Name: temporal analysis of the nuclear-to-cytoplasmic translocation of a herpes simplex virus 1 protein by immunofluorescent confocal microscopy
Uploaded: 2018-11-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy at JoVE.com

Wij danken de financiële steun van een toegekende aan Haidong Gu NIH-subsidie (RO1AI118992). Wij danken de microscopie, Imaging & Cytometry middelen (MICR) Core faciliteit aan de Wayne State University voor technische ondersteuning.

1. cel zaaien en virusinfectie
<ol><li>20 – 24 uur voordat de virusbesmetting, seed 5 x 10,4 van menselijke embryonale Long (HEL) fibroblast cellen of andere cellen worden onderzocht op een dia 4-well 11 mm gespreid in groeimedium (Dulbecco van bewerkt Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetale runderen serum (FBS)). Incubeer de cellen bij 37 ° C met 5% kooldioxide (CO2). Opmerking: Elk goed moet hebben 70-80% cel confluentie ten tijde van infectie.</li>
	<li>Verwijder het groeimedium op ...

<ol>
	<li>Whitley, R., Kimberlin, D. W., Prober, C. G., Arvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+disease.">Pathogenesis and disease.</a> Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. , (2007).</li><li>Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., Knipe, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+viruses.">Herpes simplex viruses.</a> Fields' Virology. , 1823-1897 (2013).</li><li>Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infected+cell+protein+0+functional+domains+and+their+coordination+in+herpes+simplex+virus+replication.">Infected cell protein 0 functional domains and their coordination in herpes simplex virus replication.</a> World Journal of Virology. 5 (1), 1-13 (2016).</li><li>Lopez, P., Van Sant, C., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+the+nuclear-cytoplasmic+translocation+of+infected-cell+protein+0+of+herpes+simplex+virus+1.">Requirements for the nuclear-cytoplasmic translocation of infected-cell protein 0 of herpes simplex virus 1.</a> Journal of Virology. 75 (8), 3832-3840 (2001).</li><li>Kawaguchi, Y., Van Sant, C., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+1+alpha+regulatory+protein+ICP0+interacts+with+and+stabilizes+the+cell+cycle+regulator+cyclin+D3.">Herpes simplex virus 1 alpha regulatory protein ICP0 interacts with and stabilizes the cell cycle regulator cyclin D3.</a> Journal of Virology. 71 (10), 7328-7336 (1997).</li><li>Mullen, M. A., Ciufo, D. M., Hayward, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+intracellular+localization+domains+and+evidence+for+colocalization+interactions+between+the+IE110+and+IE175+nuclear+transactivator+proteins+of+herpes+simplex+virus.">Mapping of intracellular localization domains and evidence for colocalization interactions between the IE110 and IE175 nuclear transactivator proteins of herpes simplex virus.</a> Journal of Virology. 68 (5), 3250-3266 (1994).</li><li>Maul, G. G., Everett, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+location+of+PML,+a+cellular+member+of+the+C3HC4+zinc-binding+domain+protein+family,+is+rearranged+during+herpes+simplex+virus+infection+by+the+C3HC4+viral+protein+ICP0.">The nuclear location of PML, a cellular member of the C3HC4 zinc-binding domain protein family, is rearranged during herpes simplex virus infection by the C3HC4 viral protein ICP0.</a> Journal of General Virology. 75 (6), 1223-1233 (1994).</li><li>Chelbi-Alix, M. K., de The, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+virus+induced+proteasome-dependent+degradation+of+the+nuclear+bodies-associated+PML+and+Sp100+proteins.">Herpes virus induced proteasome-dependent degradation of the nuclear bodies-associated PML and Sp100 proteins.</a> Oncogene. 18 (4), 935-941 (1999).</li><li>Zheng, Y., Samrat, S. K., Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tale+of+Two+PMLs:+Elements+Regulating+a+Differential+Substrate+Recognition+by+the+ICP0+E3+Ubiquitin+Ligase+of+Herpes+Simplex+Virus+1.">A Tale of Two PMLs: Elements Regulating a Differential Substrate Recognition by the ICP0 E3 Ubiquitin Ligase of Herpes Simplex Virus 1.</a> Journal of Virology. 90 (23), 10875-10885 (2016).</li><li>Lanfranca, M. P., Mostafa, H. H., Davido, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSV-1+ICP0:+An+E3+Ubiquitin+Ligase+That+Counteracts+Host+Intrinsic+and+Innate+Immunity.">HSV-1 ICP0: An E3 Ubiquitin Ligase That Counteracts Host Intrinsic and Innate Immunity.</a> Cells. 3 (2), 438-454 (2014).</li><li>Zheng, Y., Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+three+redundant+segments+responsible+for+herpes+simplex+virus+1+ICP0+to+fuse+with+ND10+nuclear+bodies.">Identification of three redundant segments responsible for herpes simplex virus 1 ICP0 to fuse with ND10 nuclear bodies.</a> Journal of Virology. 89 (8), 4214-4226 (2015).</li><li>Samrat, S. K., Ha, B. L., Zheng, Y., Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Elements+Regulating+the+Nuclear-to-Cytoplasmic+Translocation+of+ICP0+in+Late+Herpes+Simplex+Virus+1+Infection.">Characterization of Elements Regulating the Nuclear-to-Cytoplasmic Translocation of ICP0 in Late Herpes Simplex Virus 1 Infection.</a> Journal of Virology. 92 (2), e01673-e01617 (2018).</li><li>Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+role+does+cytoplasmic+ICP0+play+in+HSV-1+infection?.">What role does cytoplasmic ICP0 play in HSV-1 infection?.</a> Future Virology. 13 (6), (2018).</li><li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+live+cell+imaging.">Fluorescence live cell imaging.</a> Methods Cell Biology. 123, 77-94 (2014).</li><li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+microscopy+-+tips+and+tools.">Live-cell microscopy - tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+as+a+toolkit+for+in+vivo+imaging.">Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging.</a> Trends in Biotechnology. 23 (12), 605-613 (2005).</li><li>Teng, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+proteins+inside+living+cells+using+external+fluorophores+for+microscopy.">Labeling proteins inside living cells using external fluorophores for microscopy.</a> Elife. 5, e20378 (2016).</li><li>Stephens, D. J., Allan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+microscopy+techniques+for+live+cell+imaging.">Light microscopy techniques for live cell imaging.</a> Science. 300 (5616), 82-86 (2003).</li></ol>

Dit protocol is gebruikt voor het bestuderen van de nucleaire-naar-cytoplasmatische translocatie van HSV-1 ICP0. ICP0 ondergaat subcellular handel tijdens HSV-1 infectie (Figuur 1). Waarschijnlijk, ICP0 communiceert met verschillende trajecten van de cel voor het uitvoeren van verschillende functies op verschillende locaties. Hierdoor ICP0 te fine-tunen van haar veelvoudige functies in de krachtmeting met menselijke gastheer13. Echter, hoe ICP0 coördineert de veelvou...

Herpes simplexvirus (HSV-1) 1 zorgt ervoor dat een breed scala van milde tot ernstige herpetic ziekten zoals herpes labialis, genitale herpes, stromale keratitis en encefalitis. Eenmaal besmet, wordt het virus een levenslang latente infectie in ganglia neuronen. Soms kan het virus worden gereactiveerd door diverse redenen zoals koorts, stress en immuun onderdrukking1, leiden tot recidiverende herpes infectie. Geïnfecteerde cel eiwitten 0 (ICP0) is een belangrijke virale regelgever cruciaal voor zowel lytische en latente infectie van de HSV-1. Het transactivates stroomafwaarts virus genen via het tegengaan van de host intrinsieke/aangeboren antivirale verdedigingen2,3. ICP0 heeft een E3 ubiquitin ligase activiteit, die gericht is op verschillende factoren van de cel voor proteasoom-afhankelijke degradatie3. Het interageert ook met verschillende trajecten van de cel om hun activiteiten te reguleren en vervolgens ter compensatie van de host antivirale beperkingen3. ICP0 is bekend om te zoeken op verschillende subcellular compartimenten naarmate de infectie3,4,5 vordert. Het eiwit heeft een lysine/arginine-rijke nucleaire localisatie signaal (NLS) gelegen op residuen 500 naar 5066. Bij DOVO synthese op vroege infectie van de HSV-1, is ICP0 direct geïmporteerd in de kern. Het wordt eerst gedetecteerd bij een dynamiek van nucleaire structuur genoemd nucleaire domein 10 (ND10)7. De E3 ubiquitin ligase activiteit van ICP0 activeert de afbraak van ND10 organisator eiwitten, promyelocytic leukemie (PML) eiwitten en gespikkelde eiwit 100 kDa (Sp100)8,9,10. Na het verlies van eiwitten van de organisator, ND10 nucleaire organen zijn verspreid en ICP0 wordt verspreid om te vullen de hele kern4,11.
Interessant, na het begin van virale DNA replicatie verdwijnt ICP0 uit de kern. Het is uitsluitend gevonden in het cytoplasma, suggereert de aanwezigheid van een nucleaire-naar-cytoplasmatische translocatie laat in HSV-1 infectie4,12. De eis van de DNA-replicatie impliceert de mogelijke betrokkenheid van een late virale expressie gebrachte eiwitten bij het vergemakkelijken van de cytoplasmatische translocatie van HSV-1 ICP04,12. Blijkbaar ICP0 handel tussen verschillende compartimenten tijdens infectie machtigt ICP0 te differentiëren van de interacties aan verschillende cellulaire routes in een ruimtelijke-temporele mode, en daarom coördinaat zijn meerdere functies te fine tunen het evenwicht tussen de lytische en latente HSV-1 infectie13. Om beter te begrijpen ICP0 multifunctionaliteit en de coördinatie van de functionele domeinen ICP0 gedurende de lytische infectie, ontleed we zorgvuldig de moleculaire basis van de dynamische ICP0 translocatie12. Om uit te voeren het mechanistisch onderzoek eerder gemelde12, hebben we een immunefluorescentie kleuringstechniek om te visualiseren subcellular localisatie van de ICP0 op verschillende infectie status onder confocal microscoop toegepast. We hebben ook een kwantitatieve protocol om te analyseren de nucleaire vs. cytoplasmatische verdeling van ICP0 met behulp van de confocal software ontwikkeld. De bevolking van HSV-1 besmette cellen was tabelvorm tijdens de fasen van de infectie en de trends van de ICP0 beweging werden geanalyseerd, onder verschillende biochemische behandelingen12. Hier beschrijven we het gedetailleerde protocol dat documenten ICP0 translocatie in HSV-1 infectie. Wij stellen voor dat deze methode kan worden vastgesteld als een algemene methode om te studeren van de nucleaire vs. cytoplasmatische translocatie voor andere virale of cellulaire eiwitten, die als alternatief dienen kan voor levende imaging wanneer de levende imaging techniek niet van toepassing is vanwege is problemen zoals het labelen van de methode, signaal intensiteit of eiwit overvloed.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells and viruses</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Embryonic Lung fibroblasts (HEL Cells)</td>
			<td>Dr. Thomas E. Shenk (Princeton University)</td>
			<td></td>
			<td>HEL cells were grown in DMEM supplemented with 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 viral Stock (Strain F)</td>
			<td>Dr. Bernard Roizman Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0926-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium-199 (10X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11825-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4- well 11 mm staggered slide</td>
			<td>Cel-Line/Thermofisher Scientific</td>
			<td>&#160;30-149H-BLACK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde solution(w/v) Methanol free</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher reagents</td>
			<td>BP151-1C0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Abumin (BSA)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>CAS 9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4)</td>
			<td>Dr. Haidong Gu lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Bioreagent</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Bioreagent</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Bioreagent</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking buffer (PBS with 1% BSA and 5% Horse serum )</td>
			<td>Dr. Haidong Gu lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabiit Anti-ICP0 antibody</td>
			<td>Dr. Haidong Gu lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PML (PG-M3)-Mouse monoclonal IgG</td>
			<td>santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594-goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-goat anti-mouse IgG</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Mouting medium with DAPI</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail Polish</td>
			<td>Sally Hansen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Leica SP8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Software</td>
			<td>Leica LAS X Application suite</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel software</td>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell 150i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Order code 51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

temporal analysis of the nuclear-to-cytoplasmic translocation of a herpes simplex virus 1 protein by immunofluorescent confocal microscopy

Geïnfecteerde cel eiwitten 0 (ICP0) van herpes simplexvirus (HSV-1) 1 is een onmiddellijke vroege eiwit met een RING-type E3 ubiquitin ligase. Het is verantwoordelijk voor de afbraak van de remmen van host beperkende factoren en de activering van latere virale gen. ICP0 bevat een reeks canonieke nucleaire localisatie (NLS). Het komt de kern onmiddellijk na DOVO synthese en voert haar anti-host defense functies voornamelijk in de kern. Echter verderop in infectie, is ICP0 aangetroffen uitsluitend in het cytoplasma, het voorkomen van een nucleaire-naar-cytoplasmatische translocatie tijdens HSV-1 infectie. Vermoedelijk kan ICP0 translocatie ICP0 te moduleren van haar functies aanroept volgens haar subcellular locaties op verschillende infectie fasen. Om het af te bakenen de biologische functie en regelgevende mechanisme van ICP0 nucleaire-naar-cytoplasmatische translocatie, bewerkt we een immunefluorescentie microscopie methode voor het controleren van de ICP0 handel tijdens HSV-1 infectie. Dit protocol omvat immunefluorescentie kleuring, confocal microscoop beeldapparatuur en nucleaire vs. cytoplasmatische distributie analyse. Het doel van dit protocol is te passen de steady-state confocal opnamen in een tijdsverloop in een kwantitatieve documentatie ICP0 verkeer gedurende de lytische infectie. Wij stellen voor dat deze methode kan worden gegeneraliseerd om nucleaire vs. cytoplasmatische lokalisatie van andere virale of cellulaire eiwitten kwantitatief te analyseren zonder tussenkomst van levende imaging technologie.

Om te begrijpen van de basis voor moleculaire en biologische functies van de ICP0 handel tijdens HSV-1 infectie, gebruiken we een immunefluorescentie microscopie methode om te analyseren ICP0 subcellular distributie op verschillende infectie fasen. Figuur 1 toont de representatieve cellen met kenmerkende ICP0 localisatie naarmate de infectie vordert. Om te kwantificeren van de nucleaire-naar-cytoplasmatische translocatie van ICP0, analyseren we ICP0 distribut...

Watch this Scientific Journal Video about Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy at JoVE.com

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Temporele analyse van de nucleaire-naar-cytoplasmatische translocatie van een Herpes Simplex Virus 1 eiwit door immunefluorescentie confocale microscopie

ICP0 ondergaat nucleaire-naar-cytoplasmatische translocatie tijdens HSV-1 infectie. Het moleculaire mechanisme van deze gebeurtenis is niet bekend. Hier beschrijven we het gebruik van de confocal microscoop als een hulpmiddel om te kwantificeren ICP0 beweging in HSV-1 infectie, die de basis legt voor het kwantitatief ICP0 translocatie in toekomstige mechanistische studies te analyseren.

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van eiwithandel over nucleaire en cytoplasmische translocatie in het systeem waarbinnen geen lichtbeeldvorming beschikbaar is. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het kan worden toegepast als een algemeen protocol voor de studie van temporele eiwitbeweging zonder dat er lichtbeeldvorming is. 20 tot 24 uur voor de virusinfectie zaad 5 keer 10 tot de 4 menselijke embryonale long of HEL vezel blast cellen per goed op een vier goed 11 millimeter gespreide dia en groeimedium voor 's nachts incubatie bij 37 graden Celsius met vijf procent kooldioxide.Het is belangrijk om de glijbaan grondig te laten schommelen om een gelijkmatige verdeling van de cellen te garanderen, terwijl het ervoor zorgt dat het cultuurmedium niet wordt gemorst. De volgende dag, vervang de supernatants, zodat de 70 tot 80 procent confluent culturen met Medium 199, met 410 plaque-vormende eenheden per cel, en plaats de dia op 37 graden Celsius met schudden, voor een uur. Vervang aan het einde van de incubatie de supernatants door vers groeimedium en breng de cellen terug naar de couveuse voor de juiste experimentele infectieperiode.Voor immunofluorescente kleuring van de met virussen geïnfecteerde cellen, snel wassen van de cellen drie keer met PBS. Gevolgd door een acht tot tien minuten durende incubatie in 200 microliters van vier procent paraformaldehyde in PBS per put. Aan het einde van de fixatie, was de cellen drie keer met 200 microliter PBS per was, en permeabiliseren de cellen met 100 microliters van 0,2 procent niet-ionische oppervlakteactieve per goed gedurende vijf tot tien minuten.Was de permeabiliseerde cellen drie keer in PBS zoals aangetoond, en voeg 200 microliters van het blokkeren buffer aan elke put voor een incubatie van een uur bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens de juiste concentratie van het primaire antilichaam van belang toe aan elke put voor een incubatie van twee uur kamertemperatuur. Verwijder aan het einde van de incubatie elk niet-gebonden primaire antilichaam met drie, tien minuten durende wasbeurten in een verse blokkeringsbuffer en voeg een passend secundair antilichaam toe aan elke put voor een incubatie van een uur bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.Aan het einde van de incubatie, was de cellen drie keer in een blokkerende buffer zoals aangetoond, gevolgd door een wasbeurt in PBS en voeg een druppel antifade montagemedium aangevuld met DAPI aan elke put. Plaats vervolgens een afdeksel over de glijbaan en verzegel de afdekking helling met transparante nagellak. Het toepassen van zachte druk tijdens het monteren van de cover slip zal verwijderen overtollige montage medium, helpen om ervoor te zorgen dat de verwerving van beelden van hoge kwaliteit te waarborgen.Voor confocale beeldvorming van de gelabelde geïnfecteerde cellen selecteert u het juiste secundaire antilichaam en DAPI-golflengten en stelt u het afbeeldingsformaat in op 1, 024 bij 1, 024 pixels met een gemiddelde lijn van acht. Dan beeld elke put op de vier-goed dia onder de 100x doelstelling. Voor het tellen van een groot aantal cellen, verkrijgen vijf tot tien beelden uit opeenvolgende velden in dezelfde put onder de 40x doelstelling.Om de nucleaire en cytoplasmatische distributie van ICP0 te analyseren, opent u het project in de confocale applicatiesoftware en selecteert u een afbeelding. Open het tabblad Hoeveelheid en selecteer Interessegebieden sorteren in het menu Extra. Selecteer Lijn tekenen en teken een langslijn over de cel die moet worden geanalyseerd.Een histogram zal verschijnen met de fluorescentie intensiteit langs de lijn voor zowel het eiwit van belang, en DAPI. Op basis van de achtergrond kleuring, het opzetten van een constante drempel voor de intensiteit van het eiwit van belang voor de analyse van de subcellulaire distributie van het eiwit in elk experiment. Als het eiwitsignaal gemiddeld onder de drempel in het nucleaire gebied ligt, maar boven de drempel voorbij de DAPI-grens ligt, categoriseert u het eiwitsignaal als hoofdzakelijk gelegen in het cytoplasma.Als het eiwitsignaal boven de drempel in de kern en voorbij de grens van het DAPI-signaal ligt, groepeert u het eiwitsignaal als een kern plus cytoplasmatische lokalisatie. Als het eiwitsignaal boven de drempel in de kern ligt, maar gemiddeld onder de drempel van de DAPI-signaalgroep ligt, wordt het eiwitsignaal als nucleaire lokalisatie gelokaliseerd. Tot slot, tabuleren meer dan 200 geïnfecteerde cellen van elk monster op verschillende infectie tijdpunten, en plot de gegevens in een staafgrafiek om de beweging van het eiwit van belang in de tijd te illustreren.Zoals aangetoond, vergemakkelijkt deze methode de analyse van de nucleaire-naar-cytoplasmatische translocatie van proteïnen van belang. Bijvoorbeeld, geïnfecteerde cel eiwit nul, of ICP0 subcellulaire distributie verandert naarmate een virale infectie vordert. Om de elementen die nodig zijn voor ICP0-handel tijdens infectie te begrijpen, kunnen ICP0-bewegingen worden gevolgd in Wild Type en Mutant Type Herpes Simplex Virus 1-geïnfecteerde cellen in verschillende infectiefasen, waardoor de evaluatie van de subcellulaire distributie van ICP0 op verschillende tijdstippen van infectie mogelijk is.Het is belangrijk om te onthouden om monolaag culturen te gebruiken, zodat de virions hebben gelijke toegang tot de cellen en om de veelheid van infectie te normaliseren volgens de virustitel, zodat infectie progressie is vergelijkbaar tussen en binnen virussen. Na elke ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van biologie en celvirologie om eiwitbewegingen te onderzoeken door de tijdelijke subcellulaire lokalisaties van interessante eiwitten binnen een celpopulatie te bestuderen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Magnetron Assisted snelle diagnose van Plant virusziekten bij Transmissie Elektronen Microscopie

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Intravitale Microscopie van de milt: Kwantitatieve Analyse van Parasite Mobiliteit en Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

Detectie van Toxin Translocatie in de Host cytosol van Surface Plasmon Resonance

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Een primaire Neuron Cultuurstelsel voor de Studie van Herpes Simplex Virus latentie en reactivatie

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

Isolatie en Genoomanalyse van Single Virionen gebruik &#39;Single Virus Genomics&#39;

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Evaluatie anti-schimmel activiteit van geïsoleerde alveolaire macrofagen door confocale microscopie

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Co-immunoprecipitatie van de Muis Mx1 eiwit met het influenza A-virus nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infectie van Muizen Epidermis met Herpes simplex virus type 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analyse van<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effector Translocatie in gastheercellen met behulp van beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...