Name: simultaneous study of the recruitment of monocyte subpopulations under flow in vitro
Uploaded: 2018-11-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro at JoVE.com

Agradecemos o Dr. Paul Bradfield para manuscrito lendo e feedbacks. A.s. recebeu apoio financeiro do senhor Jules Thorn caridade ultramarinos Trust reg.,

Materiais humanos foram usados com o consentimento dos doadores voluntários e de acordo com os suíços comités de ética em pesquisa clínica.
1. isolamento e congelamento do Cordão Umbilical humano veia células endoteliais (HUVEC)
<ol><li>Adicione 5 mL da solução de revestimento para um balão de T75 (0,1 mg/mL colágeno G e gelatina de 0,2% em tampão fosfato salino PBS pH 7,4) por 30 min a 37 ° C antes de iniciar o isolamento HUVEC.</li>
	<li>Limpe o cabo com PBS, limpe-a com comp...

<ol>
	<li>Auffray, C., Sieweke, M. H., Geissmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+Monocytes:+Development,+Heterogeneity,+and+Relationship+with+Dendritic+Cells.">Blood Monocytes: Development, Heterogeneity, and Relationship with Dendritic Cells.</a> Annual Review of Immunology. 27 (1), 669-692 (2009).</li><li>De Palma, M., Venneri, M. A., Roca, C., Naldini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+exogenous+genes+to+tumor+angiogenesis+by+transplantation+of+genetically+modified+hematopoietic+stem+cells.">Targeting exogenous genes to tumor angiogenesis by transplantation of genetically modified hematopoietic stem cells.</a> Nature Medicine. 9 (6), 789-795 (2003).</li><li>Sidibe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+factor-driven+inflammation+promotes+extravasation+of+human+proangiogenic+monocytes+to+tumours.">Angiogenic factor-driven inflammation promotes extravasation of human proangiogenic monocytes to tumours.</a> Nature Communications. 9 (1), 355 (2018).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Review Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li><li>Nourshargh, S., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+Migration+into+Inflamed+Tissues.">Leukocyte Migration into Inflamed Tissues.</a> Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).</li><li>Cros, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD14dim+monocytes+patrol+and+sense+nucleic+acids+and+viruses+via+TLR7+and+TLR8+receptors.">Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors.</a> Immunity. 33 (3), 375-386 (2010).</li><li>Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+monocytes+consist+of+two+principal+subsets+with+distinct+migratory+properties.">Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties.</a> Immunity. 19 (1), 71-82 (2003).</li><li>Chamorro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+porcine+blood+CD163&#8722;+and+CD163++monocytes+into+functional+dendritic+cells.">In vitro differentiation of porcine blood CD163&#8722; and CD163+ monocytes into functional dendritic cells.</a> Immunobiology. 209 (1-2), 57-65 (2004).</li><li>Passlick, B., Flieger, D., Ziegler-Heitbrock, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+monocyte+subpopulation+in+human+peripheral+blood.">Identification and characterization of a novel monocyte subpopulation in human peripheral blood.</a> Blood. 74 (7), (1989).</li><li>Venneri, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proangiogenic+TIE2-expressing+monocytes+(TEMs)+in+human+peripheral+blood+and+cancer.">Identification of proangiogenic TIE2-expressing monocytes (TEMs) in human peripheral blood and cancer.</a> Blood. 109 (12), 5276-5285 (2007).</li><li>Bradfield, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAM-C+regulates+unidirectional+monocyte+transendothelial+migration+in+inflammation.">JAM-C regulates unidirectional monocyte transendothelial migration in inflammation.</a> Blood. 110 (7), 2545-2555 (2007).</li><li>Schenkel, A. R., Mamdouh, Z., Muller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotion+of+monocytes+on+endothelium+is+a+critical+step+during+extravasation.">Locomotion of monocytes on endothelium is a critical step during extravasation.</a> Nature Immunology. 5 (4), 393-400 (2004).</li><li>Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+the+different+steps+during+neutrophil+migration+through+cultured+endothelial+monolayers+treated+with+tumour+necrosis+factor-alpha.">Kinetics of the different steps during neutrophil migration through cultured endothelial monolayers treated with tumour necrosis factor-alpha.</a> Journal Vascular Research. 36 (6), 477-485 (1999).</li><li>ibidi GmbH. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Shear Stress and Shear Rates for ibidi &#181;-Slides - Based on Numerical Calculations. , (2014).</li><li>Yang, L., Froio, R. M., Sciuto, T. E., Dvorak, A. M., Alon, R., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-1+regulates+neutrophil+adhesion+and+transcellular+migration+of+TNF-alpha-activated+vascular+endothelium+under+flow.">ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow.</a> Blood. 106 (2), 584-592 (2005).</li><li>Yang, C. -. R., Hsieh, S. -. L., Ho, F. -. M., Lin, W. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoy+receptor+3+increases+monocyte+adhesion+to+endothelial+cells+via+NF-kappa+B-dependent+up-regulation+of+intercellular+adhesion+molecule-1,+VCAM-1,+and+IL-8+expression.">Decoy receptor 3 increases monocyte adhesion to endothelial cells via NF-kappa B-dependent up-regulation of intercellular adhesion molecule-1, VCAM-1, and IL-8 expression.</a> Journal of Immunology. 174 (3), 1647-1656 (2005).</li><li>Wong, D., Dorovini-Zis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+vascular+cell+adhesion+molecule-1+(VCAM-1)+by+human+brain+microvessel+endothelial+cells+in+primary+culture.">Expression of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) by human brain microvessel endothelial cells in primary culture.</a> Microvascular Research. 49 (3), 325-339 (1995).</li><li>Bradfield, P. F., Nourshargh, S., Aurrand-Lions, M., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAM+family+and+related+proteins+in+leukocyte+migration+(Vestweber+series).">JAM family and related proteins in leukocyte migration (Vestweber series).</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 27 (10), 2104-2112 (2007).</li><li>Bradfield, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+JAM-C+Expression+Accelerates+Monocyte-Derived+Cell+Exit+from+Atherosclerotic+Plaques.">Divergent JAM-C Expression Accelerates Monocyte-Derived Cell Exit from Atherosclerotic Plaques.</a> PLoS One. 11 (7), e0159679 (2016).</li></ol>

Aqui, nós relatamos um método detalhando um estudo de como subpopulações de monócitos transmigrar através da monocamada endotelial inflamada. O método discutido usado microscopia confocal em vez de microscopia de contraste de fase, que também é usada para estudar o recrutamento de monócitos sob fluxo de11,3,19. Uma das principais vantagens do uso de microscopia confocal para a imagem latente de lapso de tempo é a capa...

Os monócitos constituem um componente fagocítica da imunidade inata que é essencial para o combate de patógenos, limpeza de tecidos danificados, angiogênese e a fisiopatologia de muitas doenças, incluindo câncer,1,2,3 . Os monócitos são células derivadas da medula óssea, compostas de subpopulações heterogêneas que circulam no sangue, mas podem ser recrutadas para o local da inflamação no tecido periférico, através de mecanismos moleculares específicos. As cascatas de recrutamento de monócitos, quanto aos leucócitos em geral, implica diferentes etapas, incluindo captura, rolando, rastejando, prisão, migração de transendothelial (transmigração) e migração através da parede do vaso (membrana basal e mural células)4. Estes passos envolvem principalmente moléculas induzida por inflamação na superfície luminal endotelial como selectinas, ligantes de glicoproteína, quimiocinas, moléculas de adesão intercelular e juncional e seus receptores em leucócitos como selectina ligantes e integrinas. Vias de tráfico através das junções de célula endotelial (paracellular) ou através do corpo de célula endotelial (transcellular) podem ser usadas por leucócitos de atravessar a barreira endotelial5. Enquanto os monócitos historicamente foram documentados a transmigrar através da rota de transcellular, potenciais divergências no seu percurso migratório têm sido propostas como os monócitos já não são considerados uma população celular homogênea. Agora está se tornando claro que a diversidade de monócitos podem ser definidos por cada uma das suas diferenças e semelhanças, com relação a sua distintivo extravasamento cascatas de3,6. Portanto, para inequivocamente discriminar entre subpopulações de monócitos, é crucial Visualizar e processar o fenótipo o comportamento de cada uma dessas subpopulações diferentes durante o recrutamento.
Monócitos do humano, porco, rato e rato foram subdivididos em subpopulações fenotípicas com determinadas funções anexam e comportamentos migratórios específicos7,8,9. Por exemplo, em humanos, monócitos podem ser divididos em três subgrupos com base em sua expressão de superfície de CD14, um co-receptor para lipopolissacarídeo bacteriano e CD16, o receptor de Fc-gama III. Subpopulações de monócitos humanos incluem CD14 clássica+CD16-, intermediário CD14+CD16+ e não-clássica CD14dimCD16 células de+ 6,9. O CD14 clássica+CD16– monócitos foram mostrados para ser inflamatória principalmente considerando que a piscina de CD16+ monócitos coletivamente foram encontrados para apresentar TIE2 expressão e proangiogenic função10. Consistentemente, estimulação de células endoteliais com citocinas inflamatórias, tais como necrose de tumor humano fator α (TNF) ou interleucina (IL-1) beta (inflamação convencional) é suficiente para desencadear o recrutamento completo de CD14 clássica+CD16 monócitos – . No entanto, ações simultâneas de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) A e TNFa (angiogênico orientada por fatores inflamação) são necessárias para provocar a transmigração do CD16+ proangiogenic piscina de monócitos3. Historicamente, o sistema tradicional de Transwell sob condições estáticas, a câmara de fluxo paralelo placa e câmaras de fluxo de µ-slide têm sido utilizados para analisar quantitativamente o recrutamento da população de leucócitos de um em um tempo em vitro11 ,12,13. Enquanto estes protocolos validados, um método mais robusto que permitiu a análise simultânea de várias subpopulações de monócitos seria considerado mais perspicaz. Tais metodologias devem contabilizar várias interações e as diferentes frequências de cada respectiva população e também fornecer uma compreensão mecanicista das semelhanças e especificidades para as cascatas de recrutamento que definem cada monócito subconjunto.
Aqui, apresentamos um método baseado sobre a lapso de tempo por imagens do recrutamento de monócitos sob fluxo que permite que o cascades migratórias de subpopulações diferentes monócitos para ser estudado simultaneamente usando microscopia confocal. Este método integra determinados recursos críticos que imitam a inflamação da célula endotelial, bem como a hemodinâmica de monócitos em vênulas pós-capilares, que circula o principal local de recrutamento de leucócitos em vivo. O método proposto utiliza células endoteliais veia umbilical humana (HUVEC), que são geradas através de um protocolo bem estabelecido de isolamento de cabos de cordão umbilical humanos. Este recurso clínico tem a vantagem de ser facilmente disponível como um subproduto biológico, e também proporcionar um rendimento razoável de células endoteliais, que podem ser isolados da veia umbilical. Também usamos corantes fluorescentes e imunofluorescência para distinguir entre os diferentes componentes celulares e microscopia confocal para definir inequivocamente monócito posicionamento (luminal vs abluminal) ao longo do tempo. O protocolo aqui apresentado foi desenvolvido a medida simultaneamente os níveis de transmigração de subpopulações de monócitos. Além disso, deve notar-se que esta metodologia pode ser estendida para estudar outras subpopulações de leucócitos e processos de recrutamento, pelo uso de diferentes biomarcadores e rotulagem.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Flasks 75 cm2</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90076</td>
			<td>Routine culture of isolated HUVEC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide VI 0.4</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>80606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes 15 mL</td>
			<td>TPP</td>
			<td>191015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes 50 mL</td>
			<td>TPP</td>
			<td>191050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen G</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L 7213</td>
			<td>For coating of cell culture flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1393</td>
			<td>For coating of cell culture flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (without MgCl2 and CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (with MgCl2 and CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Way Stopcocks</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>7328103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin 10000 u/ml streptomycine 10000 ug/ml fungizone 25 ug/ml</td>
			<td>AMIMED</td>
			<td>4-02F00-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 1</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199 1X avec Earle&#39;s salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>22340020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Albumin Fraction V</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Supplement, 150mg</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>02-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149RT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A 4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt dihydrate C10H14N2Na2O8 &#183; 2H2O</td>
			<td>APPLICHEM</td>
			<td>A2937.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD144 (VE-Cadherin), human recombinant clone: REA199, FITC</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-100-713</td>
			<td>AB_2655150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-PE antibody, human recombinant clone: REA730, PE</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-110-807</td>
			<td>AB_2657280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-107-016</td>
			<td>AB_2653263</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Accuri C6 Plus</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide I Luer</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>80176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C2925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human TNF&#945;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human VEGFA</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NE-1000 Programmable Syringe Pump</td>
			<td>KF Technology</td>
			<td>NE-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll&#160;Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-110-519</td>
			<td>AB_2655051</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pan Monocyte Isolation Kit, human</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-096-537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-106-762</td>
			<td>AB_2655403</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>H1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>10841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elbow Luer Connector</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>10802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Luer Lock Coupler</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>10823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock Connector Female</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>10825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-line Luer Injection Port</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td>10820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ar1 confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40X objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correction 0-2mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous study of the recruitment of monocyte subpopulations under flow in vitro

O recrutamento de monócitos do sangue para os tecidos periféricos alvo é fundamental para o processo inflamatório durante a lesão tecidual, desenvolvimento de tumor e doenças auto-imunes. Isto é facilitado através de um processo de captura de fluxo livre para a superfície luminal das células endoteliais ativadas, seguido de sua migração de adesão e transendothelial (transmigração) no tecido afetado subjacente. No entanto, os mecanismos que suportam o recrutamento preferencial e contexto-dependente de subpopulações de monócitos são ainda não são totalmente conhecidos. Portanto, nós desenvolvemos um método que permite o recrutamento de subpopulações diferentes monócitos para ser visualizado e medido sob fluxo simultaneamente. Este método, baseado na imagem latente confocal lapso de tempo, permite a distinção inequívoca entre monócitos aderentes e transmigra. Aqui, descrevemos como esse método pode ser usado para estudar simultaneamente a cascata de recrutamento de monócitos pro-angiogênico e não-angiogênico in-vitro. Além disso, este método pode ser estendido para estudar as diversas etapas do recrutamento de até três populações de monócitos.

Determinando o estado de ativação HUVEC induzida por TNFa
A bio-atividade das citocinas inflamatórias TNFa pode ser variam de acordo com o lote e o repletion do ciclo de congelamento-descongelamento. É importante verificar o status de ativação de HUVEC com tratamento de TNFa. Isso poderia ser realizada pela coloração em paralelo algumas amostras de HUVEC confluente para a indução inflamatória de selectinas, ICAM-1 e VCAM...

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Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

Aqui, apresentamos um protocolo integrado que mede subpopulação de monócitos tráfico sob fluxo in vitro pelo uso de marcadores de superfície específicas e microscopia de fluorescência confocal. Este protocolo pode ser usado para explorar etapas sequenciais de recrutamento, bem como perfil de outros subtipos de leucócitos usando outros marcadores de superfície específicos.

Estudo simultâneo do recrutamento de monócitos subpopulações sob fluxo In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

Pois este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da inflamação e imunologia. Por exemplo, quais são os mecanismos moleculares de adesão leucócito e migração trans-endotelial. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a discriminação de uso ilimitado entre transmigração e forte adição de monócitos à monocamadas endotelial.Embora este método forneça informações sobre o recrutamento de monócitos no fluxo, ele também pode ser adaptado a outras células dos sistemas hematopoiéticos, como células T, células B ou derivados da subpopulação. Após a lavagem, rotule as células endoteliais da veia umbilical humana ou HUVEC com 30 microliters de 37 graus Celsius M199 médio suplementado com um CMFDA micromolar por 10 minutos a 37 graus Celsius e 5% dióxido de carbono. Ao final da incubação, lave as células com 150 microliters de meio M199 completo e incuba a cultura em 150 microliters de meio M199 completo fresco por mais 30 minutos.Em seguida, substitua o supernascer por 150 microliters de meio M199 completo contendo os suplementos experimentais apropriados e devolva a cultura da câmara de slides à incubadora por seis horas. Para o isolamento monócito PAN humano, diluir uma amostra de sangue recém-coletada em PBS suplementada com um EDTA mililitro em uma razão de um para um e cuidadosamente camada 20 ml da solução sanguínea em 20 ml de média gradiente de densidade para separação gradiente de densidade por centrifugação. Colete a camada de plaquetas de células mononucleares de sangue médio em um novo tubo de 50 ml contendo 40 ml de PBS complementado com 1 mililitro EDTA e leve o volume final a 50 ml com PBS-EDTA adicional Após a contagem, isole os monócitos com o kit de isolamento de monócito PAN de acordo com a instrução do fabricante.E lave as células três vezes em m199 médio suplementado com 0,5% Bovine Serum Albumin, ou BSA, para eliminar quaisquer traços de EDTA. A qualidade do isolamento monócito é fundamental para garantir uma transmigração robusta e resultado de adesão. Assim, é importante seguir rigorosamente a recomendação do fabricante para o isolamento.Resuspenque a pelota a uma concentração de 6 vezes 10 a 6 monócitos por ml em m199 médio fresco complementado com 0,5% BSA e divida as células em uma alíquota de 200 microliter por tubo de microcentrifuagem por ensaio de recrutamento. Em seguida, coloque as células a 37 graus Celsius por 20 minutos antes de sua injeção na câmara de fluxo. Para preparar o sistema fluido para a análise, insira primeiro um conector luer masculino em uma extremidade de uma tubulação de silicone de 3 mm de comprimento e conecte a outra extremidade a um conjunto de injeção de luer inline.Em seguida, conecte o conector luer a uma extremidade de uma tubulação de silicone de 3 mm de comprimento de 40 cm de comprimento. Em seguida, a seringa de 20 mm para uma extremidade de um pedaço de tubo de silicone de 3mm de comprimento e 1 m de espessura e inserir um conector luer masculino para a outra extremidade. Em seguida, insira ambos os conectores luer machos em um acoalador de travas luer fêmea e coloque a extremidade livre da tubulação de silicone em um reservatório de 37 graus Celsius M199 médio suplementado com 0,5%BSA.Retire o êmbolo para encher a tubulação com tampão de fluxo e fixe a seringa na bomba de seringa. Em seguida, ajuste a bomba para o modo de retirada e especifique a taxa de fluxo. Para conectar a câmara de slides, fixar a tubulação de silicone ao redor do acotrador de luer feminino e desconectar os dois machos conectores luer do acotraente para permitir que eles sejam conectados ao reservatório do slide.As bolhas de ar não só perturbam a qualidade da imagem, mas também induzem o estresse capilar às células, levando à morte celular. Para evitar bolhas de ar, confirme a fixação correta da tubulação antes de inserir o luer no reservatório. Em seguida, remova os grampos para confirmar que a conexão não está vazando e coloque o slide sob o microscópio.Para a imagem do recrutamento de monócitos sob fluxo, adicione 5 microlitadores de farinha conjugada anticorpo anti CD16 e um corante nuclear apropriado a cada monócito aliquoed para uma incubação de 10 minutos à temperatura ambiente e colete as células com uma breve centrifugação. Resuspenque a pelota em 250 microliters de tampão de fluxo e inicie a bomba de seringa. Adicione 30 microlitros de uma suspensão monocito a uma câmara do slide e selecione o objetivo de 40X no microscópio confocal.Ative os lasers fluorescentes apropriados e use a câmara com o monócito rotulado para definir os parâmetros de aquisição do microscópio confocal Next, selecione três campos de visão dentro de um raio de meio centímetro para imagens confocal de posição multi-posição, e defina uma pilha Z para a faixa de 10 a 12 micrômetros e a aquisição de lapso de tempo para ser executada a cada um minuto. Após três minutos de imagem, injete 200 microliters de monócitos através da porta de injeção de luer inline e comece a fotografar a interação celular. Após pelo menos 30 minutos, pare a imagem e o fluxo e aperte a tubulação para permitir que ela seja desconectada do slide.Para determinar a taxa de transmigração das células através dos HUVECs estimulados, abra a imagem J e conte o número total de monócitos aderentes em cada campo para determinar a contagem de células por milímetro quadrado. Em seguida, conte o número de monócitos transmigrados que estão presentes no plano basal sob as células endoteliais, conforme identificado pela presença de uma zona de buraco negro ao redor do núcleo. Uma maneira simples de verificar o estado de ativação dos HUVECs após a estimulação é visualizar seu alongamento sob estresse inflamatório.A imagem confocal de lapso de tempo permite a visualização dos monócitos no plano apical onde seu fenótipo pode ser avaliado. As células migratórias submetidas à transmigração movem-se para a junção intercelular célula-celular antes que elas desapareçam do plano apical e reapareçam no plano basal. A quantitação do recrutamento de monócitos ao longo do tempo confirma que a adesão monócito é seguida pela transmigração.A taxa de transmigração do monócito positivo CD16 é baixa quando a célula endotelial é estimulada apenas com TNF alfa, mas aumenta quando as células endoteliais são estimuladas com fator de crescimento endotelial TNF e vascular ou VEGFA. A estimulação HUVEC com TNF alfa e TNF alfa mais VEGFA induz um aumento na adesão às células T, B e NK negativas cd14, em comparação com monócitos positivos CD14. Além disso, a estimulação huvec induz a transmigração apenas da população monócito, já que as células T, B e NK não transmigram sob as condições estimulatórias TNF alfa ou TNF alpha mais VEGFA.Para realizar um ótimo ensaio de recrutamento de monócitos, é importante que você planeje seu experimento com antecedência e faça-o no mesmo dia. E quando você purificar as células, certifique-se de que seu microscópio está a 37 graus para que você não transfira as células para uma temperatura diferente durante o experimento. Para aprender esse procedimento, todos os métodos como o perfil da expressão de citocina huvec e quimiocina, bem como estudos de quimiotaxis podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre o mecanismo molecular que sustenta a transmigração e a adesão da população específica de monócitos.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Humano In Vitro Supressão como ferramenta de triagem para o reconhecimento de um Estado precoce de desequilíbrio imunológico

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Imunologia e Infecção

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Isolamento de Células endoteliais da veia umbilical humana e sua utilização no estudo de transmigração de Neutrófilos sob condições de fluxo

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo de Co-infecção para Estudar<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 Interacções em monócitos humanos primários derivados de células imunes

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Um fluxo de Adesão Ensaio para o Estudo de Recrutamento de leucócitos para hepáticas humanas senoidais endotélio sob condições de estresse de cisalhamento

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Detecção de nanopartículas fluorescentes Interações com Primário imunitário subpopulações de células por citometria de fluxo

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Análise dos efeitos de células estromais no recrutamento de leucócitos de Fluxo

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro e In Vivo modelo para estudar a adesão bacteriana para o Vaso de parede em condições de escoamento

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

A Fluxo Simples Citometria método para medir glicose Captação e expressão de transportadores de glicose para monócitos subpopulações em sangue total

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Caracterização de derivados de monócitos células dendríticas humanas por imagem Citometria de Fluxo: Uma Comparação entre dois protocolos de isolamento de monócitos

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Análise de Microglia e Macropagos derivados de Monócitos do Sistema Nervoso Central por Citometria de Fluxo

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...