Name: a syngeneic mouse b-cell lymphoma model for pre-clinical evaluation of cd19 car t cells
Uploaded: 2018-10-16T15:00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells at JoVE.com

ברצוננו להודות Bloodwise על מימון מחקר זה (גרנט 13031) ואת מנצ'סטר CRUK משאב ביולוגי יחידה, הדמיה של cytometry וביולוגיה מולקולרית הליבה המתקנים לתמיכה עבודה זו.

<ol>
	<li>. Food and Drugs Administration Biologics Licence Application Approval letter Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/CellularGeneTherapyProducts/ApprovedProducts/UCM574106.pdf">https://www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/CellularGeneTherapyProducts/ApprovedProducts/UCM574106.pdf</a> (2017)</li><li>. Food and Drugs Administration Biologics Licence Application Approval letter Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/cellulargenetherapyproducts/approvedproducts/ucm581259.pdf">https://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/cellulargenetherapyproducts/approvedproducts/ucm581259.pdf</a> (2017)</li><li>Liu, Y., Zeng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+and+Innate+Immune+System+Interactions:+Translational+Potentials+for+Cancer+Immunotherapy.">Cancer and Innate Immune System Interactions: Translational Potentials for Cancer Immunotherapy.</a> Journal of Immunotherapy. 35 (4), 299-308 (2012).</li><li>Janssen, L. M. E., Ramsay, E. E., Logsdon, C. D., Overwijk, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+system+in+cancer+metastasis:+friend+or+foe.">The immune system in cancer metastasis: friend or foe.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 5 (1), 79 (2017).</li><li>Pandya, P. H., Murray, M. E., Pollok, K. E., Renbarger, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Immune+System+in+Cancer+Pathogenesis:+Potential+Therapeutic+Approaches.">The Immune System in Cancer Pathogenesis: Potential Therapeutic Approaches.</a> Journal of Immunology Research. 2016, 13 (2016).</li><li>Vinay, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+evasion+in+cancer:+Mechanistic+basis+and+therapeutic+strategies.">Immune evasion in cancer: Mechanistic basis and therapeutic strategies.</a> Seminars in Cancer Biology. 35, S185-S198 (2015).</li><li>Gajewski, T. F., Meng, Y., Harlin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+Suppression+in+the+Tumor+Microenvironment.">Immune Suppression in the Tumor Microenvironment.</a> Journal of Immunotherapy. 29 (3), 233-240 (2006).</li><li>Munn, D. H., Bronte, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+suppressive+mechanisms+in+the+tumor+microenvironment.">Immune suppressive mechanisms in the tumor microenvironment.</a> Current opinion in immunology. 39, 1-6 (2016).</li><li>Vanderlugt, C. L., Miller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope+spreading+in+immune-mediated+diseases:+implications+for+immunotherapy.">Epitope spreading in immune-mediated diseases: implications for immunotherapy.</a> Nature Reviews Immunology. 2, 85 (2002).</li><li>Hardwick, N., Chain, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope+spreading+contributes+to+effective+immunotherapy+in+metastatic+melanoma+patients.">Epitope spreading contributes to effective immunotherapy in metastatic melanoma patients.</a> Immunotherapy. 3 (6), 731-733 (2011).</li><li>Makkouk, A., Weiner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Immunotherapy+and+Breaking+Immune+Tolerance-New+Approaches+to+an+Old+Challenge.">Cancer Immunotherapy and Breaking Immune Tolerance-New Approaches to an Old Challenge.</a> Cancer research. 75 (1), 5-10 (2015).</li><li>Jackson, S. R., Yuan, J., Teague, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+CD8(+)+T-cell+tolerance+for+cancer+immunotherapy.">Targeting CD8(+) T-cell tolerance for cancer immunotherapy.</a> Immunotherapy. 6 (7), 833-852 (2014).</li><li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphodepletion+and+tumor+burden+govern+clinical+responses+in+patients+with+B-cell+malignancies+treated+with+autologous,+CD19-targeted+T+cells.">Lymphodepletion and tumor burden govern clinical responses in patients with B-cell malignancies treated with autologous, CD19-targeted T cells.</a> Journal of Clinical Oncology. 29 (15_suppl), 2534 (2011).</li><li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+persistence+of+adoptively+transferred+autologous+CD19-targeted+T+cells+in+patients+with+relapsed+or+chemotherapy+refractory+B-cell+leukemias.">Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias.</a> Blood. 118 (18), 4817 (2011).</li><li>Hay, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+and+Biomarkers+of+Severe+Cytokine+Release+Syndrome+after+CD19+Chimeric+Antigen+Receptor-modified+T+Cell+Therapy.">Kinetics and Biomarkers of Severe Cytokine Release Syndrome after CD19 Chimeric Antigen Receptor-modified T Cell Therapy.</a> Blood. 130, 2295-2306 (2017).</li><li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+CD19+chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+treatment+of+B+cell+malignancies+in+phase+I+clinical+trials:+a+meta-analysis.">Efficiency of CD19 chimeric antigen receptor-modified T cells for treatment of B cell malignancies in phase I clinical trials: a meta-analysis.</a> Oncotarget. 6 (32), 33961-33971 (2015).</li><li>Kueberuwa, G., Kalaitsidou, M., Cheadle, E., Hawkins, R. E., Gilham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD19+CAR+T+Cells+Expressing+IL-12+Eradicate+Lymphoma+in+Fully+Lymphoreplete+Mice+through+Induction+of+Host+Immunity.">CD19 CAR T Cells Expressing IL-12 Eradicate Lymphoma in Fully Lymphoreplete Mice through Induction of Host Immunity.</a> Molecular Therapy - Oncolytics. 8, 41-51 (2018).</li><li>Engels, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+vectors+for+high-level+transgene+expression+in+T+lymphocytes.">Retroviral vectors for high-level transgene expression in T lymphocytes.</a> Human Gene Therapy. 14 (12), 1155-1168 (2003).</li><li>Parkinson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+Necropsy+and+Selected+Tissue+and+Sample+Collection+in+Rats+and+Mice.">Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e2966 (2011).</li><li>Kueberuwa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR7(+)+selected+gene-modified+T+cells+maintain+a+central+memory+phenotype+and+display+enhanced+persistence+in+peripheral+blood+in+vivo.">CCR7(+) selected gene-modified T cells maintain a central memory phenotype and display enhanced persistence in peripheral blood in vivo.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 5, 14 (2017).</li></ol>

דוד Gilham עובדת עבור Celyad שבה הוא מעורב בייצור של תאי T המכונית. שאר המחברים אין לחשוף.

עכבר syngeneic מודלים לאפשר בדיקה של התקדמות המחלה וטיפול תוך שמירה על מערכת חיסונית ללא פגע. זה הוא בעל חשיבות עליונה בכל הנוגע טיפולים המקיימים אינטראקציה עם מערכת החיסון, ובעיקר עבור סוכני immunotherapeutic.
הפרוטוקול המתואר כאן יש שני זרמים לעבודה חיונית, הראשון הוא שינוי גנטית עכבר תא T לבטא מכוניות. פעולה זו דורשת 7 ימים ממועד חניכה ובבטיחות התמרה חושית. בו-זמני עם הייצור של תאי T המכונית הוא הקמתה של לימפומה מערכתית בעכברים. צריך ייצור תאי T המכונית להיכשל או להיות באיכות מספיקה, זה בדרך כלל לא מספיק זמן כדי לייצר החלפת תאים לפני עכברים להיכנע לימפומה. לכן חיוני כי חוקרים באמצעות מודלים אלה במדויק לבצע הגידול מינון ומחלות התקדמות מחקרים על מנת בהצלחה זמן הייצור של תאי T רכב עבור ניהול טיפולית.
סיבות אופייניות ליעילות נמוכה של התמרה חושית T-cell כולל תרביות תאים עניים היעילות של תאים מפיק, לרוב הדבר נגרם בשל טוהר פלסמיד עני או לא מדויק קביעה של רמת ה-pH של תרביות תאים מדיה. מומלץ לבדוק את היעילות של תרביות תאים תאים מפיק לפני שתמשיך עם פרוטוקול מלא כפי תרביות תאים עניים יגביל את היעילות של T-cell התמרה חושית. שברי רקומביננטי fibronectin האנושי יכול להיות שנאספו, המאוחסנים ב-20 ° C לשימוש חוזר, עם זאת, התוצאה ההקפאה-thaws מרובים התמרה חושית מופחתת יעילות. עיבוד מהיר של העכבר טחולים לאחר אוסף חשוב גם להשגת גבוהה מניבה תאי T בר קיימא.
יצוין, כי הפרוטוקול המתואר כאן מנצל תאים A20 לבטא לוציפראז. זה המועדף הוא מספק את היכולת למדוד נטל גידול סיסטמי על ידי ביולומינסנציה הדמיה. עם זאת, בנוכחות מערכת החיסון פונקציונלי, התגובות לוציפראז יכול להטות את התוצאות. בדקנו בעבר החיסון תגובות לשרוד עכברים סמן transgenes17. זה המפתח כדי לשכפל מפתח ניסויים באמצעות תאים A20 חינם של transgenes כדי לאמת כי אלה לא לשחק תפקיד משמעותי מיגור הגידול על ידי תאים חיסוניים.
בעוד סוכנים הקליני יכול להיות רק בשימוש ב- vivo בעכברים חיסונית לקויה, השימוש בעכבר בתאי T מכונית נגד תאים סרטניים העכבר מאפשר לנו להעריך התרומות של המערכת החיסונית כדי התקדמות טיפולית יעילות או מחלה. פרוטוקול זה יכול להיות מנוצל על הערכה טרום קליניים של מכוניות מיקוד B-cell לימפומה או מכוניות אחרות עם שינויים נוספים כגון הפרשת IL-12 כפי שמתואר כאן. יש לציין כי למרות יחסי הגומלין בין תאים חיסוניים שניתן להעריכו במודלים של העכבר syngeneic, הם אולי לא במדויק מסכם את הדברים אינטראקציה עם בני אדם אין ויוו. במיוחד הערה, אנושי, עכבר מכוניות ישתנו במבנה אשר עשויות להיות השלכות במורד הזרם; הפעלת ותא תרבות תנאים אופטימליים צמיחה של תאי T שונים20, הפצה רקמת המטרה אנטיגן הביטוי עשוי להשתנות בין בני אדם ועכברים, רעילות מנוסים עשויים להיות שונים בתכלית. לכן חיוני כדי לנצל ex-vivo ומודלים xenogeneic כדי לאמת את התוצאות.
לסיכום, syngeneic lymphodepleted ואת lymphoreplete הדגם של לימפומה מסכם את הדברים מטופלים עם או בלי כימותרפיה קודמת/הקרנות. זה מספק מערכת מודל שבו לחקות את ההגדרות קליניים כדי לאפשר בדיקה של מגוון של אסטרטגיות טיפוליות אשר יהיה חשוב עם הגל הקרוב של סוכנים חדשים טיפול המערכת החיסונית.
עם השימוש של מיזוג מראש, יש לציין כי כל העכברים נקה בדרך כלל הלימפומה. עם למעלה מענה מלא 90% תעריפי בבני אדם, זהו נציג. אולם, האתגרים לטיפול CD19 המכונית T-cell נתלו. על מניעת התדר של הישנות ציין כי הם לעיתים קרובות CD19. תיקרנה מדי לא נצפו במודל זה עד, ולעתים קרובות מעבר 100 ימים. שינויים כדי לחקות את הישנות ראיתי במרפאה יכול לעזור עם האתגרים העתידיים של טיפול רכב CD19 T-cell.

Chimeric אנטיגן קולטן (מכונית) T-cell טיפול הראו הצלחה קלינית מדהים לטיפול CD19+ ממאירות מובילים לאישור tisagenlecleucel הישנות לוקמיה לימפובלסטית חריפה1 , axicabtagene ciloleucel מתקדמת גדולים B-cell לימפומה שאינה הודג'קין2 -2017.
החשיבות של אינטראקציות בין סרטן לבין המערכת החיסונית התקדמות המחלה והן מנגנונים טיפולית הופך להיות מוכר יותר ויותר3,4,5. לדוגמה, זה מתועד היטב כי הגידול microenvironment (טיים) הוא מוצף הגורמים יכול לדכא את הפונקציות אפקטור של תאים חיסוניים-6,-7,-8. לחלופין לקרקע של תאים חיסוניים אנדוגני והפצת epitope יכול להיות המפתח הגידול מיגור עמידות לטווח ארוך הגידול אתגר9,10. שתי תופעות אלו לא ניתן להעריך בדגמי xenogeneic חוסר מערכת חיסונית. באופן דומה, למערכות ניצול חלבונים הטרנסגניים אינן משקפות במדויק את האתגר של שבירת סובלנות המערכת החיסונית, אשר נדרש עבור epitope הפצת11,12. דגם syngeneic עם מערכת החיסון מתפקדת במלואה, לפיכך, הוא בעל חשיבות עליונה עבור מידול היבטים חשובים אלה של הרפוי התקדמות, החיסון של מחלות סרטן.
הקונה חשוב של המכונית T-cell טיפול הוא מיזוג מראש lymphodepleting נדרש עבור הצלחה טיפולית13,14. זו מושגת בדרך כלל בחולים על ידי מתן כימותרפיה לפני אינפוזיה של המכונית T תאים15,16. בתור שיטה סטנדרטית, כדי לחקות lymphodepletion נעשה שימוש בהגדרה החולה, אנחנו מפקחים על 5 Gy גופית (TBI) כדי להשיג את lymphodepletion לפני ניהול של תאי T המכונית טיפולית לעכברים הנושאת מערכתית A20 B-cell לימפומה.
בעוד lymphodepleting מיזוג מראש אינה בעיה עבור רוב החולים, רעילות שמגיע עם סוכנים כימותרפיות אומר כי מטופלים של מצב ביצועים נמוכים אינם זכאים לטיפול המכונית T-cell. כדי ליצור מערכת הבדיקה המייצג את המטופלים מושעים. lymphodepletion, הקמנו העכבר syngeneic lymphoreplete מודל שבו אנחנו דגם המכונית T-cell טיפול של לימפומה. במודל זה, הראינו כי ההפרשה של IL-12 מ בתוך תאי T המכונית יכול להוביל מיגור לימפומה הוקמה עם שיעור הצלחה של ~ 25%17. יתר על כן, הראינו כי תאים חיסוניים אנדוגני היו מעורבים מיגור הסרטן.
כאן נתאר בפירוט הפרוטוקול עבור הייצור של תאי T רכב העכבר, הקמת לימפומה עכברים syngeneic, וטיפול של לימפומה עם המכונית T תאים עם או ללא שימוש lymphodepleting מיזוג מראש. זה יכול לשמש ללימודי שילוב של תאי T המכונית עם סוכנים אחרים, בדיקות רכב T תאים עם אחרים transgenes או לשימוש של אסטרטגיות טיפול או חיסוני אחרים בתא המאמצת נגד לימפומה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>FC121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>FC122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5ml pestle and microtube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>431-0098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X penicillin-streptomycin-glutamine (PSG)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (50 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidine S hydrochloride</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>15205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle Top Filter (0.2 &#181;m)</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>FIL8192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 711 anti-mouse CD8a Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100759</td>
			<td>1 in 100 staining dilution. Clone 53-6.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 785 anti-mouse CD4 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100552</td>
			<td>1 in 100 staining dilution. Clone RM4-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting beads &#8211; CountBright absolute counting beads</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 100&#956;m</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclophosphamide Monohydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>239785-1GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle medium (DMEM) - High Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11131D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE17-1440-03</td>
			<td>Sold by Sigma- Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer - LSR Fortessa x20</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>658222R1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemacytometer</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>HC001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>H0887&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-12 p70 Mouse Uncoated ELISA Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>88-7121-76</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL2, Proleukin</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>PL 00101/0936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>in vivo bioluminescence imaging system &#8211; in vivo xtreme II imaging system</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>T149094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin Calcium Salt</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>I0634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/dead stain - Zombie Violet Fixable Viability Kit</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423114</td>
			<td>1 in 100 staining dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer - Lumistart Omega</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>415-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine IFN-&#947; ELISA kit</td>
			<td>Diaclone</td>
			<td>861.050.010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>16005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCL-Eco</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP229540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum E cell line</td>
			<td>Cell Biolabs</td>
			<td>RV-101</td>
			<td>(RRID:CVCL_B488)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553294</td>
			<td>Clone &#160;37.51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3&#949;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553057</td>
			<td>Clone &#160;145-2C11&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553142</td>
			<td>1 in 100 staining dilution. Clone 2.4G2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human fibronectin fragment - RetroNectin Reagent</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-7 (carrier-free)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>577806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red cell lysis buffer</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>004-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-167F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin - EDTA solution</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>T3924&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XenoLight D-Luciferin</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>122799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a syngeneic mouse b-cell lymphoma model for pre-clinical evaluation of cd19 car t cells

להצלחת קליני מדהים CD19 chimeric אנטיגן קולטן (מכונית) T-cell טיפול הוביל לאישור של הדור השני שני רצפטורים chimeric אנטיגן (מכוניות) עבור לוקמיה לימפובלסטית חריפה (ALL) andnon הודג'קין (NHL). המוקד של השדה הוא עכשיו על חיקוי הצלחות אלה אחרים ממאירות hematological היכן שנצפו המחירים מענה מלא פחות מרשים. הנדסה נוספים של תאי T רכב או ניהול משותף של אחרים לטיפול לאופנים עשוי בהצלחה להתגבר על מכשולים בפני טיפול מוצלח בהגדרות אחרות סרטן.
לכן נציג מודל שבו אחרים יכולים לנהל בדיקות קדם-קליניות של תאי T המכונית CD19. תוצאות ב B-cell לימפומה המודל גם בדקה נוטים להיות אינפורמטיבי המכונית T-cell טיפול באופן כללי.
פרוטוקול זה מאפשר ייצור לשחזור של העכבר בתאי T המכונית דרך סידן פוספט תרביות תאים, התאים מפיק Plat-E עם בונה retroviral MP71 ו- pCL-Eco אריזה פלסמיד ואחריו אוסף של חלקיקים retroviral המופרש, התמרה חושית באמצעות המקטע fibronectin האנושי רקומביננטי וגם צנטריפוגה. אימות של retroviral התמרה חושית, אישור על היכולת של תאי T המכונית להרוג היעד לימפומה תאים ex-vivo, באמצעות cytometry זרימה, luminometry ו- immunosorbent מקושרים-אנזים assay (אליסה), גם מתואר.
פרוטוקולים לבדיקת רכב T תאים ויוו ב lymphoreplete, עכברים syngeneic lymphodepleted, הנושאת לימפומה הוקמה, מערכתית מתוארים. פעילות נגד סרטן נמצא בפיקוח ויוו ביולומינסנציה ומחלות התקדמות. אנחנו מראים תוצאות טיפוסיות של מיגור הוקמה B-cell לימפומה כאשר ניצול 1סנט או דור 2nd מכוניות בשילוב עם מיזוג טרום lymphodepleting, מיעוט של עכברים בהשגת הפוגות לטווח ארוך כאשר ניצול המכונית T תאים המבטאים IL-12 בעכברים lymphoreplete.
פרוטוקולים אלה ניתן להשתמש כדי להעריך בתאי T המכונית CD19 בשינוי נוספים שונים, שילובים של תאי T רכב וסוכני טיפוליים אחרים או הותאם לשימוש של תאי T מכונית נגד אנטיגנים היעד שונה.

עבור התמרה חושית של תאי T יעילות גבוהה, יש צורך להשיג את חלקיקי retroviral טריים. תרביות תאים של הקו תא Plat-E עם pCL-Eco מפיק פלסמיד, pMP71 הרטרווירוס פלסמיד מעורר הפרשת חלקיקים retroviral לתוך התא supernatant. כאשר הגן סמן פלורסנט, כגון mCherry, מקודד את הרטרווירוס, תרביות תאים מוצלח יכול להיות מאושרות על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ (איור 1). תגובת שיקוע המכיל וירוס מתאי Plat-E transfected משמש מגלי בתאי T באמצעות 2 סיבובים של ספין-fection על צלחות מצופה פרגמנט fibronectin. ניתן לקבוע את היעילות של התמרה חושית 4 ימים פוסט התמרה חושית ויה cytometry זרימה. בהצלחה transduced התאים לבטא את הגן סמן המקודדת את הרטרווירוס (איור 2). התמרה חושית יעילות בטווח שבין ~ 50-90% יעילות עם קולטני הדור הראשון ~ 10-40% עם המכונית בונה קרוב הקיבולת retroviral אריזה. בעוד התבטאות גנים מרקר מראה התמרה חושית retroviral מוצלח, הוא בעל חשיבות עליונה כדי להציג את הפונקציונליות של תאי T המכונית בעת עיסוק עם תאים זה אנטיגן מטרה מפורשת על פני השטח שלהם. שורות תאים יעד שונה כדי לוציפראז אקספרס יכולים לשמש לוציפראז מבחני כדי לבדוק את מידת תא-להרוג על-ידי תאי T רכב ישירות (איור 3 א). שחרורו של אפקטור ציטוקינים מתאי T המכונית על תרבות משותפת עם תאי היעד, נקבע על ידי אליסה, יכול לשמש גם כאמצעי עקיף של המכונית T תא cytotoxicity (איור 3B ו- 3 C).
תאי T רכב מיוצר פרוטוקול זה ניתן להעריך בעכברים lymphoreplete על ידי הקמת לימפומה A20 מערכתית עם מנה 100 מ"ג/ק"ג של ציקלופוספאמיד (מוזרק לווריד), עד יום אחד לפני הזרקת הרביעי של 5 x 105 A20 תאים (איור 4). הזרקת ה-IP עם luciferin ו לכידת תמונה באמצעות של imager ביולומינסנציה ויוו ניתן לעקוב אחר נטל הגידול באמצעות זמן ROI וחשיפה קבועים לאורך (איור 5 א-ג). תאי T מכונית שונה כדי express IL-12 מסוגלים ולחסל לימפומה מערכתית עם lymphodepleting מראש מיזוג נותן הישרדות ללא מחלה בכ-25% של עכברים (איור 5D). Lymphodepleting preconditioning, מושגת על ידי 5 Gy TBI עד יום אחד לפני המינהל הרביעי של תאי T המכונית, משפר באופן משמעותי engraftment (איור 6). במודל זה, דור ראשון רכב T תאים המסוגלים ולחסל מערכתית לימפומה A20, בדרך כלל גרימת מחלות הישרדות ב- 100% של עכברים (איור 7).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig1.jpg"> איור 1. אישור תקנים מוצלחת של תאים Plat E. Plat-E תאים transfected עם retroviral לבנות מכונית וזה pMP71 pcl-Eco אריזה וקטור פלסמיד ה-DNA. תרביות תאים מוצלחת מוצג על ידי ביטוי של הגן סמן פלורסנט mCherry. א) מיקרוסקופיית שדה בהיר, B) קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ ו ג) התמונות הממוזגות מוצגים. הגדלה = 50 X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig2.jpg"> באיור 2. קביעת התמרה חושית יעילות על ידי cytometry זרימה. Cytometry זרימה משמש כדי לקבוע את היעילות התמרה חושית של התאים בעכבר כדי אינטראקצ על פוסט יום 4 התמרה חושית, באמצעות UV זומבי חי/מת, mCherry, BV711, BV785 איתור חיים, מכונית לבנות, תאי CD4 ו CD8, בהתאמה. התוצאות נציג של א) Non-transduced, ב) mCherry.αmCD19.mCD3z ו ג) mCherry.αmCD19.mCD3z.mIL12 מוצגים עם gating 1) ללבישה 2) לחיות תאים 3) CD4 ו CD8 4) ו- 5) הערכה של mCherry תאים חיובית המבטאת את המכונית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig3.jpg"> איור 3. אימות של המכונית T-cell פעילות. תאי T המכונית αmCD19 היו בתרבית במשותף עם תאים לימפומה A20 שונה כדי לוציפראז אקספרס (1 x 104: 1 x 104) עבור h 16 בצלחת התחתונה U 96-ובכן. אחרי תרבות משותפת, התאים היו מגורען, ואת תגובת שיקוע נאסף. A) התאים היו מתיחה מחדש ב- PBS, luminometry שימש להערכת הכדאיות של תאי היעד. תגובת שיקוע מתרבות שיתוף הוערכה לנוכחות של IFNγ (B) ו- IL-12 (ג). היחס של תא T המכונית לתאי המטרה, אורך תקופת תרבות משותפת חייב להיות מותאם לכל מכונית לבנות והקצו שורת התאים. ובחום וטיפול ionomycin יכול לשמש כפקד חיובי כדי לוודא איכות תאי T ותאי שלהם יכולת להגיב. קווי שגיאה הצג SD. Statistical והניתוח נעשה שימוש חד-כיווני אנובה. p < 0.001). איור זה השתנה מ17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig4.jpg"> באיור 4. הקמת A20 לימפומה בלי lymphodepletion. ציקלופוספמיד יכול להגביר את היעילות של לימפומה אינדוקציה מבלי לגרום lymphodepletion. A) ספירת דם של עכברים BALB/c 6-8-בת שבוע לאחר מסירת 100 מ"ג/ק"ג של ציקלופוספאמיד IV. קווי שגיאה הצג SD B) לימפומה הנטל של 6-8-בת שבוע עכברים BALB/c לאחר משלוח הרביעי של 100 מ"ג לק"ג ציקלופוספאמיד או תמיסת מלח ביום-1 ואספקה הרביעי של 5 x 105 A20 תאים ביום 0 הנמדד באמצעות luminometer של. C) הישרדות של עכברים ב- B). קווי שגיאה הצג SD. Statistical והניתוח נעשה באמצעות 2-way ANOVA. * * p < 0.01, * * * p < 0.001). דמות זו שונתה מ. Kueberuwa et al. 17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig5.jpg"> איור 5. ניטור נטל לימפומה הישרדות. עכברים הנושאת לימפומה A20 לבטא לוציפראז מקבלים 100 µL בקרום הבטן (IP) זריקות של 30 מ"ג/מ"ל luciferin, היו עם תמונה באמצעות ביולומינסנציה של ויוו מערכת הדמיה. א) עכברים היו חשופים ב 1 דקות על הצד הבטני, מיד התהפכה התמונה הגבי לאסוף את ההמונים גידול משני הצדדים של הגופים (B). C) התוצאות נציג מנטל לימפומה BALB/c עכברים שקיבלו αmCD19 משתנות המכונית T תאים ללא lymphodepletion. קווי שגיאה הצג ב- SEM D) שיעור ההישרדות של העכברים אותו. דמות זו שונתה מ. Kueberuwa et al. 17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig6.jpg"> איור 6. השפעות lymphodepletion. A) ספירת דם של עכברים BALB/c 6-8-בת שבוע לאחר קבלת 5 Gy TBI בקצב במינון של 0.02 נקודות Gy/דקה; קווי שגיאה הצג SD. Statistical ניתוח מאת אנובה דו-כיווני. p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001. B) ניטור של CD4+ ו CD8+ המכונית T תאים בדם ההיקפי של עכברים מאת cytometry זרימה עבור המינהל פוסט mCherry 7 ימים ג'ין סמן. קווי שגיאה להראות SD. דמות זו שונתה מ. Kueberuwa et al. 17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig7.jpg"> איור 7. רכב תא T פעילות עם מיזוג מראש lymphodepleting. תוצאות טיפוסי שמראה את השפעת 5 Gy TBI ביום שלפני מינהל הרכב T-cell. א) גרפית הדמיה ו- (ב) הדמיה של עכברים לאחר 100 µL בקרום הבטן (IP) זריקות של 30 מ"ג/מ"ל luciferin באמצעות ביולומינסנציה של ויוו מערכת הדמיה. קווי שגיאה הצג ב- SEM C) ההישרדות של העכברים אותו. איור זה היה. שונה fromKueberuwa et al. 17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells at JoVE.com

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

עכבר Syngeneic B-Cell לימפומה מודל להערכת קליניים בתאי T המכונית CD19

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול עבור ייצור ובדיקות קדם-קליניות של תאי T המכונית CD19 מאתר על ידי התמרה חושית retroviral וסילוק כטיפול נגד לימפומה A20 B-cell syngeneic שהוקמו בעכברים BALB/c עם או בלי lymphodepleting מיזוג מראש.

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

שיטה זו יכולה לעזור לנו לענות על שאלות מפתח בתחום הטיפול החיסוני CAR T-cell, כגון שינוי גנטי של תאי T CAR ושילוב עם טיפולים חיסוניים אחרים. היתרון העיקרי של טכניקה זו היא המאפשרת השוואות בין גדוש לימפו לבין הגדרות לימפו מדולדל. זה מאפשר לנו לראות את התפקיד של תאים חיסוניים אנדוגני הן התקדמות המחלה ואת האינטראקציה שלהם עם תאים T-תאים רכב טיפולי.המשמעות של טכניקה זו כמו 10 לטיפול על אבחון של גידול מוצק כי הלקחים שנלמדו במודל זה ניתן לתרגם ישירות לבית של ממתקים עם מטרות אחרות כגון CEA. כדי להתחיל בהליך זה. תחילה, הכן את כל המדיה והתאים הדרושים כמפורט בפרוטוקול הטקסט. ביום הראשון במנות תרבות DMEM שלמות עד 15 ס"מ מרובע. זרעים 7.5 מיליון פלטינה E-תאים במנות אלה דגירה לילה ב 37

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

קרצינומה תא syngeneic עכבר הדגם של גרורתי כליות עבור הערכה כמותית אורך ורוחב של טיפולים פרה-קליניים

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

Engraftment גידול במודל של עכברים Xenograft של האדם מנטל לימפומה התא

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

דגם העכבר סרטן הלבלב Syngeneic ללמוד את השפעות בלתי הפיכות אלקטרופורציה

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

Orthotopic השתלת ריאות Syngeneic תאים אדנוקרצינומה ללמוד ביטוי PD-L1

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

וזמינותו הרג ספרואיד על-ידי תאי T המכונית

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

שימוש CRISPR/Cas9 כדי לשדוד את GM-שדרתי ב-T מכונית תאים

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

ייצור בצ הקולטן אנטיגן (רכב) T תאים לטיפול חיסוני המאמצת

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

אולטרה סאונד-הדרכה אורתודפית של הלבלב מורלין אדנוקרצינומה

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

A Syngeneic Orthotopic Osteosarcoma Sprague Dawley Rat Model with Amputation to Control Metastasis Rate

מודל עכברוש אוסטאוסרקומה סנגנית אורתוטופית עם קטיעה כדי לשלוט בקצב גרורות

The most recent advance in the treatment of osteosarcoma (OS) occurred in the 1980s when multi-agent chemotherapy was shown to improve overall survival ...

Natural Killer (NK) and CAR-NK Cell Expansion Method using Membrane Bound-IL-21-Modified B Cell Line

Natural Killer NK and CAR-NK Cell Expansion Method using Membrane Bound-IL-21-Modified B Cell Line

הריג טבעי (NK) ושיטת הרחבת תאי CAR-NK באמצעות קו תאי B מאוגד-IL-21-שונה

Chimeric antigen receptor (CAR)-modified immune cell therapy has become an emerging treatment for cancers and infectious diseases. NK-based immunotherapy, ...