Name: temporal analysis of the nuclear-to-cytoplasmic translocation of a herpes simplex virus 1 protein by immunofluorescent confocal microscopy
Uploaded: 2018-11-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy at JoVE.com

ونحن نشكر الدعم المالي من منحة المعاهد الوطنية للصحة (RO1AI118992) منحت قو هاي. ونحن نشكر مرفق الفحص المجهري، والتصوير وقياس الموارد (MICR) الأساسية في جامعة ولاية وين للدعم التقني.

1-خلية البذر والإصابة بالفيروسات
<ol><li>في 20 – 24 ساعة قبل الإصابة بالفيروس، البذور 5 × 104 خلايا الرئة الجنينية البشرية (هيل) تنتجها الخلايا الليفية أو خلايا أخرى ينبغي بحثها على شريحة متداخلة مم 11 4-جيدا في النمو المتوسطة (تعديل النسر المتوسطة (دميم دولبيكو) وتستكمل مع الأبقار الجنين 10% ا...

<ol>
	<li>Whitley, R., Kimberlin, D. W., Prober, C. G., Arvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+disease.">Pathogenesis and disease.</a> Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. , (2007).</li><li>Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., Knipe, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+viruses.">Herpes simplex viruses.</a> Fields' Virology. , 1823-1897 (2013).</li><li>Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infected+cell+protein+0+functional+domains+and+their+coordination+in+herpes+simplex+virus+replication.">Infected cell protein 0 functional domains and their coordination in herpes simplex virus replication.</a> World Journal of Virology. 5 (1), 1-13 (2016).</li><li>Lopez, P., Van Sant, C., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+the+nuclear-cytoplasmic+translocation+of+infected-cell+protein+0+of+herpes+simplex+virus+1.">Requirements for the nuclear-cytoplasmic translocation of infected-cell protein 0 of herpes simplex virus 1.</a> Journal of Virology. 75 (8), 3832-3840 (2001).</li><li>Kawaguchi, Y., Van Sant, C., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+1+alpha+regulatory+protein+ICP0+interacts+with+and+stabilizes+the+cell+cycle+regulator+cyclin+D3.">Herpes simplex virus 1 alpha regulatory protein ICP0 interacts with and stabilizes the cell cycle regulator cyclin D3.</a> Journal of Virology. 71 (10), 7328-7336 (1997).</li><li>Mullen, M. A., Ciufo, D. M., Hayward, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+intracellular+localization+domains+and+evidence+for+colocalization+interactions+between+the+IE110+and+IE175+nuclear+transactivator+proteins+of+herpes+simplex+virus.">Mapping of intracellular localization domains and evidence for colocalization interactions between the IE110 and IE175 nuclear transactivator proteins of herpes simplex virus.</a> Journal of Virology. 68 (5), 3250-3266 (1994).</li><li>Maul, G. G., Everett, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+location+of+PML,+a+cellular+member+of+the+C3HC4+zinc-binding+domain+protein+family,+is+rearranged+during+herpes+simplex+virus+infection+by+the+C3HC4+viral+protein+ICP0.">The nuclear location of PML, a cellular member of the C3HC4 zinc-binding domain protein family, is rearranged during herpes simplex virus infection by the C3HC4 viral protein ICP0.</a> Journal of General Virology. 75 (6), 1223-1233 (1994).</li><li>Chelbi-Alix, M. K., de The, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+virus+induced+proteasome-dependent+degradation+of+the+nuclear+bodies-associated+PML+and+Sp100+proteins.">Herpes virus induced proteasome-dependent degradation of the nuclear bodies-associated PML and Sp100 proteins.</a> Oncogene. 18 (4), 935-941 (1999).</li><li>Zheng, Y., Samrat, S. K., Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tale+of+Two+PMLs:+Elements+Regulating+a+Differential+Substrate+Recognition+by+the+ICP0+E3+Ubiquitin+Ligase+of+Herpes+Simplex+Virus+1.">A Tale of Two PMLs: Elements Regulating a Differential Substrate Recognition by the ICP0 E3 Ubiquitin Ligase of Herpes Simplex Virus 1.</a> Journal of Virology. 90 (23), 10875-10885 (2016).</li><li>Lanfranca, M. P., Mostafa, H. H., Davido, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSV-1+ICP0:+An+E3+Ubiquitin+Ligase+That+Counteracts+Host+Intrinsic+and+Innate+Immunity.">HSV-1 ICP0: An E3 Ubiquitin Ligase That Counteracts Host Intrinsic and Innate Immunity.</a> Cells. 3 (2), 438-454 (2014).</li><li>Zheng, Y., Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+three+redundant+segments+responsible+for+herpes+simplex+virus+1+ICP0+to+fuse+with+ND10+nuclear+bodies.">Identification of three redundant segments responsible for herpes simplex virus 1 ICP0 to fuse with ND10 nuclear bodies.</a> Journal of Virology. 89 (8), 4214-4226 (2015).</li><li>Samrat, S. K., Ha, B. L., Zheng, Y., Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Elements+Regulating+the+Nuclear-to-Cytoplasmic+Translocation+of+ICP0+in+Late+Herpes+Simplex+Virus+1+Infection.">Characterization of Elements Regulating the Nuclear-to-Cytoplasmic Translocation of ICP0 in Late Herpes Simplex Virus 1 Infection.</a> Journal of Virology. 92 (2), e01673-e01617 (2018).</li><li>Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+role+does+cytoplasmic+ICP0+play+in+HSV-1+infection?.">What role does cytoplasmic ICP0 play in HSV-1 infection?.</a> Future Virology. 13 (6), (2018).</li><li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+live+cell+imaging.">Fluorescence live cell imaging.</a> Methods Cell Biology. 123, 77-94 (2014).</li><li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+microscopy+-+tips+and+tools.">Live-cell microscopy - tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+as+a+toolkit+for+in+vivo+imaging.">Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging.</a> Trends in Biotechnology. 23 (12), 605-613 (2005).</li><li>Teng, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+proteins+inside+living+cells+using+external+fluorophores+for+microscopy.">Labeling proteins inside living cells using external fluorophores for microscopy.</a> Elife. 5, e20378 (2016).</li><li>Stephens, D. J., Allan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+microscopy+techniques+for+live+cell+imaging.">Light microscopy techniques for live cell imaging.</a> Science. 300 (5616), 82-86 (2003).</li></ol>

وقد استخدم هذا البروتوكول لدراسة إزفاء النووية إلى هيولى من هامبورغ-1 ICP0. ICP0 يخضع الاتجار سوبسيلولار خلال هامبورغ-1 العدوى (الشكل 1). من المحتمل يتفاعل ICP0 مع مختلف مسارات الخلية القيام بمهام مختلفة في مواقع مختلفة. وهذا يتيح ICP0 لتهذيب وظائفها المتعددة في شد مع الإنسان المضيف<...

يسبب فيروس الحلأ البسيط 1 (هامبورغ-1) مجموعة واسعة من معتدلة إلى شديدة الأمراض الحلئيه بما في ذلك لابياليس الحلأ الحلأ التناسلي، التهاب القرنية stromal والتهاب الدماغ. وبمجرد إصابة، ينشئ الفيروس عدوى مدى الحياة كامنة في الخلايا العصبية ganglia. في بعض الأحيان، يمكن إعادة تنشيط الفيروس بأسباب مختلفة مثل الحمى والإجهاد وقمع المناعة1، مما أدى إلى إصابة القوباء المتكررة. بروتين الخلية المصابة 0 (ICP0) منظم فيروسية أساسية حاسمة للحال والكامنة على السواء هامبورغ-1 العدوى. أنها ترانساكتيفاتيس الفيروس المصب الجينات عن طريق التصدي للمضيف الدفاعات المضادة للفيروسات مضمن الفطرية/2،3. وقد ICP0 بنشاط ليجاسى ubiquitin E3، الذي يستهدف عدة عوامل خلية لتدهور تعتمد على بروتوزوم3. أنه يتفاعل أيضا مع مختلف مسارات الخلية لتنظيم أنشطتها وبعد ذلك إزاحة القيود المضادة للفيروسات المضيف3. ومن المعروف ICP0 لتحديد موقع في المقصورات سوبسيلولار مختلفة كما تنتقل العدوى3،،من45. وقد البروتين إشارة تعريب نووية يسين/ارجينين--الغنية (NLS) الموجود في المخلفات إلى 500 5066. عند توليف حيثياته في وقت مبكر هامبورغ-1 العدوى، يتم استيراد ICP0 فورا إلى النواة. أنها أول مرة اكتشفت في دينامية نووية وصف بنية المجال النووي 10 (ND10)7. نشاط ليجاسى ubiquitin E3 ICP0 يتسبب تدهور البروتينات المنظم ND10، promyelocytic سرطان الدم (الرابطة الإسلامية) البروتين، والبروتين الأرقط 100 كاتشين (Sp100)8،،من910. بعد فقدان البروتينات المنظم، مشتتة الهيئات النووية ND10 وهو موزع ICP0 لملء4،أسرة نواة11.
من المثير للاهتمام، بعد بدء تكرار الحمض النووي الفيروسي، يختفي ICP0 من النواة. إلا يوجد في السيتوبلازم، مما يوحي بحدوث إزفاء النووية إلى هيولى متأخراً في هامبورغ-1 العدوى4،12. ويعني اشتراط تكرار الحمض النووي مشاركة محتملة أواخر protein(s) الفيروسية في تيسير نقل جسد هيولى من هامبورغ-1 ICP04،12. ICP0 الاتجار فيما بين الأقسام المختلفة أثناء الإصابة تمكن على ما يبدو ICP0 تعدل اتصالاتها على مختلف المسارات الخلوية بطريقة مكانية الزمانية، وتنسيق ذلك وظائفها المتعددة لغرامة ضبط التوازن بين الحال والكامن هامبورغ-1 العدوى13. لفهم أفضل لتعدد الوظائف ICP0 وتنسيق مجالات وظيفية ICP0 في جميع أنحاء العدوى الحال، نحن بعناية تشريح الأساس الجزيئي الحيوي إزفاء ICP012. لإجراء الدراسات الميكانيكية سبق الإبلاغ عنها12، المطبقة لدينا أسلوب المصبوغة إيمونوفلوريسسينت لتصور التعريب ICP0 سوبسيلولار في حالة الإصابة مختلفة تحت المجهر [كنفوكل]. كما قمنا بتطوير بروتوكول كمية لتحليل النووية مقابل هيولى توزيع ICP0 باستخدام البرمجيات [كنفوكل]. كان جدولت سكان هامبورغ-1 إصابة الخلايا في مراحل الإصابة وحللت اتجاهات الحركة ICP0، تحت مختلف علاجات البيوكيماوية12. هنا نحن تصف البروتوكول مفصلاً أن إزفاء الوثائق ICP0 في هامبورغ-1 العدوى. ونحن نقترح أنه يمكن اعتماد هذا الأسلوب كوسيلة عامة للدراسة النووية مقابل هيولى نقل جسد للبروتينات الفيروسية أو الخلوية الأخرى، التي يمكن أن تخدم كبديل للتصوير الحي عندما يكون غير قابل للتطبيق نظراً لتقنية التصوير الحي مشاكل مثل تسمية الأسلوب، وكثافة إشارة، أو وفرة البروتين.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells and viruses</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Embryonic Lung fibroblasts (HEL Cells)</td>
			<td>Dr. Thomas E. Shenk (Princeton University)</td>
			<td></td>
			<td>HEL cells were grown in DMEM supplemented with 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 viral Stock (Strain F)</td>
			<td>Dr. Bernard Roizman Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0926-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium-199 (10X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11825-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4- well 11 mm staggered slide</td>
			<td>Cel-Line/Thermofisher Scientific</td>
			<td>&#160;30-149H-BLACK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde solution(w/v) Methanol free</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher reagents</td>
			<td>BP151-1C0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Abumin (BSA)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>CAS 9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4)</td>
			<td>Dr. Haidong Gu lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Bioreagent</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Bioreagent</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Bioreagent</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking buffer (PBS with 1% BSA and 5% Horse serum )</td>
			<td>Dr. Haidong Gu lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabiit Anti-ICP0 antibody</td>
			<td>Dr. Haidong Gu lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PML (PG-M3)-Mouse monoclonal IgG</td>
			<td>santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594-goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-goat anti-mouse IgG</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Mouting medium with DAPI</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail Polish</td>
			<td>Sally Hansen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Leica SP8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Software</td>
			<td>Leica LAS X Application suite</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel software</td>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell 150i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Order code 51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

temporal analysis of the nuclear-to-cytoplasmic translocation of a herpes simplex virus 1 protein by immunofluorescent confocal microscopy

بروتين الخلية المصابة 0 (ICP0) لفيروس الحلأ البسيط 1 (هامبورغ-1) بروتين مبكر فوري الذي يحتوي على ليجاسى ubiquitin E3 عصابة من نوع. أنها مسؤولة عن تدهور proteasomal المضيف العوامل المقيدة وتفعيل الجينات الفيروسية اللاحقة. ICP0 يحتوي على تسلسل تعريب النووي المتعارف عليه (NLS). أنه يدخل النواة فورا بعد توليف حيثياته وينفذ مهامه الدفاع المضادة المضيف أساسا في النواة. ومع ذلك، لاحقاً في الإصابة، ICP0 يتم العثور على فقط في السيتوبلازم، مما يوحي بحدوث إزفاء النووية إلى هيولى خلال هامبورغ-1 العدوى. يفترض أن يتيح إزفاء ICP0 ICP0 تعدل مهامها وفقا لمواقعها سوبسيلولار في مراحل مختلفة من العدوى. كي تحدد الوظيفة البيولوجية وآلية تنظيمية من ICP0 النووية إلى هيولى إزفاء، قمنا بتعديل أسلوب الفحص المجهري إيممونوفلوريسسينت لرصد الاتجار ICP0 خلال هامبورغ-1 العدوى. ويشمل هذا البروتوكول تلطيخ إيمونوفلوريسسينت، [كنفوكل] مجهر التصوير، والنووية مقابل توزيع هيولى تحليل. والهدف من هذا البروتوكول التكيف مع حالة ثابتة [كنفوكل] الصور التي اتخذت في دورة وقت إلى توثيق كمية الحركة ICP0 في جميع أنحاء العدوى الحال. ونحن نقترح أن هذا الأسلوب يمكن أن يعمم لتحليل كمي النووية مقابل الحصول على التعريب هيولى من البروتينات الفيروسية أو الخلوية الأخرى دون إشراك تكنولوجيا التصوير الحي.

لفهم الأساس الجزيئي والوظائف البيولوجية ICP0 الاتجار خلال هامبورغ-1 العدوى، نستخدم أسلوب الفحص المجهري إيمونوفلوريسسينت لتحليل التوزيع ICP0 سوبسيلولار في مراحل مختلفة من العدوى. ويبين الشكل 1 الخلايا الممثل مع التعريب ICP0 المميزة مع تقدم الإصابة. لتحديد مقد?...

Watch this Scientific Journal Video about Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy at JoVE.com

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

التحليل الزمني إزفاء النووية إلى هيولى بروتين الفيروس 1 الحلأ البسيط بالفحص المجهري [كنفوكل] إيمونوفلوريسسينت

ICP0 يخضع إزفاء النووية إلى هيولى خلال هامبورغ-1 العدوى. ولا يعرف الآلية الجزيئية لهذا الحدث. هنا يصف لنا استخدام مجهر [كنفوكل] كأداة لقياس حركة ICP0 في هامبورغ-1 العدوى، الذي يرسي الأساس لتحليل كمي إزفاء ICP0 في الدراسات الميكانيكية في المستقبل.

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الاتجار بالبروتين حول النقل النووي والسيكتوبلازمي في النظام الذي لا يتوفر فيه التصوير الضوئي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تطبيقها كمراسم عامة لدراسة حركة البروتينات الزمنية دون أن تنطوي على تصوير الضوء. 20 إلى 24 ساعات قبل عدوى الفيروس البذور 5 مرات 10 إلى 4 بشرية رئة جنينية أو خلايا الانفجار الألياف HEL في بئر على شريحة أربعة 11 ملليمتر بشكل جيد و متوسط النمو للحضانة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع خمسة في المئة ثاني أكسيد الكربون.من المهم أن تهز الشريحة بدقة لضمان توزيع متكافئ للخلايا مع الحرص على تجنب تسرب الوسط الثقافي. في اليوم التالي، استبدلوا المُتشردين، لذا فإن الثقافات التي تبلغ 70 إلى 80 بالمئة تُخلط مع الثقافات المتوسطة 199، التي تحتوي على 410 وحدات لتشكيل البلاك لكل خلية، ووضع الشريحة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع الاهتزاز، لمدة ساعة واحدة. في نهاية الحضانة، استبدال الماوسين مع متوسط النمو الطازجة وإعادة الخلايا إلى الحاضنة لفترة العدوى التجريبية المناسبة.بالنسبة للتلوين المناعي للخلايا المصابة بالفيروس، اغسل الخلايا بسرعة ثلاث مرات باستخدام PBS. تليها حضانة لمدة ثماني إلى عشر دقائق في 200 ميكرولترات من أربعة في المئة شبهformaldehyde في برنامج تلفزيوني في البئر. في نهاية التثبيت، وغسل الخلايا ثلاث مرات مع 200 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني لكل غسل، و permeabilize الخلايا مع 100 ميكرولترات من 0.2 في المئة غير الأيونية السطحي لكل بئر لمدة خمس إلى عشر دقائق.غسل الخلايا permeabilized ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني كما هو موضح، وإضافة 200 ميكرولترات من العازلة سد إلى كل بئر لاحتضان ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، إضافة التركيز المناسب من الأجسام المضادة الأولية ذات الأهمية لكل بئر لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة الحضانة. في نهاية الحضانة، وإزالة أي جسم مضاد الأولية غير منضم مع ثلاثة، عشر دقائق يغسل في عازلة منع جديدة، وإضافة جسم مضاد الثانوية المناسبة لكل بئر لاحتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء.في نهاية الحضانة، وغسل الخلايا ثلاث مرات في عازلة حظر كما هو موضح، تليها غسل واحد في برنامج تلفزيوني وإضافة قطرة واحدة من antifade تصاعد المتوسطة تستكمل مع DAPI إلى كل بئر. ثم ضع زلة غطاء على الشريحة وختم منحدر الغطاء مع طلاء الأظافر الشفاف. إن ممارسة الضغط اللطيف أثناء تركيب زلة الغطاء سيؤدي إلى إزالة أي وسط زيادة في التركيب، مما يساعد على ضمان المساعدة في ضمان الحصول على صور عالية الجودة.للتصوير confocal من المسمى، والخلايا المصابة، حدد الأجسام المضادة الثانوية المناسبة وأطوال موجية DAPI، وتعيين تنسيق الصورة إلى 1، 024 في 1، 024 بكسل مع خط متوسط من ثمانية. ثم صورة كل جيدا على الشريحة أربعة بئر تحت الهدف 100x. لحساب عدد كبير من الخلايا، والحصول على خمس إلى عشر صور من حقول متتالية في نفس البئر تحت الهدف 40x.لتحليل التوزيع النووي والسيكتوبلازمي من ICP0، افتح المشروع في برنامج التطبيق confocal وحدد صورة. افتح علامة التبويب الكمية، وحدد ترتيب مناطق الاهتمام من القائمة أدوات. حدد رسم الخط، ورسم خط طولي عبر الخلية ليتم تحليلها.سيظهر مدرج بياني يظهر شدة الفلور على طول الخط لكل من البروتين الذي يهمك، و DAPI. بناء على تلطيخ الخلفية، تعيين عتبة ثابتة لشدة البروتين من الفائدة لتحليل التوزيع الخلوي الفرعي للبروتين في كل تجربة. إذا كانت إشارة البروتين، في المتوسط، أقل من العتبة في المنطقة النووية، ولكنها تتجاوز العتبة خارج حدود DAPI، فصنف إشارة البروتين على أنها تقع في الغالب داخل السيتوبلازم.إذا كانت إشارة البروتين فوق العتبة في جميع أنحاء النواة، وخارج حدود إشارة DAPI، فجموع إشارة البروتين كنواة بالإضافة إلى التعريب السيتوبلازمي. إذا كانت إشارة البروتين فوق العتبة في النواة، ولكن في المتوسط هو أقل من عتبة خارج حدود مجموعة إشارة DAPI إشارة البروتين كتوطين نووي. وأخيراً، اِنْحَب أكثر من 200 خلية مصابة من كل عينة في نقاط زمنية مختلفة للإصابة، وارسم البيانات في رسم بياني شريطي لتوضيح حركة البروتين الذي يهمك بمرور الوقت.كما هو موضح، هذه الطريقة تسهل تحليل نقل النووية إلى السيتوبلازمية من البروتينات ذات الأهمية. على سبيل المثال، خلية مصابة بروتين صفر، أو ICP0 التغييرات التوزيع دون الخلوية مع تقدم العدوى الفيروسية. لفهم العناصر المطلوبة للاتجار ICP0 أثناء العدوى، يمكن تتبع حركات ICP0 في نوع البرية و متحولة نوع فيروس الهربس البسيط 1-الفيروسات في مراحل العدوى المختلفة، مما يسمح بتقييم التوزيع الخلوي الفرعي من ICP0 في نقاط زمنية مختلفة من العدوى.من المهم أن نتذكر لاستخدام الثقافات monolayer حتى virions الحصول على قدم المساواة إلى الخلايا وتطبيع تعدد العدوى وفقا لعنوان الفيروس بحيث تطور العدوى قابلة للمقارنة بين وداخل الفيروسات. بعد كل تطور، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجالات علم الأحياء وعلم الفيروسات الخلوية لاستكشاف حركة البروتين من خلال دراسة التعريب دون الخلوي الزمني للبروتينات ذات الأهمية داخل مجموعة الخلايا.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

الميكروويف بمساعدة التشخيص السريع للأمراض النباتية من الفيروسات المجهر الإلكتروني ناقل

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Intravital الميكروسكوب في الطحال : التحليل الكمي للتنقل الطفيلي وتدفق الدم

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

كشف إزفاء السمية في العصارة الخلوية المضيف بواسطة الرنين مأكل السطح

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

والثقافة الخلية العصبية الأولية نظام لدراسة فيروس العقبول البسيط الكمون وإعادة تنشيط

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

العزلة وتحليل الجينوم Virions واحدة باستخدام &#39;جينوم فيروس واحد&#39;

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

تقييم نشاط مضاد للفطريات المعزولة من السنخية الضامة التي كتبها متحد البؤر المجهري

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

شارك في مناعي من البروتين ماوس MX1 مع الأنفلونزا من الفيروسات البروتين النووي

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

العدوى فيفو السابقين الفئران البشرة مع فيروس الهربس البسيط من النوع 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

تحليل<em&gt; يرسينيا القولون</em&gt; المستجيب إزفاء في الخلايا المضيفة عن طريق بيتا لاكتاماز المستجيب الإنشطار

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...