Name: a syngeneic mouse b-cell lymphoma model for pre-clinical evaluation of cd19 car t cells
Uploaded: 2018-10-16T15:00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells at JoVE.com

우리는이 연구 (그랜트 13031)와 CRUK 맨체스터 생물 자원 단위, 이미징 및 cytometry 및 분자 생물학 핵심 시설이이 작업을 지원 하기 위한 자금에 대 한 Bloodwise를 감사 하 고 싶습니다.

<ol>
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Food and Drugs Administration Biologics Licence Application Approval letter Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/cellulargenetherapyproducts/approvedproducts/ucm581259.pdf">https://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/cellulargenetherapyproducts/approvedproducts/ucm581259.pdf</a> (2017)</li><li>Liu, Y., Zeng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+and+Innate+Immune+System+Interactions:+Translational+Potentials+for+Cancer+Immunotherapy.">Cancer and Innate Immune System Interactions: Translational Potentials for Cancer Immunotherapy.</a> Journal of Immunotherapy. 35 (4), 299-308 (2012).</li><li>Janssen, L. M. E., Ramsay, E. E., Logsdon, C. D., Overwijk, W. 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데이비드 Gilham 차 T 세포의 생산에서 포함 되는 Celyad에 대 한 작동 합니다. 작가의 나머지가 없다 공개 수 있습니다.

Syngeneic 마우스 모델 그대로 면역 시스템을 유지 하면서 질병 진행 및 치료의 테스트 수 있습니다. 이것은 파라마운트 immunotherapeutic 에이전트에 대 한 특히에서 면역 체계와 상호 작용 하는 치료에 관해서입니다.
여기에 설명 된 프로토콜은 두 가지 중요 한 작업 흐름, 첫 번째 자동차를 표현 하기 위해 마우스 T 셀을 수정 하 고 유전자. 이 변환의 유효성 검사 개시 7 일 필요합니다. 자동차 T 세포의 생산을 수 반하는 생쥐에서 조직의 림프의 설립이 이다. 자동차 T 세포 생산 실패 하거나 품질 되 고 부족, 거기 아니다 일반적으로 충분 한 시간 전에 마우스 대체 전지를 생산 하는 림프 종에 굴복 해야 합니다. 따라서 연구팀은 정확 하 게이 모델을 사용 하 여 성공적으로 치료 관리에 대 한 자동차 T 세포의 생산을 시간 순서 종양 투약 하 고 질병 진행 연구를 수행 하는 중요 한 이다.
낮은 T-셀 변환 효율에 대 한 일반적인 이유는 프로듀서 셀, 일반적으로 불 쌍 한 플라스 미드 순도 또는 transfection 미디어의 pH의 부정확 한 결정으로 인 한 가난한 transfection 효율 포함 되어 있습니다. 가난한 transfection T-셀 변환 효율 제한으로 전체 프로토콜 함께 진행 하기 전에 프로듀서 셀 transfection 효율을 확인 하는 것이 좋습니다. 그러나 재조합 인간 fibronectin 조각 수집 될 수 있으며 다시 사용 하는,-20 ° C에, 감소 된 변환 효율성에 여러 동결 해빙 결과 저장. 마우스 spleens 후 컬렉션은 또한 높은 얻는 것이 중요의 신속한 처리 가능한 T 세포의 생성 합니다.
여기에 설명 된 프로토콜 A20 셀 luciferase 표현 활용을 주목 한다. 이것은 선호 생물 발광 영상으로 조직의 종양 부담을 측정 하는 능력을 제공 합니다. 그러나, 기능적인 면역 체계의 존재 luciferase 응답 결과 왜곡 수 있습니다. 이전 마커 transgenes17에 쥐를 살아 나 기의 면역 반응을 테스트 했습니다. 그것은 이러한 면역 세포에 의해 종양 퇴치에 중요 한 역할을 재생 하지 않는 유효성을 A20 셀 transgenes의 무료를 사용 하 여 주요 실험을 복제 열쇠입니다.
임상 에이전트 사용 vivo에서 면역 결핍 생쥐에서 하실 수 있습니다, 하는 동안 마우스 암 세포에 대 한 마우스 자동차 T 세포를 사용 하 여 우리가 치료 효능 또는 질병 진행에 면역 체계의 기여를 평가 수 있습니다. 이 프로토콜 B-세포 림프 종 또는 IL-12 여기에 설명 된 대로의 분 비 등 추가 수정와 다른 자동차를 대상으로 하는 자동차의 전 임상 평가 위해 활용 될 수 있습니다. 그것은 그 면역 세포 사이 상호 작용 syngeneic 마우스 모델에서 평가 될 수 있습니다, 하지만 그들은 수 있습니다 하지 정확 하 게 정리 vivo에서인간 상호 작용을 언급 해야 합니다. 특히의, 인간 및 마우스 자동차 구조는 다운스트림 결과;에 달라 집니다. T 세포의 성장 위한 최적 활성화 및 셀 문화 조건에 다른20, 대상 항 식의 조직 분포 인간과 쥐 사이 다를 수 있습니다 및 경험 있는 독성 근본적으로 다를 수 있습니다. 그러므로 전 비보 및 결과 승산이 xenogeneic 모델 활용 필수적 이다.
요약 하자면, syngeneic lymphodepleted 및 lymphoreplete 모델의 림프 종 환자와 이전 항 암 치료/방사선 치료 없이 정리. 이 다양 한 새로운 면역 치료 대리인의 오는 파도와 중요 한 치료 전략의 테스트 수 있도록 임상 설정을 모방 하는 모델 시스템을 제공 합니다.
사전 컨디셔닝의 사용, 그것은 모든 마우스는 일반적으로 림프 종 선택을 취소 표시 됩니다. 와 최대 90% 완료 응답 속도 인간에서는, 이것은 대표입니다. 그러나 CD19 차 T-세포 치료에 대 한 도전을 relapses 관찰의 높은 주파수를 방지에 경첩 것입니다, 그는 종종 CD19. Relapses 하지 관찰 되었습니다이 모델에서, 그리고 종종 100 일 넘어. 병원에서 본 relapses 모방 수정 CD19 차 T-세포 치료의 미래 과제 도울 수 있었다.

공상 항 원 수용 체 (자동차) T-세포 치료의 CD19 치료에 놀라운 임상 성공을 보이고 있다+ 재발된 급성 림프 구성 백혈병1 과 axicabtagene tisagenlecleucel의 승인에 지도 하는 악성 종양 진보적인 큰 B-세포 비 Hodgkin 림프 종2 2017에 대 한 ciloleucel.
암과 질병의 진행 및 치료 메커니즘 모두에서 면역 체계 사이 상호 작용의 중요성은 점점 더 인식된3,4,되 고5. 예, 그것은 잘 종양 microenvironment (TME) 면역 세포6,,78의 이펙터 기능을 억제할 수 있는 요인으로 맞이 하 게 됩니다 문서화. 또는 생 면역 세포와 epitope 확산 못쓰게 종양 퇴치 및 장기 저항 종양 도전9,10키 수 있습니다. 이러한 현상의 둘 다 면역 체계가 부족 xenogeneic 모델에서 평가할 수 없습니다. 마찬가지로, 유전자 변형 단백질을 이용 하 여 시스템 epitope11,12확산에 필요한 면역 관용을 깨는 도전을 정확 하 게 반영 하지 않습니다. 따라서, 완전 한 기능 면역 체계와 syngeneic 모델은 암 질병 진행 및 면역 치료제의 이러한 중요 한 측면을 모델링을 위한 파라마운트.
자동차 T-세포 치료의 중요 한 경고 lymphodepleting 사전 조절 치료 성공13,14필요 하다는 것 이다. 이것은 일반적으로 자동차 T 세포15,16의 주입 전에 화학요법을 투여 하 여 환자에 달성 된다. 표준 방법으로 환자의 설정에서 사용 하는 lymphodepletion를 모방 하기 위해 우리 관리 5 Gy 총 몸 방사선 조사 (TBI) 마우스 베어링 조직의 A20 B-세포 림프 종 치료 차 T 세포의 이전 lymphodepletion를 달성 하기 위해.
Lymphodepleting 사전 컨디셔닝 대부분의 환자에 대 한 문제가 되지 않습니다, 하는 동안 화학요법 에이전트와 함께 제공 되는 독성의 낮은 성능 상태 환자 차 T-세포 치료 받을 수 있습니다 의미 합니다. Lymphodepletion에 대 한 부적격 환자를 나타내는 테스트 시스템을 만들려면, 우리는 우리가 자동차 T-세포 림프 종 치료 모델 lymphoreplete syngeneic 마우스 모델 설립. 이 모델에서 차 T 세포 내에서 IL-12의 분 비의 성공률와 함께 설립된 림프의 박멸 이어질 수 살펴보았습니다 ~ 2517. 또한, 우리는 내 생 면역 세포 암 퇴치에 참여 했다 보였다.
여기 우리가 자세히 설명 마우스 자동차 T 세포의 생산을 위한 프로토콜 syngeneic 쥐 및 또는 lymphodepleting 사전 컨디셔닝의 사용 없이 차 T 세포 림프 종 치료에 림프 종 설립. 이 다른 transgenes 차 T 세포를 테스트 하는 다른 에이전트와 자동차 T 세포의 조합 연구 또는 림프 종에 대 한 다른 입양 세포 치료 또는 immunotherapy 전략의 사용에 대 한 사용할 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>FC121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>FC122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5ml pestle and microtube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>431-0098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X penicillin-streptomycin-glutamine (PSG)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (50 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidine S hydrochloride</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>15205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle Top Filter (0.2 &#181;m)</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>FIL8192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 711 anti-mouse CD8a Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100759</td>
			<td>1 in 100 staining dilution. Clone 53-6.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 785 anti-mouse CD4 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100552</td>
			<td>1 in 100 staining dilution. Clone RM4-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting beads &#8211; CountBright absolute counting beads</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 100&#956;m</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclophosphamide Monohydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>239785-1GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle medium (DMEM) - High Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11131D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE17-1440-03</td>
			<td>Sold by Sigma- Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer - LSR Fortessa x20</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>658222R1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemacytometer</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>HC001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>H0887&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-12 p70 Mouse Uncoated ELISA Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>88-7121-76</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL2, Proleukin</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>PL 00101/0936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>in vivo bioluminescence imaging system &#8211; in vivo xtreme II imaging system</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>T149094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin Calcium Salt</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>I0634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/dead stain - Zombie Violet Fixable Viability Kit</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423114</td>
			<td>1 in 100 staining dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer - Lumistart Omega</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>415-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine IFN-&#947; ELISA kit</td>
			<td>Diaclone</td>
			<td>861.050.010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>16005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCL-Eco</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP229540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum E cell line</td>
			<td>Cell Biolabs</td>
			<td>RV-101</td>
			<td>(RRID:CVCL_B488)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553294</td>
			<td>Clone &#160;37.51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3&#949;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553057</td>
			<td>Clone &#160;145-2C11&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553142</td>
			<td>1 in 100 staining dilution. Clone 2.4G2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human fibronectin fragment - RetroNectin Reagent</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>T100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-7 (carrier-free)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>577806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red cell lysis buffer</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>004-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-167F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin - EDTA solution</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>T3924&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XenoLight D-Luciferin</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>122799</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a syngeneic mouse b-cell lymphoma model for pre-clinical evaluation of cd19 car t cells

CD19 공상 항 원 수용 체 (자동차) T-세포 치료의 놀라운 임상 성공 급성 림프 구성 백혈병 (ALL) andnon-Hodgkin 림프 종 (NHL)에 대 한 두 번째 세대 공상 항 원 수용 체 (자동차)의 승인을 주도하 고 있다. 필드의 초점은 이제 덜 인상적 완전 한 응답 속도 관찰 된다 다른 혈액 악성 종양에서 이러한 성공을 모방에 있습니다. 자동차 T 세포 또는 다른 치료 modalities의 공동 관리의 엔지니어링 추가 다른 암 설정에서 성공적인 치료에 장애물 극복 성공적으로 수 있습니다.
우리는 따라서 다른 CD19 자동차 T 세포의 전 임상 테스트 수행할 수 있는 모델을 제시. 이 테스트 B-세포 림프 종 모델 결과 일반적으로 유익한 자동차 T-세포 치료 될 것.
이 프로토콜을 사용 마우스의 재현 생산 MP71 retroviral 구조와 pCL 에코 포장 플라스 미드 retroviral 입자 분 비의 컬렉션 뒤 같은 E 프로듀서 셀 칼슘 인산 염 transfection 통해 자동차 T 세포와 재조합 인간 fibronectin 조각 및 원심 분리를 사용 하 여 변환입니다. Retroviral 변환의 유효성 검사 및 확인 대상 림프 종 세포 vivo ex, cytometry, luminometry 및 효소 연결 된 immunosorbent 사용 죽 차 T 세포 수의 시험 (ELISA), 또한 설명.
프로토콜 테스트 차 T 세포 vivo에서 lymphoreplete에 고 lymphodepleted syngeneic 마우스, 베어링 설립, 조직 림프 종 같습니다. 안티-암 활동 vivo에서 생물 발광 및 질병 진행에 의해 모니터링 됩니다. 우리 때 1세인트 또는 lymphodepleting 사전 및 자동차 T를 활용 하 여 장기 remissions 달성 하는 쥐의 소수와 함께 2차 세대 자동차 설립된 B-세포 림프 종의 근절의 전형적인 결과 보여 셀 lymphoreplete 쥐에 IL-12를 표현입니다.
이러한 프로토콜은 다른 추가 수정, 차 T 세포의 조합 및 다른 치료제와 CD19 차 T 세포를 평가 하는 데 사용 하거나 다른 대상 항 원에 대 한 자동차 T 세포의 사용을 위해 적응 수 있습니다.

T 세포의 고효율 변환에 대 한 신선한 retroviral 입자를 얻을 필요가 있다. PMP71 레트로 바이러스 플라스 미드 pCL 에코 프로듀서 플라스 미드와 같은 E 셀 라인의 transfection retroviral 입자의 분 비 세포 표면에 뜨는에 상승을 제공합니다. MCherry, 같은 형광 표식 유전자는 레트로 바이러스에서 인코딩된 때 성공적인 transfection 형광 현미경 검사 법 (그림 1)에 의해 확인할 수 있습니다. Transfected 같은 E 셀에서 상쾌한 바이러스를 포함 하는 T 세포를 통해 2 라운드 스핀 fection fibronectin 조각 코팅 접시에 transduce 데 사용 됩니다. 4 일 게시 cytometry 통해 변환 변환의 효율성을 확인할 수 있습니다. 성공적으로 불리고 셀 레트로 바이러스 (그림 2)에서 인코딩 표식 유전자를 표현 한다. 변환 효율성 범위에서 ~ 50-90% 효율을 1 세대 수용 체와 ~ 차 10-40% 가까이 retroviral 포장 용량 구성. 마커 유전자 발현 성공적인 retroviral 변환 보여줍니다, 그것은 그들의 표면에 그 표현 대상 항 원 세포와 매력적인 시 자동차 T 세포의 기능을 보여 최고. 대상 셀 라인 표현 luciferase 수정 직접 차 T 세포 (그림 3A)에 의해 셀 죽 일 정도의 테스트 luciferase 분석 실험에 사용할 수 있습니다. 대상 셀, ELISA, 정한 공동 문화 시 자동차 T 세포에서 이펙터 cytokines의 방출 자동차 T 세포 세포 독성 (그림 3B 와 3c)의 간접 측정으로도 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜에서 생산 하는 자동차 T 세포 조직의 A20 림프 종 (주입 정 맥), 1 일 5 x 105 A20 셀 (그림 4)의 IV 주입 전에 cyclophosphamide의 100mg/kg 복용량을 설정 하 여 lymphoreplete 마우스에 평가할 수 있습니다. 소 및 이미지 캡처 vivo에서 생물 발광 영상을 사용 하 여 IP 주입 종양 부담 (그림 5A-C)에 걸쳐 지속적인 투자 수익 및 노출 시간을 사용 하 여 모니터링 하는 데 사용할 수 있습니다. 자동차 T 세포 표현 IL-12 수정 lymphodepleting 사전 마우스 (그림 5D)의 약 25%에서 질병-무료 생존을 주는 조건으로 조직의 림프를 근절 할 수 있다. Lymphodepleting 늘어진, 5 달성 Gy TBI 자동차 T 세포의 4 행정에 앞서 1 일 크게 향상 engraftment (그림 6). 이 모델에서는 1 세대 자동차 T 세포 조직의 A20 림프 종, 일반적으로 유도 하는 쥐 (그림 7)의 100%의 질병-무료 생존을 근절 할 수 있다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig1.jpg"> 그림 1입니다. 같은 E 셀의 성공적인 transfection 확인. 같은 E 셀 retroviral 자동차 구조 및 pMP71와 pcl 에코 포장 벡터 플라스 미드 DNA 페. 성공적인 transfection mCherry 형광 표식 유전자의 표현에 의해 표시 됩니다. A) 밝은 분야 현미경 검사 법, B) 형광 현미경 검사 법 및 C) 병합 된 이미지 표시 됩니다. 확대 = 50 X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig2.jpg"> 그림 2입니다. Cytometry에 의해 변환 효율 결정. Cytometry 하루 4 게시물 변환, 좀비 UV 라이브/죽은, mCherry, BV711를 사용 하 여 마우스 T 셀의 변환 효율을 결정 하는 데 사용은 하 고 라이브의 검출에 대 한 BV785, 자동차 건설, c d 4와 CD8 세포, 각각. 대표적인 결과 A) 비 불리고, B) mCherry.αmCD19.mCD3z와 C) mCherry.αmCD19.mCD3z.mIL12 1의 게이팅 함께 표시 됩니다) Singlets 2) 라이브 셀 3) CD4, CD8 4)와 5) 자동차를 표현 하는 mCherry 긍정적인 세포의 평가. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig3.jpg"> 그림 3입니다. 자동차 T-세포 활동의 유효성 검사. ΑmCD19 차 T 세포 표현 luciferase 수정 A20 림프 종 세포와 공동 경작 했다 (1 x 104: 1 x 104) 16 h U-하단 96 잘 접시에 대 한. 후 공동 문화, 셀 했다 수송과, 그리고 상쾌한 수집. A) 셀 다시 PBS에 중단 되었고 luminometry 대상 셀의 가능성을 평가 하는 데 사용 되었다. 공동 문화에서 상쾌한 IFNγ (B) 및 IL-12 (C)의 존재에 대 한 평가 했다. 대상 셀에 자동차 T 세포의 비율 및 공동 문화 기간을 최적화 해야 합니다 각 자동차에 대 한 생성 하 고 대상 셀 라인. PMA와 ionomycin 치료 T 세포와 그들의 능력 세포 응답의 품질을 확인 하는 긍정적인 컨트롤로 사용할 수 있습니다. 오차 막대 표시 sd. 통계 분석 일방통행 ANOVA를 사용 하 여 수행 되었다. p < 0.001)입니다. 이 그림은17에서 수정 되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig4.jpg"> 그림 4입니다. A20 림프 종 lymphodepletion 없이 설정. Cyclophosphamide는 lymphodepletion를 일으키는 원인이 되기 없이 림프 종 유도의 효율성을 높일 수 있습니다. A) cyclophosphamide의 100 mg/kg의 4 납품 후 6-8 주-오래 된 BALB/c 마우스의 혈액 카운트. 오차 막대 표시 SD B) 4 배달 cyclophosphamide의 날-1 염 분 100 mg/kg의 하루는 루미 노를 사용 하 여 측정 하는 0에서 5 x 105 A20 셀 4 납품 후 6-8 주-오래 된 BALB/c 마우스의 림프 종 부담. 쥐의 C) 생존 B). 오차 막대 표시 sd. 통계 분석 2-웨이 ANOVA를 사용 하 여 수행 되었다. * * p < 0.01, * * * p < 0.001). 이 그림 Kueberuwa 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig5.jpg"> 그림 5입니다. 림프 종 및 생존 모니터링. A20 림프 luciferase 표현 베어링 마우스 30 mg/mL 소의 100 µ L 복 (IP) 주사를 받을 고는 vivo에서 생물 발광 이미징 시스템을 사용 하 여 몇 군데 있었다. A) 마우스 복 부 측에 1 분 동안 노출 되었고 즉시 이미지 시체 (B)의 양쪽에 대 한 종양 중 선택 등을 성을 상실. C) lymphodepletion 없이 다양 한 αmCD19 자동차 T 세포를 받는 BALB/c 마우스의 림프 종의 대표적인 결과. 오차 막대 표시 SEM. D) 같은 쥐의 생존 율. 이 그림 Kueberuwa 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig6.jpg"> 그림 6입니다. Lymphodepletion의 효과입니다. A) 0.02 Gy/분;의 복용량 비율 5 Gy TBI를 받은 후 6-8 주-오래 된 BALB/c 마우스의 혈액 카운트 오차 막대 표시 양방향 ANOVA sd. 통계 분석. p < 0.05 * * p < 0.01, * * * p < 0.001. B) CD4의 모니터링+ 와 CD8 cytometry mCherry 마커 유전자 7 일 게시물 관리에 대 한에 의해 쥐의 말 초 혈액에서+ 차 T 세포. 오차 막대 표시 sd. 이 그림 Kueberuwa 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig7.jpg"> 그림 7입니다. Lymphodepleting 사전 조화 차 T 세포 활동. 일반적인 결과 전날 차 T-셀 관리 5 Gy TBI의 영향을 보여주는. A) 는 vivo에서 생물 발광 이미징 시스템을 사용 하 여 30 mg/mL 소의 100 µ L 복 (IP) 주사 후 쥐의 이미징의 이미징 및 (B) 그래픽 표시. 오차 막대 표시 SEM. C) 같은 쥐의 생존. 이 그림은 수정 된 fromKueberuwa 그 외 여러분 되었습니다. 17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

CD19 자동차 T 세포의 전 임상 평가 위한 Syngeneic 마우스 B-세포 림프 종 모델

여기, 우리가 현재 생산과 retroviral 변환 및 또는 lymphodepleting 없이 BALB/c 마우스에서 설립된 syngeneic A20 B-세포 림프 종에 대 한 치료로 활용 하 여 murine CD19 차 T 세포의 전 임상 시험에 대 한 프로토콜 미리 컨디셔닝.

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

이 방법은 CAR T 세포의 유전 적 변형 및 다른 면역 요법과의 조합과 같은 CAR T 세포 면역 요법 분야에서 중요한 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 림프절과 림프절 설정 사이의 비교를 허용하는 것입니다. 이것은 우리가 질병 진행과 치료 CAR T 세포와의 상호 작용 모두에서 내인성 면역 세포의 역할을 볼 수 있습니다.이 모델에서 배운 교훈이 CEA와 같은 다른 표적과 사탕의 집으로 직접 번역 될 수 있기 때문에 고형 종양의 진단에 치료에 10이 기술의 의미. 이 절차를 시작합니다. 먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 필요한 모든 미디어와 셀을 준비합니다. 첫날에는 DMEM에서 15 평방 센티미터 문화 요리에 이르기까지. 이 요리에 750 만 백금 E 세포 씨앗과 37에서 하룻밤 배양

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

전임상 치료의 양적 및 종 방향 평가를위한 동계 마우스 모델 전이성의 신장 세포 암

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

연구

암 연구학

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

인간의 맨 틀 세포 림프 종의이 종이 식 마우스 모델에서 종양 Engraftment

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

돌이킬 수 없는 Electroporation의 효과 공부 하는 Syngeneic 췌 장 암 마우스 모델

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

Orthotopic PD L1 식 공부 Syngeneic 폐 선 암 세포의 이식

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

자동차 T 세포에 의해 회전 타원 체 살인 분석 결과

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

CRISPR/Cas9를 사용하여 CAR-T 셀에서 GM-CSF를 제거합니다.

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

입양 면역 요법을 위한 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포 제조

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

뮤린 췌장 연성 선암의 초음파 유도 정형 외 이식

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

A Syngeneic Orthotopic Osteosarcoma Sprague Dawley Rat Model with Amputation to Control Metastasis Rate

전이율을 제어하는 절단을 가진 신제닉 직소 성 골육종 스프라그 Dawley 쥐 모델

The most recent advance in the treatment of osteosarcoma (OS) occurred in the 1980s when multi-agent chemotherapy was shown to improve overall survival ...

Natural Killer (NK) and CAR-NK Cell Expansion Method using Membrane Bound-IL-21-Modified B Cell Line

Natural Killer NK and CAR-NK Cell Expansion Method using Membrane Bound-IL-21-Modified B Cell Line

멤브레인 결합-IL-21-변형 B 세포주를 이용한 자연살해(NK) 및 CAR-NK 세포 확장 방법

Chimeric antigen receptor (CAR)-modified immune cell therapy has become an emerging treatment for cancers and infectious diseases. NK-based immunotherapy, ...