Name: temporal analysis of the nuclear-to-cytoplasmic translocation of a herpes simplex virus 1 protein by immunofluorescent confocal microscopy
Uploaded: 2018-11-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy at JoVE.com

Biz mali desteği Haidong Gu için layık bir NIH hibe (RO1AI118992) teşekkür ederim. Wayne State Üniversitesi'nde mikroskobu, görüntüleme ve sitometresi kaynakları (MICR) çekirdek tesis teknik destek için teşekkür ediyoruz.

1. hücre tohum ve virüs enfeksiyonu
<ol><li>Virüs enfeksiyonu önce 20-24 h 5 x 104 insan embriyonik akciğer (HEL) fibroblast hücreleri veya diğer hücreler büyüme orta (Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (% 10 ile fetal sığır takıma DMEM) 4-şey 11 mm sendeleyerek slayttaki incelenmesine tohum Serum (FBS)). %5 karbondioksit (CO2) ile 37 ° C'de hücreler kuluçkaya. Not: Her şey enfeksiyon anda % 70-80 cep confluency olmalıdır.</li>
	<li>Ertesi gün, büyüme orta kaldırmak ve ...

<ol>
	<li>Whitley, R., Kimberlin, D. W., Prober, C. G., Arvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+disease.">Pathogenesis and disease.</a> Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. , (2007).</li><li>Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., Knipe, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+viruses.">Herpes simplex viruses.</a> Fields' Virology. , 1823-1897 (2013).</li><li>Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infected+cell+protein+0+functional+domains+and+their+coordination+in+herpes+simplex+virus+replication.">Infected cell protein 0 functional domains and their coordination in herpes simplex virus replication.</a> World Journal of Virology. 5 (1), 1-13 (2016).</li><li>Lopez, P., Van Sant, C., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+the+nuclear-cytoplasmic+translocation+of+infected-cell+protein+0+of+herpes+simplex+virus+1.">Requirements for the nuclear-cytoplasmic translocation of infected-cell protein 0 of herpes simplex virus 1.</a> Journal of Virology. 75 (8), 3832-3840 (2001).</li><li>Kawaguchi, Y., Van Sant, C., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+1+alpha+regulatory+protein+ICP0+interacts+with+and+stabilizes+the+cell+cycle+regulator+cyclin+D3.">Herpes simplex virus 1 alpha regulatory protein ICP0 interacts with and stabilizes the cell cycle regulator cyclin D3.</a> Journal of Virology. 71 (10), 7328-7336 (1997).</li><li>Mullen, M. A., Ciufo, D. M., Hayward, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+intracellular+localization+domains+and+evidence+for+colocalization+interactions+between+the+IE110+and+IE175+nuclear+transactivator+proteins+of+herpes+simplex+virus.">Mapping of intracellular localization domains and evidence for colocalization interactions between the IE110 and IE175 nuclear transactivator proteins of herpes simplex virus.</a> Journal of Virology. 68 (5), 3250-3266 (1994).</li><li>Maul, G. G., Everett, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+location+of+PML,+a+cellular+member+of+the+C3HC4+zinc-binding+domain+protein+family,+is+rearranged+during+herpes+simplex+virus+infection+by+the+C3HC4+viral+protein+ICP0.">The nuclear location of PML, a cellular member of the C3HC4 zinc-binding domain protein family, is rearranged during herpes simplex virus infection by the C3HC4 viral protein ICP0.</a> Journal of General Virology. 75 (6), 1223-1233 (1994).</li><li>Chelbi-Alix, M. K., de The, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+virus+induced+proteasome-dependent+degradation+of+the+nuclear+bodies-associated+PML+and+Sp100+proteins.">Herpes virus induced proteasome-dependent degradation of the nuclear bodies-associated PML and Sp100 proteins.</a> Oncogene. 18 (4), 935-941 (1999).</li><li>Zheng, Y., Samrat, S. K., Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tale+of+Two+PMLs:+Elements+Regulating+a+Differential+Substrate+Recognition+by+the+ICP0+E3+Ubiquitin+Ligase+of+Herpes+Simplex+Virus+1.">A Tale of Two PMLs: Elements Regulating a Differential Substrate Recognition by the ICP0 E3 Ubiquitin Ligase of Herpes Simplex Virus 1.</a> Journal of Virology. 90 (23), 10875-10885 (2016).</li><li>Lanfranca, M. P., Mostafa, H. H., Davido, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSV-1+ICP0:+An+E3+Ubiquitin+Ligase+That+Counteracts+Host+Intrinsic+and+Innate+Immunity.">HSV-1 ICP0: An E3 Ubiquitin Ligase That Counteracts Host Intrinsic and Innate Immunity.</a> Cells. 3 (2), 438-454 (2014).</li><li>Zheng, Y., Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+three+redundant+segments+responsible+for+herpes+simplex+virus+1+ICP0+to+fuse+with+ND10+nuclear+bodies.">Identification of three redundant segments responsible for herpes simplex virus 1 ICP0 to fuse with ND10 nuclear bodies.</a> Journal of Virology. 89 (8), 4214-4226 (2015).</li><li>Samrat, S. K., Ha, B. L., Zheng, Y., Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Elements+Regulating+the+Nuclear-to-Cytoplasmic+Translocation+of+ICP0+in+Late+Herpes+Simplex+Virus+1+Infection.">Characterization of Elements Regulating the Nuclear-to-Cytoplasmic Translocation of ICP0 in Late Herpes Simplex Virus 1 Infection.</a> Journal of Virology. 92 (2), e01673-e01617 (2018).</li><li>Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+role+does+cytoplasmic+ICP0+play+in+HSV-1+infection?.">What role does cytoplasmic ICP0 play in HSV-1 infection?.</a> Future Virology. 13 (6), (2018).</li><li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+live+cell+imaging.">Fluorescence live cell imaging.</a> Methods Cell Biology. 123, 77-94 (2014).</li><li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+microscopy+-+tips+and+tools.">Live-cell microscopy - tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+as+a+toolkit+for+in+vivo+imaging.">Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging.</a> Trends in Biotechnology. 23 (12), 605-613 (2005).</li><li>Teng, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+proteins+inside+living+cells+using+external+fluorophores+for+microscopy.">Labeling proteins inside living cells using external fluorophores for microscopy.</a> Elife. 5, e20378 (2016).</li><li>Stephens, D. J., Allan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+microscopy+techniques+for+live+cell+imaging.">Light microscopy techniques for live cell imaging.</a> Science. 300 (5616), 82-86 (2003).</li></ol>

Bu iletişim kuralı HSV-1 ICP0 nükleer-için-sitoplazmik translocation çalışma kullanılmaya başlanmıştır. ICP0 hücre altı HSV-1 enfeksiyonu (Şekil 1) sırasında kaçakçılığı uğrar. Büyük olasılıkla, ICP0 farklı yerlerde farklı işlevleri gerçekleştirmek için çeşitli hücre yolları ile etkileşim kurar. Bu ICP0 birden çok fonksiyonları halat çekme insan konak13ile ince ayar sağlar. Ancak, ne kadar ICP0 birden fazla işlevi uzamsal-za...

Herpes simpleks virüsü 1 (HSV-1) hafif ağır herpetik hastalığa herpes labialis, genital herpes, stromal keratit ve ensefalit gibi geniş bir dizi neden olur. Enfekte sonra Virüs sinir gangliyon hücreleri bir ömür boyu latent enfeksiyon oluşturur. Zaman zaman, virüs gibi ateş, stres ve bağışıklık suppression1tekrarlayan herpes enfeksiyonu için önde gelen, çeşitli nedenlerle tarafından etkinleştirilebilir. Enfekte hücre proteindir 0 (ICP0) bir anahtar viral regülatörü litik ve gizli HSV-1 enfeksiyonu için çok önemli. Ana bilgisayar içsel/doğuştan gelen antiviral savunma2,3mücadele aşağı akım virüs genleri ile transactivates. ICP0 proteasome bağlı bozulma3için çeşitli hücre faktörler hedefleyen bir E3 Ubikuitin ligaz etkinlik vardır. Ayrıca çeşitli hücre yolları faaliyetlerini düzenleyen ve daha sonra ana bilgisayar antiviral kısıtlamaları3dengelemek için etkileşim kurar. ICP03,4,5enfeksiyon devam ederken farklı hücre altı bölmeleri bulmak için bilinir. Protein artıkları 500-5066' bulunan bir lisin/arginin-zengin nükleer yerelleştirme Uyarısı (NLS) vardır. Erken HSV-1 enfeksiyonu, de novo sentezi ICP0 hemen çekirdek alınır. Bu ilk yapısı olarak adlandırılan nükleer etki alanı 10 (ND10) bir dinamik nükleer tespit7. ICP0 E3 Ubikuitin ligaz etkinliği ND10 düzenleyici proteinler, promyelötik lösemi (PML) protein ve benekli protein 100 kDa (Sp100)8,9,10bozulması tetikler. Organizatör protein kaybı sonra ND10 nükleer ceset dağınık ve ICP0 tüm çekirdek4,11doldurmak için yayılmış.
İlginçtir, viral DNA ikileşmesi başlangıcı sonra ICP0 çekirdek kaybolur. Bu sadece bir nükleer-için-sitoplazmik translocation HSV-1 enfeksiyonu4,12içinde geçtiği öne sitoplazmada bulunur. DNA ikileşmesi şartı HSV-1 ICP04,12sitoplazmik translocation kolaylaştıran bir geç viral protein(s) potansiyel katılımı anlamına gelir. Görünüşe göre ICP0 farklı bölmeler arasında enfeksiyon sırasında kaçakçılığı ICP0 onun etkileşimlerine uzamsal-zamansal bir biçimde çeşitli hücresel yolları modüle güçlendirir ve bu nedenle koordinat ince ayar yapmak için birden fazla işlevleri arasındaki dengeyi ayarlama litik gizli HSV-1 enfeksiyonu ve13. ICP0 Çokişlevlilik ve ICP0 işlevsel etki alanları boyunca litik enfeksiyon koordinasyonu daha iyi anlamak için dikkatli bir şekilde dinamik ICP0 translocation12moleküler temeli kesmiştim. Mekanik çalışmaları daha önce bildirilen12yapmak için farklı enfeksiyon durumu confocal mikroskop altında ICP0 hücre altı yerelleştirme görselleştirmek için immünfloresan boyama yöntemi uyguladım. Ayrıca confocal yazılımını kullanarak nükleer vs. sitoplazmik dağıtımını ICP0 analiz için nicel bir protokol geliştirdik. HSV-1 enfekte hücreleri nüfusu enfeksiyon aşamaları sekmeli ve farklı biyokimyasal tedavilerin12altında ICP0 hareketinin eğilimleri analiz edildi. Burada detaylı iletişim kuralı bu belgeleri ICP0 translocation HSV-1 enfeksiyonu içinde açıklayın. Önerdiğimiz bu yöntem nükleer vs. sitoplazmik translocation canlı görüntüleme tekniği nedeniyle uygulanamaz olduğunu ne zaman canlı görüntüleme alternatif olarak hizmet verebilir diğer viral veya hücresel proteinler için eğitim için genel bir yöntem olarak kabul edilmesi yöntemi, sinyal şiddeti veya protein bereket etiketleme gibi sorunları.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells and viruses</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Embryonic Lung fibroblasts (HEL Cells)</td>
			<td>Dr. Thomas E. Shenk (Princeton University)</td>
			<td></td>
			<td>HEL cells were grown in DMEM supplemented with 10% FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 viral Stock (Strain F)</td>
			<td>Dr. Bernard Roizman Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0926-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium-199 (10X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11825-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4- well 11 mm staggered slide</td>
			<td>Cel-Line/Thermofisher Scientific</td>
			<td>&#160;30-149H-BLACK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde solution(w/v) Methanol free</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher reagents</td>
			<td>BP151-1C0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Abumin (BSA)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>CAS 9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4)</td>
			<td>Dr. Haidong Gu lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Bioreagent</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Bioreagent</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Bioreagent</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking buffer (PBS with 1% BSA and 5% Horse serum )</td>
			<td>Dr. Haidong Gu lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabiit Anti-ICP0 antibody</td>
			<td>Dr. Haidong Gu lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PML (PG-M3)-Mouse monoclonal IgG</td>
			<td>santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594-goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-goat anti-mouse IgG</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Mouting medium with DAPI</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>13-678-20D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail Polish</td>
			<td>Sally Hansen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Leica SP8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Software</td>
			<td>Leica LAS X Application suite</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel software</td>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell 150i CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Order code 51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

temporal analysis of the nuclear-to-cytoplasmic translocation of a herpes simplex virus 1 protein by immunofluorescent confocal microscopy

Enfekte hücre protein herpes simpleks virüsü 1 (HSV-1) 0 (ICP0), bir halka tipi E3 Ubikuitin ligaz içeren acil bir erken proteindir. Ana bilgisayar kısıtlayıcı faktörler ve sonraki viral gen harekete geçirmek proteasomal bozulması için sorumludur. ICP0 bir kanonik nükleer yerelleştirme sıra (NLS) içerir. Hemen de novo sentezi sonra çekirdek girer ve anti-konak savunma fonksiyonları çekirdeğinde esas olarak yürütür. Ancak, daha sonra enfeksiyon, sitoplazma içinde yalnızca, HSV-1 enfeksiyonu sırasında bir nükleer-için-sitoplazmik translocation geçtiği öne ICP0 bulunur. Muhtemelen ICP0 translocation fonksiyonları hücre altı onun konumları göre farklı enfeksiyon aşamaları modüle ICP0 sağlar. Biyolojik işlev ve ICP0 nükleer-için-sitoplazmik translocation düzenleyici mekanizma betimlemek için ICP0 HSV-1 enfeksiyonu sırasında kaçakçılığı izlemek için bir immünfloresan mikroskopi yöntemi değiştirildi. Bu iletişim kuralı immünfloresan boyama, confocal mikroskop düşsel ve nükleer vs. sitoplazmik dağıtım analiz içerir. Bu iletişim kuralı bir saat ders boyunca litik enfeksiyon ICP0 hareketinin niceliksel bir dokümantasyon içine çekilen kararlı duruma confocal görüntüler adapte hedeftir. Önerdiğimiz bu yöntem canlı görüntüleme teknolojisi içeren olmadan nükleer vs diğer viral veya hücresel proteinler sitoplazmik yerelleştirilmesini kantitatif analiz etmek için genelleştirilmiş.

Moleküler temeli ve ICP0 HSV-1 enfeksiyonu sırasında ticareti Biyolojik işlevleri anlamak için biz bir immünfloresan mikroskopi yöntemi farklı enfeksiyon aşamaları, ICP0 hücre altı dağılım çözümlemek için kullanın. Şekil 1 enfeksiyon ilerledikçe farklı ICP0 yerelleştirme temsilcisi bulunduğu hücreleri gösterir. ICP0 nükleer-için-sitoplazmik translocation ölçmek, ICP0 dağıtım çekirdeği göre üç gruba enfekte hücreleri kat...

Watch this Scientific Journal Video about Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy at JoVE.com

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Herpes Simplex Virüsü 1 protein immünfloresan Confocal mikroskobu tarafından nükleer-için-sitoplazmik Translocation zamansal Analizi

ICP0 HSV-1 enfeksiyonu sırasında nükleer-için-sitoplazmik translocation uğrar. Bu olay moleküler mekanizması bilinmemektedir. Burada biz confocal mikroskop ICP0 translocation gelecek mekanik çalışmalarda kantitatif analiz etmek için zemin bırakır HSV-1 enfeksiyonu hareketinde ICP0 ölçmek için bir araç olarak nasıl kullanılacağını açıklar.

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...

Bu yöntem, ışık görüntülemenin mevcut olmadığı sistemde nükleer ve sitoplazmik translokasyon ile ilgili protein ticareti alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, ışık görüntülemesi dahil olmadan temporal protein hareketinin incelenmesi için genel bir protokol olarak uygulanabilen olmasıdır. 20-24 saat önce virüs enfeksiyonu tohum 5 kez 10 4 insan embriyonik akciğer veya HEL lif patlama hücreleri iyi bir dört kuyu 11 milimetre sendeledi slayt ve büyüme orta gece kuluçka için 37 derece santigrat yüzde beş karbondioksit ile.Kültür ortamının dökülmesini önlemeye özen gösterirken hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için slaytı iyice sallamak önemlidir. Ertesi gün, süpernatants değiştirin böylece 70-80 yüzde kabarık kültürler Orta 199 ile, hücre başına 410 plak şekillendirme birimleri içeren, ve sallayarak 37 derece santigrat slayt yerleştirin, bir saat boyunca. Kuluçka sonunda, supernatants taze büyüme ortamı ile değiştirin ve uygun deneysel enfeksiyon dönemi için kuvöz hücreleri iade.Virüs bulaşmış hücrelerin immünoffloresan boyama için, hızlı pbs ile üç kez hücreleri yıkayın. Bunu, pbs'de %4'lük paraformaldehitin 200 mikrolitresinde 8-10 dakikalık bir kuluçka. Fiksasyon sonunda, yıkama başına 200 mikrolitre PBS ile hücreleri üç kez yıkayın ve beş ila on dakika boyunca iyi başına yüzde 0,2 non-iyonik yüzey aktif 100 mikrolitre ile hücreleri permeabilize.Permeabilize hücreleri gösterildiği gibi PBS'de üç kez yıkayın ve oda sıcaklığında bir saatlik kuluçka için her kuyuya 200 mikrolitre engelleme tamponu ekleyin. Daha sonra, iki saatlik oda sıcaklığında kuluçka için her kuyuya ilgi birincil antikor uygun konsantrasyonekleyin. Kuluçka sonunda, taze engelleme tamponunda üç, on dakikalık yıkar ile herhangi bir bağlanmamış birincil antikor kaldırın ve oda sıcaklığında bir saatlik kuluçka için her kuyuya uygun bir ikincil antikor ekleyin, ışıktan korunan.Kuluçka sonunda, gösterildiği gibi bir engelleme tampon hücreleri üç kez yıkayın, PBS bir yıkama ardından ve her kuyuda DAPI ile takviye antifade montaj ortamı bir damla ekleyin. Sonra slayt üzerine bir kapak kayma yerleştirin ve şeffaf oje ile kapak eğimmühür. Kapak fişini monte ederken hafif basınç uygulamak, fazla montaj ortamını ortadan kaldırarak yüksek kaliteli görüntülerin elde edilmesini sağlamaya yardımcı olur.Etiketli, enfekte hücrelerin konfokal görüntülemesi için uygun ikincil antikor ve DAPI dalga boylarını seçin ve görüntü biçimini ortalama sekiz satırla 1, 024 piksele ayarlayın. Daha sonra 100x hedefi altında dört kuyulu slayt üzerinde her iyi görüntü. Çok sayıda hücre saymak için, 40x hedefi altında aynı kuyudaki ardışık alanlardan beş ila on görüntü elde edin.ICP0'nin nükleer ve sitoplazmik dağılımını analiz etmek için, projeyi konfokal uygulama yazılımında açın ve bir görüntü seçin. Miktar sekmesini açın ve Araçlar menüsünden İlgi Bölgelerini Sırala'yı seçin. Draw Line'ı seçin ve çözümlenecek hücre boyunca uzunlamasına bir çizgi çizin.Bir histogram ilgi hem protein için çizgi boyunca floresan yoğunluğu gösteren görünür, ve DAPI. Arka plan boyama dayanarak, her deneyde proteinin alt hücresel dağılımının analizi için ilgi proteinyoğunluğu için sabit bir eşik kurmak. Protein sinyali, ortalama olarak, nükleer bölgedeki eşiğin altındaysa, ancak DAPI sınırının ötesinde ki eşiğin üzerindeyse, protein sinyalini ağırlıklı olarak sitoplazma içinde bulunan olarak sınıflandırın.Protein sinyali çekirdek boyunca eşiğin üzerinde yse ve DAPI sinyalinin sınırının ötesindeyse, protein sinyalini çekirdek artı sitoplazmik lokalizasyon olarak grupla. Eğer protein sinyali çekirdekteki eşiğin üzerindeyse, ancak ortalama olarak DAPI sinyal grubunun sınırının dışındaki eşiğin altındaysa, nükleer lokalizasyon olarak protein sinyali. Son olarak, her örnekten 200'den fazla enfekte hücreyi farklı enfeksiyon zaman noktalarında ayıklave zaman içinde ilgi proteininin hareketini göstermek için bir çubuk grafikteki verileri çizin.Gösterildiği gibi, bu yöntem ilgi proteinlerin nükleer-sitoplazmik translokasyon analizini kolaylaştırır. Örneğin, enfekte hücre proteini sıfır veya viral enfeksiyon ilerledikçe ICP0 hücre altı dağılımı değişir. Enfeksiyon sırasında ICP0 ticareti için gerekli unsurları anlamak için, ICP0 hareketleri Wild Type ve Mutant Type Herpes Simplex Virus 1-enfekte hücrelerde farklı enfeksiyon evrelerinde izlenebilir, enfeksiyon farklı zaman noktalarında ICP0 alt hücresel dağılımının değerlendirilmesi sağlayan.Virions hücrelere eşit erişim esahip böylece monolayer kültürleri kullanmayı hatırlamak ve enfeksiyon ilerlemesi arasında ve virüsler içinde karşılaştırılabilir böylece virüs başlığına göre enfeksiyon çokluğu normalleştirmek için önemlidir. Her gelişmeden sonra, bu teknik biyoloji ve hücre virolojisi alanlarındaaraştırmacıların hücre popülasyonu içindeki ilgi çekici proteinlerin zamansal hücre altı lokalizasyonlarını inceleyerek protein hareketini keşfetmelerinin önünü açmıştır.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Mikrodalga Transmisyon Elektron Mikroskobu ile Bitki Virüs Hastalıkları Hızlı Tanı Destekli

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Dalak intravital Mikroskopi: Parazit Mobilite ve Kan Akımının Kantitatif Analiz

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

Yüzey Plasmon Rezonans Host Cytosol Toksin Translokasyon Tespiti

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Herpes Çalışmaları A Primer Nöron Kültür Sistem Virüs gecikmesi ve Yeniden Simplex

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

&#39;Tek Virüs Genomik&#39; kullanarak Tek viryonlar İzolasyonu ve Genom Analizi

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Eşodaklı Mikroskopi İzole Alveoler Makrofagların anti-fungal Hareketi değerlendirilmesi

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

İnfluenza A virüsü nükleoproteini Fare MX1 Protein Co-immunopresipitasyonu

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Herpes Simplex virüs tip 1 ile murin Epidermis Ex ​​vivo enfeksiyon

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Analizi<em&gt; Yersinia enterocolitica</emAna Hücreleri içine&gt; Efektör Translokasyon Beta-laktamaz Effector Fusions kullanma

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...