Name: temporal analysis of the nuclear-to-cytoplasmic translocation of a herpes simplex virus 1 protein by immunofluorescent confocal microscopy
Uploaded: 2018-11-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy at JoVE.com

Vi tackar finansiellt stöd från en NIH grant (RO1AI118992) tilldelas Haidong Gu. Vi tackar mikroskopi, bildbehandling och flödescytometri resurser (MICR) Core anläggningen vid Wayne State University för teknisk support.

1. cell sådd och virusinfektion
<ol><li>Vid 20 – 24 h innan virusinfektion, utsäde 5 x 104 av mänskliga embryon lung (HEL) fibroblast celler eller andra celler undersökas på en 4-väl 11 mm vacklade bild i odlingsmedium (Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) kompletteras med 10% fostrets nötkreatur serum (FBS)). Inkubera cellerna vid 37 ° C med 5% koldioxid (CO2). Obs: Varje väl bör ha 70-80% cell konfluens vid tidpunkten för infektion.</li>
	<li>På nästa dag, ta bort odlingsm...

<ol>
	<li>Whitley, R., Kimberlin, D. W., Prober, C. G., Arvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+disease.">Pathogenesis and disease.</a> Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. , (2007).</li><li>Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., Knipe, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+viruses.">Herpes simplex viruses.</a> Fields' Virology. , 1823-1897 (2013).</li><li>Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infected+cell+protein+0+functional+domains+and+their+coordination+in+herpes+simplex+virus+replication.">Infected cell protein 0 functional domains and their coordination in herpes simplex virus replication.</a> World Journal of Virology. 5 (1), 1-13 (2016).</li><li>Lopez, P., Van Sant, C., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+the+nuclear-cytoplasmic+translocation+of+infected-cell+protein+0+of+herpes+simplex+virus+1.">Requirements for the nuclear-cytoplasmic translocation of infected-cell protein 0 of herpes simplex virus 1.</a> Journal of Virology. 75 (8), 3832-3840 (2001).</li><li>Kawaguchi, Y., Van Sant, C., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+1+alpha+regulatory+protein+ICP0+interacts+with+and+stabilizes+the+cell+cycle+regulator+cyclin+D3.">Herpes simplex virus 1 alpha regulatory protein ICP0 interacts with and stabilizes the cell cycle regulator cyclin D3.</a> Journal of Virology. 71 (10), 7328-7336 (1997).</li><li>Mullen, M. A., Ciufo, D. M., Hayward, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+intracellular+localization+domains+and+evidence+for+colocalization+interactions+between+the+IE110+and+IE175+nuclear+transactivator+proteins+of+herpes+simplex+virus.">Mapping of intracellular localization domains and evidence for colocalization interactions between the IE110 and IE175 nuclear transactivator proteins of herpes simplex virus.</a> Journal of Virology. 68 (5), 3250-3266 (1994).</li><li>Maul, G. G., Everett, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+location+of+PML,+a+cellular+member+of+the+C3HC4+zinc-binding+domain+protein+family,+is+rearranged+during+herpes+simplex+virus+infection+by+the+C3HC4+viral+protein+ICP0.">The nuclear location of PML, a cellular member of the C3HC4 zinc-binding domain protein family, is rearranged during herpes simplex virus infection by the C3HC4 viral protein ICP0.</a> Journal of General Virology. 75 (6), 1223-1233 (1994).</li><li>Chelbi-Alix, M. K., de The, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+virus+induced+proteasome-dependent+degradation+of+the+nuclear+bodies-associated+PML+and+Sp100+proteins.">Herpes virus induced proteasome-dependent degradation of the nuclear bodies-associated PML and Sp100 proteins.</a> Oncogene. 18 (4), 935-941 (1999).</li><li>Zheng, Y., Samrat, S. K., Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tale+of+Two+PMLs:+Elements+Regulating+a+Differential+Substrate+Recognition+by+the+ICP0+E3+Ubiquitin+Ligase+of+Herpes+Simplex+Virus+1.">A Tale of Two PMLs: Elements Regulating a Differential Substrate Recognition by the ICP0 E3 Ubiquitin Ligase of Herpes Simplex Virus 1.</a> Journal of Virology. 90 (23), 10875-10885 (2016).</li><li>Lanfranca, M. P., Mostafa, H. H., Davido, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSV-1+ICP0:+An+E3+Ubiquitin+Ligase+That+Counteracts+Host+Intrinsic+and+Innate+Immunity.">HSV-1 ICP0: An E3 Ubiquitin Ligase That Counteracts Host Intrinsic and Innate Immunity.</a> Cells. 3 (2), 438-454 (2014).</li><li>Zheng, Y., Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+three+redundant+segments+responsible+for+herpes+simplex+virus+1+ICP0+to+fuse+with+ND10+nuclear+bodies.">Identification of three redundant segments responsible for herpes simplex virus 1 ICP0 to fuse with ND10 nuclear bodies.</a> Journal of Virology. 89 (8), 4214-4226 (2015).</li><li>Samrat, S. K., Ha, B. L., Zheng, Y., Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Elements+Regulating+the+Nuclear-to-Cytoplasmic+Translocation+of+ICP0+in+Late+Herpes+Simplex+Virus+1+Infection.">Characterization of Elements Regulating the Nuclear-to-Cytoplasmic Translocation of ICP0 in Late Herpes Simplex Virus 1 Infection.</a> Journal of Virology. 92 (2), e01673-e01617 (2018).</li><li>Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+role+does+cytoplasmic+ICP0+play+in+HSV-1+infection?.">What role does cytoplasmic ICP0 play in HSV-1 infection?.</a> Future Virology. 13 (6), (2018).</li><li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+live+cell+imaging.">Fluorescence live cell imaging.</a> Methods Cell Biology. 123, 77-94 (2014).</li><li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+microscopy+-+tips+and+tools.">Live-cell microscopy - tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+as+a+toolkit+for+in+vivo+imaging.">Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging.</a> Trends in Biotechnology. 23 (12), 605-613 (2005).</li><li>Teng, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+proteins+inside+living+cells+using+external+fluorophores+for+microscopy.">Labeling proteins inside living cells using external fluorophores for microscopy.</a> Elife. 5, e20378 (2016).</li><li>Stephens, D. J., Allan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+microscopy+techniques+for+live+cell+imaging.">Light microscopy techniques for live cell imaging.</a> Science. 300 (5616), 82-86 (2003).</li></ol>

Detta protokoll har använts för att studera på kärn-till-Cytoplasmatisk flyttning av HSV-1 ICP0. ICP0 genomgår subcellulär människohandel under HSV-1 infektion (figur 1). Troligt, ICP0 interagerar med olika cell vägar att utföra olika uppgifter på olika platser. Detta gör ICP0 att finjustera sina flera funktioner i dragkampen med mänsklig värd13. Men studerats hur ICP0 samordnar flera funktioner i en spatial-temporal sätt väl. Med fluorescerande mikrosk...

Herpes simplex virus 1 (HSV-1) orsakar ett brett utbud av mild till svår postherpetisk sjukdomar inklusive herpes labialis, genital herpes, stromal keratit och encefalit. När smittade, upprättar viruset ett livslångt latent infektion i ganglier nervceller. Ibland kan viruset reaktiveras av olika skäl såsom feber, stress och immunsystemet1, leder till återkommande herpesinfektion. Infekterad cell protein 0 (ICP0) är en nyckel viral regulator som är avgörande för både lytisk och latent HSV-1 infektion. Det transactivates nedströms virus gener via motverka den värd inneboende/medfödda antivirala försvar2,3. ICP0 har en E3 ubiquitin ligase verksamhet, som riktar sig till flera cell faktorer för proteasom-beroende nedbrytning3. Det samverkar också med olika cell vägar att reglera deras verksamhet och därefter att kompensera värd antivirala begränsningar3. ICP0 är känd för att hitta på olika subcellulär fack som infektionen fortsätter3,4,5. Proteinet har lysin/arginin-rika cellkärnelokalisering signal (NLS) ligger på rester 500 till 5066. Vid de novo syntes på tidiga HSV-1 infektion importeras ICP0 omedelbart in i cellkärnan. Det upptäcks först vid en dynamisk nukleära struktur kallas kärnkraftsområdet 10 (ND10)7. E3 ubiquitin ligase aktiviteten av ICP0 utlöser nedbrytningen av ND10 arrangör proteiner, promyeloisk leukemi (PML) protein och spräckliga protein 100 kDa (Sp100)8,9,10. Efter förlusten av arrangör proteiner, ND10 kärn organ är spridda och ICP0 sprids för att fylla hela kärnan4,11.
Intressant, efter uppkomsten av virala DNA-replikation försvinner ICP0 från kärnan. Det finns enbart i cytoplasman, vilket tyder på förekomsten av en kärn-till-Cytoplasmatisk flyttning sent i HSV-1 infektion4,12. Kravet på den DNA-replikationen innebär potentiella deltagande en sena viral proteinernas att underlätta den cytoplasmiska flyttning av HSV-1 ICP04,12. Tydligen ICP0 människohandel bland olika fack under infektion ger ICP0 att modulera dess interaktioner till olika cellulära vägar i en spatial-temporal mode, och därför samordna dess flera funktioner till fina finjustera balansen mellan lytisk och latent HSV-1 infektion13. För att bättre förstå ICP0 multifunktionalitet och samordning av ICP0 funktionella domäner i hela lytisk infektionen, dissekerade vi noggrant den molekylära basen för den dynamiska ICP0 flyttning12. För att genomföra den mekanistiska studier tidigare rapporterade12, har vi tillämpat en Immunofluorescerande färgningsmetod för att visualisera ICP0 subcellulär lokalisering på olika infektionsstatus confocal Mikroskop. Vi har också utvecklat ett kvantitativa protokoll för att analysera nukleära vs. cytoplasmiska fördelningen av ICP0 med hjälp av confocal programvara. Befolkningen av HSV-1-infekterade celler var i tabellform i hela infektion faser och utvecklingen av ICP0 rörelse analyserades, enligt olika biokemiska behandlingar12. Här beskriver vi de detaljerade protokollet som dokument ICP0 flyttning i HSV-1 infektion. Vi föreslår att denna metod kan antas som en generell metod att studera det nukleära vs. cytoplasmiska translokationen för andra virus eller cellulära proteiner, som kan fungera som ett alternativ till levande imaging när den levande bildteknik är tillämplig på grund problem såsom märkning metoden, signalintensitet eller protein överflöd.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells and viruses</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Embryonic Lung fibroblasts (HEL Cells)</td>
			<td>Dr. Thomas E. Shenk (Princeton University)</td>
			<td></td>
			<td>HEL cells were grown in DMEM supplemented with 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 viral Stock (Strain F)</td>
			<td>Dr. Bernard Roizman Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0926-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium-199 (10X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11825-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4- well 11 mm staggered slide</td>
			<td>Cel-Line/Thermofisher Scientific</td>
			<td>&#160;30-149H-BLACK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde solution(w/v) Methanol free</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher reagents</td>
			<td>BP151-1C0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Abumin (BSA)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>CAS 9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4)</td>
			<td>Dr. Haidong Gu lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Bioreagent</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Bioreagent</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Bioreagent</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking buffer (PBS with 1% BSA and 5% Horse serum )</td>
			<td>Dr. Haidong Gu lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabiit Anti-ICP0 antibody</td>
			<td>Dr. Haidong Gu lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PML (PG-M3)-Mouse monoclonal IgG</td>
			<td>santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594-goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-goat anti-mouse IgG</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Mouting medium with DAPI</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail Polish</td>
			<td>Sally Hansen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Leica SP8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Software</td>
			<td>Leica LAS X Application suite</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel software</td>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell 150i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Order code 51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

temporal analysis of the nuclear-to-cytoplasmic translocation of a herpes simplex virus 1 protein by immunofluorescent confocal microscopy

Infekterad cell protein 0 (ICP0) av herpes simplex virus 1 (HSV-1) är en omedelbar tidiga protein som innehåller en RING-typ E3 ubiquitin ligase. Den ansvarar för proteasomen degraderingen av värd begränsande faktorer och efterföljande viral genen aktivering. ICP0 innehåller en kanonisk cellkärnelokalisering sekvens (NLS). Det in i kärnan omedelbart efter de novo syntes och exekverar dess anti värd försvar funktioner främst i kärnan. Dock senare i infektion finns ICP0 enbart i cytoplasman, vilket tyder på förekomsten av en kärn-till-Cytoplasmatisk flyttning under HSV-1 infektion. Förmodligen kan ICP0 flyttning ICP0 att modulera dess funktioner enligt dess subcellulär platser på olika infektion faser. För att avgränsa den biologiska funktionen och reglerande mekanism av ICP0 kärn-till-Cytoplasmatisk translokation, modifierade vi en Immunofluorescerande mikroskopi metod för att övervaka ICP0 människohandel under HSV-1 infektion. Detta protokoll innebär Immunofluorescerande färgning, confocal Mikroskop imaging, och kärn vs. cytoplasmisk fördelning analys. Målet med detta protokoll är att anpassa steady-state confocal bilder tagna i en dags kurs i en kvantitativ dokumentation av ICP0 rörelse i hela lytisk infektionen. Vi föreslår att denna metod kan generaliseras för att kvantitativt analysera nukleära vs. cytoplasmiska lokalisering av andra virus eller cellulära proteiner utan att involvera levande bildteknik.

För att förstå de molekylära och biologiska funktioner för ICP0 människohandel under HSV-1 infektion, använder vi en Immunofluorescerande mikroskopi metod för att analysera ICP0 subcellulär fördelning på olika infektion faser. Figur 1 visar representativa cellerna med distinkta ICP0 lokalisering som infektion fortskrider. För att kvantifiera den kärn-till-Cytoplasmatisk flyttning av ICP0, analyserar vi ICP0 fördelning i förhållande till kärna...

Watch this Scientific Journal Video about Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy at JoVE.com

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Temporal analys av det kärn-till-Cytoplasmatisk translokationen av en Herpes Simplex Virus 1 Protein av Immunofluorescerande konfokalmikroskopi

ICP0 genomgår kärn-till-Cytoplasmatisk translokation vid HSV-1 infektion. Den molekylära mekanismen av denna händelse är inte känd. Här beskriver vi användningen av confocal Mikroskop som ett verktyg för att kvantifiera ICP0 rörelse i HSV-1 infektion, som lägger grunden för kvantitativt analysera ICP0 flyttning i framtida mekanistiska studier.

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom proteinhandel området om nukleära och cytoplasmiska flyttning i system där ljus avbildning inte är tillgänglig. Den största fördelen med denna teknik är att den kan tillämpas som ett allmänt protokoll för studier av temporal protein rörelse utan att involvera ljus imaging. 20 till 24 timmar innan viruset infektion utsäde 5 gånger 10 till 4 mänskliga embryonala lungan eller HEL fiber blast celler per brunn på en fyra väl 11 millimeter förskjutna bild och tillväxt medium för natten inkubation vid 37 grader Celsius med fem procent koldioxid.Det är viktigt att klippa bilden ordentligt för att säkerställa en jämn fördelning av cellerna samtidigt som man tar hand om att undvika att spilla odlingsmediet. Nästa dag, ersätta supernatanter så 70 till 80 procent konfluenta kulturer med Medium 199, som innehåller 410 plack-bildande enheter per cell, och placera bilden på 37 grader Celsius med skakning, i en timme. Vid inkubationens, ersätt supernatanterna med färskt tillväxtmedium och återför cellerna till inkubatorn för lämplig experimentell infektionsperiod.För immunofluorescerande färgning av de virusinfekterade cellerna, tvätta snabbt cellerna tre gånger med PBS. Följt av en åtta till tio minuters inkubation i 200 mikroliter av fyra procent paraformaldehyd i PBS per brunn. Vid slutet av fixeringen, tvätta cellerna tre gånger med 200 mikroliter PBS per tvätt, och permeabilisera cellerna med 100 mikroliter av 0,2 procent icke-joniska ytaktiva ämnen per brunn i fem till tio minuter.Tvätta de permeabiliserade cellerna tre gånger i PBS som det visas, och tillsätt 200 mikroliter av blockerande buffert till varje brunn för en timmes inkubation vid rumstemperatur. Därefter lägger du till lämplig koncentration av den primära antikroppen av intresse till varje brunn för en två timmars rumstetemperaturinkubation. Vid slutet av inkubationen, avlägsna eventuell obunden primärantikropp med tre, tiominuterstvättar i färsk blockerande buffert, och tillsätt en lämplig sekundär antikropp till varje brunn för en timmes inkubation vid rumstemperatur, skyddad från ljus.I slutet av inkubationen, tvätta cellerna tre gånger i en blockerande buffert som visats, följt av en tvätt i PBS och tillsätt en droppe antifade monteringsmedium kompletterat med DAPI till varje brunn. Placera sedan en överdragsglidning över rutschkanan och täta täcklutningen med genomskinligt nagellack. Om du applicerar försiktigt tryck medan du monterar täckslitet kommer det att avlägsna eventuellt överskottsstubbes, vilket bidrar till att säkerställa anskaffning av högkvalitativa bilder.För konfokal avbildning av de märkta, infekterade cellerna väljer du lämplig sekundär antikropp och DAPI-våglängder och ställer in bildformatet till 1, 024 med 1, 024 pixlar med en genomsnittlig rad på åtta. Sedan bild varje brunn på fyra-väl bild under 100x målet. För att räkna ett stort antal celler, få fem till tio bilder från på varandra följande fält i samma brunn under 40x målet.För att analysera den nukleära och cytoplasmiska distributionen av ICP0, öppna projektet i konfokalapplikationsprogramvaran och välj en bild. Öppna fliken Antal och välj Sortera regioner av intresse på verktyg-menyn. Välj Rita linje, och rita en längsgående linje över cellen som ska analyseras.Ett histogram kommer att visas som visar fluorescens intensitet längs linjen för både protein av intresse, och DAPI. Baserat på bakgrunden färgning, inrätta en konstant tröskel för intensiteten av proteinet av intresse för analys av sub-cellulära fördelningen av proteinet i varje experiment. Om proteinsignalen i genomsnitt ligger under tröskeln i kärnregionen, men ligger över tröskeln bortom DAPI-gränsen, kategorisera proteinsignalen som övervägande beläget inom cytoplasman.Om proteinsignalen är över tröskeln i hela kärnan, och bortom gränsen för DAPI-signalen, gruppera proteinsignalen som en kärna plus cytoplasmatisk lokalisering. Om proteinsignalen är över tröskeln i kärnan, men i genomsnitt är under tröskeln utanför gränsen för DAPI signalgruppen proteinsignalen som en nukleär lokalisering. Slutligen, tabbulera mer än 200 infekterade celler från varje prov vid olika infektion tidpunkter, och rita data i en stapel graf för att illustrera förflyttning av proteinet av intresse över tiden.Som visats, underlättar denna metod analys av kärn-till-cytoplasmatisk flyttning av proteiner av intresse. Till exempel, infekterade cellprotein noll, eller ICP0 subcellulär distribution ändras som en virusinfektion fortskrider. För att förstå de element som krävs för ICP0-handel under infektion, kan ICP0-rörelser spåras i Wild Type och Mutant Type Herpes Simplex Virus 1-infekterade celler vid olika infektionsfaser, vilket möjliggör utvärdering av sub-cellulär distribution av ICP0 vid olika tidpunkter för infektion.Det är viktigt att komma ihåg att använda monolayerkulturer så virionerna har lika tillgång till cellerna och att normalisera infektionens mångfald enligt virustiteln så att infektionsprogression är jämförbar mellan och inom virus. Efter varje utveckling banade denna teknik väg för forskare inom biologi och cell virologi att utforska proteinrörelser genom att studera de tidsmässiga subcellulära lokaliseringarna av proteiner av intresse inom en cellpopulation.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Mikrovågsassisterad snabb diagnos av växtsjukdomar virus genom transmissionselektronmikroskopi

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Intravital Mikroskopi av mjälte: Kvantitativ analys av Parasit Rörlighet och blodflöde

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

Detektion av toxin Translokation i den mottagande cytosolen genom Surface Plasmon Resonance

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

En primär Neuron odlingssystem för studier av Herpes simplex virus latens och återaktivering

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

Isolering och Genome Analys av Single Virioner använder &quot;enda virus Genomics &#39;

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Bedöma Antifungal aktivitet av isolerat alveolära makrofager av konfokalmikroskopi

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Co-immunoprecipitation av Mouse Mx1 Protein med influensa A-virus nukleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex vivo Infektion av Murine Epidermis med herpes simplex virus typ 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analys av<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effector translokation i värdceller Använda Beta-laktamas Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...