Name: visualization of tangential cell migration in the developing chick optic tectum
Uploaded: 2018-10-24T14:30:00
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此工作由 jsp KAKENHI 授予编号15K06740 支持 Y.W。

1。蛋电穿孔
<ol><li>制备高浓度荧光标记的表达质粒 DNA。根据制造商的协议 (材料表), 使用阴离子交换柱的碱性裂解法分离200毫升细菌培养物中的 DNA。混合 pCAGGS-EGFP 和 pCAGGS-mCherryNuc 在最终浓度为4µg/µL 每个。 注: 无内毒素质粒 DNA 纯化可能是电穿孔的首选。</li>
	<li>在70% 相对湿度下, 在38摄氏度水平下孵化出肥沃的鸡卵。</li>
	<li>2.5 天后, 使用20毫升注射器与18针, 并用胶带密...

<ol>
	<li>Mar&#237;n, O., Rubenstein, J. L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+in+the+forebrain.">Cell migration in the forebrain.</a> Annual Reviews of Neuroscience. 26, 441-483 (2003).</li><li>Nadarajah, B., Alifragis, P., Wong, R. O. L., Parnavelas, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+migration+in+the+developing+cerebral+cortex:+Observations+based+on+real-time+imaging.">Neuronal migration in the developing cerebral cortex: Observations based on real-time imaging.</a> Cerebral Cortex. 13, 607-611 (2003).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipolar+migration:+the+third+mode+of+radial+neuronal+migration+in+the+developing+cerebral+cortex.">Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex.</a> Journal of Neuroscience. 23, 9996-10001 (2003).</li><li>Martini, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biased+selection+of+leading+process+branches+mediates+chemotaxis+during+tangential+neuronal+migration.">Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration.</a> Development. 136, 41-50 (2009).</li><li>Polleux, F., Whitford, K. L., Dijkhuizen, P. A., Vitalis, T., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cortical+interneuron+migration+by+neurotrophins+and+PI3-kinase+signaling.">Control of cortical interneuron migration by neurotrophins and PI3-kinase signaling.</a> Development. 129, 3147-3160 (2002).</li><li>Watanabe, Y., Yaginuma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tangential+cell+migration+during+layer+formation+of+chick+optic+tectum.">Tangential cell migration during layer formation of chick optic tectum.</a> Development, Growth and Differentiation. 57, 539-543 (2015).</li><li>Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NRP1-mediated+Sema3A+signals+coordinate+laminar+formation+in+the+developing+chick+optic+tectum.">NRP1-mediated Sema3A signals coordinate laminar formation in the developing chick optic tectum.</a> Development. 141, 3572-3582 (2014).</li><li>Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersing+movement+of+neuronal+tangential+migration+in+superficial+layers+of+the+developing+chick+optic+tectum.">Dispersing movement of neuronal tangential migration in superficial layers of the developing chick optic tectum.</a> Developmental Biology. 437, 131-139 (2018).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).</li><li>Cordelie&#768;res, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+cell+tracking+and+analysis+in+phase-contrast+videos+(iTrack4U):+development+of+Java+software+based+on+combined+mean-shift+processes.">Automated cell tracking and analysis in phase-contrast videos (iTrack4U): development of Java software based on combined mean-shift processes.</a> PLOS One. 8, e81266 (2013).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li></ol>

上述协议针对浅层6、8中的细胞迁移进行了优化。它适用于检测中间层迁移流 (电影 5)6,7, 只是通过改变电穿孔的时间 (E5.5 到 E4.5) 和文化和成像的起始 (E7.0 到 E6.0)。
所提出的程序由蛋、扁平安装培养和时移共聚焦成像 (图 1)中的电穿?...

随着实时成像技术的进步, 细胞迁移研究也在不断发展。荧光细胞标记后, 在培养皿或体内标记细胞的时间运动可以记录在视频显微镜下。在神经发育研究中, 采用时移成像技术分析了移植细胞或伸长轴突的形态学变化。为了有效的成像, 在实验和分析的目的基础上, 应用合适的荧光细胞标记和组织制备方法是非常必要的。为了分析发育中大脑中的细胞迁移, 切片培养通常用于观察与切片部分平行的细胞迁移, 如径向细胞迁移1、2、3。切片培养系统也用于检测切向细胞迁移4,5, 但它不适合定向分析的情况下, 细胞分散垂直于切片部分。
光学顶盖由在胚胎发育过程中由径向和切向细胞迁移形成的多层结构组成。顶盖层的形成主要依赖于心室区分裂后神经元前体细胞的径向迁移, 其最终终点与心室区6的出生日期相关。对于切向迁移, 我们以前报告了发展中的小鸡光学顶盖中和表层的两个迁移流。在 E6-E8 期间的中层层中, 具有长前导过程和薄尾随过程的双极性细胞迁移背或腹侧沿顶盖传出轴突束运行手背-腹侧7。在 axophilic 迁移后, 细胞分化为位于深层的多极神经元。在 E7-E14 的表层层中, 迁移细胞通过重整分枝前导过程并分散到多个方向8, 水平离散。在分散迁移后, 后体细胞最终分化为各种形态的表面神经元。在这两种情况下, 平板式培养都能有效观察与软脑膜表面平行的细胞运动。
在这里, 我们提出了一个延时成像协议, 用于可视化发展中的小鸡光学顶盖7,8中的切向细胞迁移。在蛋中通过电穿孔将细胞标记结合在一起, 然后在细胞培养插入物上进行扁平安装培养, 可以检测迁移的细胞移动和迁移方向。该方法的目的是促进检测在长期的单个细胞行为和一组细胞在水平平面的集体行动。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Midi Plus EF</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>740422.5</td>
			<td>endotoxin-free plasmid DNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml syringe</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SS-20ESZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 gauge needle</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>NN-1838R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green</td>
			<td>Wako</td>
			<td>061-00031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x penicillin and streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass capillary tube</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>G-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture insert</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Millicell CM-ORG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>L2020</td>
			<td>coating of culture insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-Lysine</td>
			<td>Peptide Institute</td>
			<td>3075</td>
			<td>coating of culture insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass bottom dish</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>D11130H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td>culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765-054</td>
			<td>culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12483</td>
			<td>culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chick serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16110082</td>
			<td>culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10xHBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microsurgical knife</td>
			<td>Surgical specialties cooperation</td>
			<td>72-1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved scissors</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>No.11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropipette processor</td>
			<td>SUTTER INSTRUMENT</td>
			<td>P97/IVF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps-type electrode</td>
			<td>BEX</td>
			<td>LF646P3x3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pulse generator</td>
			<td>BEX</td>
			<td>CUY21EX</td>
			<td>electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescence stereoscopic microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gas controller</td>
			<td>Tokken</td>
			<td>MIGM/OL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>temperature controller</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>MI-IBC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser confocal unit</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of tangential cell migration in the developing chick optic tectum

延时成像是分析迁移细胞行为的有力方法。荧光细胞标记后, 可在影像显微镜下记录培养中标记细胞的运动。为了分析发育中大脑中的细胞迁移, 切片培养通常用于观察与切片部分平行的细胞迁移, 如径向细胞迁移。但是, 可以从切片区域性方法获得有限信息, 以分析垂直于切片部分的单元迁移, 如切线单元迁移。在这里, 我们提出了延时成像的协议, 用于可视化发展中的小鸡光学顶盖中的切向细胞迁移。通过电穿孔蛋细胞标记的组合以及细胞培养插入物上的随后的扁平安装培养, 可以检测水平平面中的迁移细胞运动。此外, 我们的方法有助于检测单个细胞的行为和一组细胞在长期的集体行动。该方法可用于检测荧光标记微结构的序列变化, 包括非神经组织中神经组织或细胞移位的轴突伸长。

图 2显示了在记录开始后, 在经过一段时间 (0、9、18、27 h) 的平面安装培养中可视化的表面切向偏移。电影1是一段10分钟的延时电影, 间隔时间为28小时和50分钟。选择该框架的目的是聚焦从帧的左下角到未标记空间的迁移单元格 (图 3A)。迁移细胞 (GFP; 左上面板,电影 1) 及其原子?...

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Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

发展中雏鸡光学顶盖中切向细胞迁移的可视化

我们描述了通过电穿孔荧光标记切向迁移细胞的方法, 以及在扁平支架培养中标记细胞运动的延时成像, 以可视化发展中的小鸡光学顶盖的迁移细胞行为。.

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

这种方法可以帮助回答发育生物学领域的关键问题，如神经元细胞迁移的机制。此技术的主要优点是，您可以长期检测单个和集体细胞迁移。通过碱性解解法隔离200毫升细菌培养物后，混合两个质粒，使每个质粒的最终浓度为每微升4微克。在70%的相对湿度下，在38摄氏度的温度下水平孵育肥卵。两天半后，使用20毫升注射器与18表针，以消除5毫升白素从鸡蛋的尖侧。用胶带密封孔。接下来，用弯曲的剪刀切割蛋壳的顶部，并打开一个直径两厘米的洞。在立体显微镜下，检查胚胎的发育阶段。用胶带密封这个更大的孔。在 38 摄氏度和 70% 的相对湿度下继续孵育，直到 E5.5。在电穿孔之前，准备10微升的上述质粒DNA，用0.5微升的快绿色着色。此外，准备10毫升的自专利化PBS，每毫升青霉素含有100个单位，每毫升链霉素含有100微克。使用微管处理器准备由玻璃毛细管制成微管。将微管的端角切成适当的孔径，以用于注射的 DNA 量。用剪刀切割密封的顶壳，重新打开一个直径两厘米半的孔，并在立体显微镜下稳定地设置鸡蛋。将几滴准备好的PBS溶液放入鸡蛋中。使用两个精细钳子，剥离覆盖胚胎的艾伦托膜，小心不要引起出血。然后从胚胎的头部取出安尼翁。使用微孔转头时，使用连接到吸管的微管将 0.1 至 1 微升的彩色 DNA 注入左侧光学肿瘤的心室腔中。在光学图的目标区域周围放置一对钳子型电极。使用脉冲发生器以 5 毫秒的间隔为 30 伏特的预脉冲充电 1 毫秒，以 10 毫秒的间隔为 5 毫秒的后续脉冲充电 5 毫秒。之后，用胶带密封孔，并在38摄氏度和70%的相对湿度下继续孵育。将电极浸泡在装满 PBS 的塑料盘中，并使用齿间刷去除白化胶。重复从初始壳切割到每个鸡蛋的电穿孔的过程。平山培养前一天，开始准备编码细胞培养插入通过添加自 <3> <3>ave蒸馏水到10厘米的细胞培养皿。漂浮一些细胞培养物插入水面。在含有8微克每毫升层压，和80微克每毫升波莉L，确保覆盖插入。在37摄氏度的细胞培养物中孵育过夜的二氧化碳孵化器。在 E7.0 培养之日，从插入中删除层氨和聚 l-lysine 溶液。然后，将插入转移到装满 1.1 毫升培养介质的玻璃底盘。将菜转移到37摄氏度的细胞培养物二氧化碳培养箱。在倒置共体显微镜上设置一个潮湿的腔室单元，其气体流量为 40% 氧气和 5% 二氧化碳，温度为 38 摄氏度。要开始在插入物上准备组织样本，请使用钳子将胚胎头捏入含有冰冷的HPS的六厘米细胞培养盘中。使用两个精细钳子隔离电穿孔光学技术。然后用塑料滴管将其转移到一个凹玻璃盘中，该盘以黑色硅为基础，并充满冰冷的HSS。在荧光立体显微镜下检查标签的位置。使用微型手术刀，切掉标签周围的肠结组织，同时注意到肿瘤中组织的方向。在此之后，使用塑料滴管将标记的组织转移到"插入"，以便销侧连接到"插入"。将肠组织放在所需方向，并去除任何多余的HSS。对用于同一插入的任何其他组织样本重复组织制备过程。然后将盘子放在倒置共体显微镜的预制室中。使用倒置共聚焦显微镜检查荧光标记并聚焦微观领域。启动激光共合装置。对共体扫描进行采样，以调整组织沿现场 x 轴和 y 轴的方向和位置。接下来，选择扫描大小。确定沿 z 轴进行共和扫描的间隔和总范围。在 100 微米范围内，以 5 或 10 微米的间隔。选择共声成像的时间间隔和总成像持续时间。设置共和运行程序的参数后，开始成像。成像完成后，将不同 C 轴的共聚焦图像组合在一起，生成 z 堆栈图像，并在每个时间点进行最终焦距调整。然后在不同的时间点追加 Z 堆栈图像以构造延时影片。在这项研究中，细胞迁移通过奥沃的电穿孔、扁平安装细胞培养和延时共合成像在浅层中检测。在记录开始之后零小时、九小时、十八小时和二十七小时，在这里可以看到光学肿瘤表面层的切线迁移细胞和核。在28小时50分钟的间隔10分钟的延时影片，显示了迁移细胞及其核的质量运动。合并的影片清楚地显示了迁移单元格的质量运动。可以通过聚焦从标记中心到所有方向的分散细胞来检查细胞迁移的方向性。核运动的清晰图像允许使用粒子跟踪插件自动跟踪核迁移。可以可视化切向迁移轨迹的时态变化，并证明分散迁移是全方位的。可以在五分钟间隔内拍摄更高的放大图像。通过前导过程、尾随过程和核的顺序形态变化来研究单个细胞行为。按照此过程，可以执行照明操作的标签。为了回答其他问题，如阿克苏姆指导的机制。

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