germinale B.

In the gut mucosa, immune cells constitute a unique immunological entity, which promotes immune tolerance while concurrently conferring immune defense ...

Questo metodo può rispondere a domande chiave sul fenotipo dei sottoinsiemi di celle T e B isolati patch peyer del mouse. In particolare, le popolazioni di cellule T follicolari e del centro germinale B. Il principale vantaggio di questa tecnica è che rinuncia a diversi laboriosi passaggi di preparazione come la digestione a base di collagenasi che compromettono la qualità e l'identità dei linfociti isolati.Iniziare posizionando un topo in posizione supina e sterilizzando l'addome con il 70% di etanolo. Fare un'incisione addominale della linea mediana attraverso la pelle e il peritoneo dal pube alla gabbia toracica per aprire la cavità peritinale e localizzare il cieco e la giunzione ileocecale. Fare il più distale possibile tagliare alla giunzione per separare l'intestino tenue dal cieco.Tagliare il mesentere con le forbici per rimuovere con cura l'intero intestino tenue fino allo sfintere pilorico. Tagliare la giunzione tra il piloro e il duodeno per staccare completamente l'intestino tenue dalla cavità addominale e posizionare l'intestino tenue isolato in un pozzo di una piastra a 6 po porsi contenente mezzo RPMI freddo integrato con siero bovino fetale al 10%, o FBS, sul ghiaccio. Quindi, agitare delicatamente i tessuti manualmente fino a quando tutti i segmenti non sono immersi nel mezzo freddo.Quando tutto l'intestino è stato raccolto, utilizzare le forcep per afferrare il grasso mesenterico di un bordo dell'intestino e posizionare il campione, lato mesenterico verso il basso, su un tovagliolo di carta. Inumidire l'intero segmento intestinale con RPMI 10%FBS per evitare disidratazione e appiccicosa dei tessuti e individuare le chiazze del Peyer, che appaiono come aggregati multilobulati bianchi con una forma simile al cavolfiore sul lato anti-mesenterico della parete intestinale. Per raccogliere le patch del Peyer, usa forbici chirurgiche curve con la curva rivolta verso l'alto per asportare delicatamente ogni cerotto dai suoi bordi distale e prossimale, facendo attenzione ad escludere il tessuto intestinale circostante, e posiziona le chiazze del Peyer in singoli pozzi di una piastra da 12 pozzetti contenente RPMI ghiacciato 10% FBS sul ghiaccio man mano che vengono raccolti.Una volta acquisite tutte le patch, utilizzare le forbici per tagliare la punta di una punta di micro pipetta da 1 millimetro in modo che il diametro sia abbastanza grande da aspirare le patch dei singoli Peyer e trasferire le patch del Peyer in tubi conici da 150 millimetri per mouse contenenti 25 millilitri di 37 gradi Celsius RPMI 10%FBS. Quindi posizionare il tubo in uno shaker orbitale a 37 gradi Celsius con agitazione continua a 125-150 giri/min per 10 minuti. Al termine dell'agitazione, trasferire le chiazze del Peyer su un filtro cellulare da 140 micrometri per mouse e utilizzare l'estremità in gomma di uno stantuffo per siringa da 10 millilitri per animale per interrompere delicatamente le chiazze del Peyer attraverso la rete in singoli tubi conici da 50 millilitri.Risciacquare i filtri con 15-20 millilitri di RPMI freddo 10%FBS e raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Dopo aver scartato attentamente il supernatante, resuspend le cellule a circa 1 per 10 fino alla 7 ° cellule per millilitro di concentrazione RPMI 10%FBS per il conteggio. Quindi trasferire 2-2,5 per 10 alla 6 ° celle per 200 microlitri di mezzo ad ogni pozzo di una piastra inferiore rotonda di 96 po 'e pelletare le cellule per centrifugazione.Dopo aver scartato il supernatante con un leggero sfarfallio, la centrifuga lava le cellule in 200 microlitri di tampone in piedi. Etichettare le cellule in 100 microlitri di colorante di vitalità fissabile, diluiti in tampone privo di proteine per 30 minuti a 4 gradi Celsius, protetti dalla luce, seguiti da 2 lavaggi e tampone di colorazione fresco. Dopo aver scartato il supernatante, ha rimescolato i pellet in 20 microlitri di blocco FC per 15 minuti di incubazione a 4 gradi Celsius, seguito dall'aggiunta di 80 microlitri di cocktail di anticorpi superficiali primari di interesse, per 30 minuti sul ghiaccio, protetti dalla luce.Al termine dell'incubazione dell'anticorpo superficiale, la centrifuga lava le cellule due volte in un volume in eccesso di tampone di colorazione e rimospende i pellet in 100 microlitri di soluzione di colorazione superficiale secondaria, integrata con streptavidina. Dopo 15 minuti su ghiaccio protetto dalla luce, la centrifuga lava le cellule 2 volte in tampone di colorazione fresco e risospende i pellet in 200 microlitri di fissazione, soluzione di lavoro permeablizzazione per un'incubazione non superiore a 20 minuti sul ghiaccio, protetta dalla luce. Al termine dell'incubazione, centrifugare immediatamente la piastra, seguita da una centrifuga era in 200 microlitri di tampone di permeablizzazione per pozzo.Successivamente, rimospendare le cellule in 20 microlitri di blocco FC, diluiti in tampone di permeablizzazione come dimostrato, seguito dall'aggiunta di 80 microlitri del cocktail di anticorpi intracellulari di interesse, per 30 minuti a temperatura ambiente, protetti dalla luce. Lavare le celle con 100 microlitri di tampone di permeablizzazione, seguiti da un secondo lavaggio in 200 microlitri di tampone di permeablizzazione. Quindi, resostigliere i pellet in 200 microlitri di tampone di colorazione e trasferire le cellule negli appropriati tubi di analisi citometrica a flusso di 5 millilitri corrispondenti, in un volume finale di 400 microlitri di tampone di colorazione per tubo.Le chiazze di Peyer non sono distribuite uniformemente in tutto l'intestino tenue, ma sono localizzate più densamente verso le estremità distali e prossimali del tessuto. Questo protocollo facilita l'isolamento della popolazione di linfociti patch di un Peyer che dimostra una distribuzione diffusa sul lato anteriore, simile a quella osservata per gli splenociti, con una vitalità cellulare superiore al 95%. Cd4 CD19 Le cellule double positive costituiscono circa l'1% della popolazione totale di linfociti cerotto di Peyer.Questi esprimono alti livelli di CXCR5 e GL7, che, se non esclusi, possono portare a risultati falsi positivi nella ghiandolazione della cellula follicolare e germinale centrale B di T-helper, rispettivamente. Rispetto ad altri organi linfoidi secondari, le chiazze di Peyer mostrano un rapporto significativamente più elevato tra le cellule B centro germinali, ad un intervallo del 2-10% della popolazione totale di cellule B in condizioni di stato stazionario. Come le cellule B centro germinali, la frazione follicolare delle cellule T-helper varia anche nei singoli topi non immunizzati, con un intervallo del 10-20% del totale, la popolazione di linfociti T patch del PEYER positivo CD4.La digestione enzimatica a base di collagenasi porta ad una massiccia riduzione dell'espressione cellulare follicolare di CXCR5 T-helper, lasciando inalterata l'espressione di altre molecole superficiali. Dopo questo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada all'identificazione dei fattori cellulari chiave all'interno delle macchie del Peyer che sono coinvolti nell'immunità mucosa e omerale.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

Un protocollo dettagliato per caratterizzare la linea cellulare murina C1498 e il suo modello associato leucemia mouse

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Un modello murino di fatica indotta da irradiazione Peripheral

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

One-step Protocol for Evaluation of the Mode of Radiation-induced Clonogenic Cell Death by Fluorescence Microscopy

One-Step protocollo per la valutazione del modo di morte indotta da radiazioni delle cellule Clonogenic da microscopia di fluorescenza

Research on ionizing radiation (IR)-induced clonogenic cell death is important for understanding the effect of IR on malignant tumors and normal tissues. ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolamento e caratterizzazione delle cellule che invitano il tumore dalle cellule che hanno invitato il tumore da Sarcoma Xenotrapianto derivato dal paziente

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Protocollo di isolamento del Mouse cellule dentritiche monocito-derivate e loro attivazione successiva In Vitro con tumore immunocomplessi

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

Isolamento di cellule endoteliali umane da Colon normale e Carcinoma colorettale - un protocollo migliorato

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping di Orthotopic omotrapianto (Syngeneic) dell'Adenocarcinoma Ductal pancreatico murino primario KPC tramite flusso Cytometry

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Synthesis and Characterization of Placental Chondroitin Sulfate A (plCSA)-Targeting Lipid-Polymer Nanoparticles

Synthesis and Characterization of Placental Chondroitin Sulfate A plCSA-Targeting Lipid-Polymer Nanoparticles

Sintesi e caratterizzazione di placenta condroitina solfato un (plCSA) - Targeting del lipido - nanoparticelle polimeriche

An effective cancer therapeutic method reduces and eliminates tumors with minimal systemic toxicity. Actively targeting nanoparticles offer a promising ...

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

Controllo spaziale e temporale dell'iniziazione del melanoma murino dalle cellule staminali di melanociti mutanti

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles

Isolamento di fibroblasti primari associati al cancro da un modello murino singeneico di cancro al seno per lo studio di nanoparticelle mirate

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are key actors in the context of the tumor microenvironment. Despite being reduced in number as compared to tumor ...