I dag vil vi demonstrere teknikken med transdermal måling af glomerulær filtrering eller tGFR i mus. Der er en række funktioner i denne metode, som jeg synes er værd at nævne. Først og fremmest, i øjeblikket tGFR er den mest præcise måde at vurdere nyrefunktion i mus.
For det andet, tGFR udføres i bevidst, frit bevægende mus, så det undgår komplikationer af anæstesi. For det tredje, når du har styr på teknikken, er det rimeligt at være i stand til at udføre 30 til 40 tGFR målinger på en enkelt dag. Endelig kan tGFR-målinger udføres gentagne gange i en in vitro-mus.
Det betyder, at vi kan udføre serielle målinger af nyrefunktion i akutte og kroniske sygdomsmiljøer. Den største fordel ved denne teknik er, at det giver forskerne mulighed for at måle glomerular filtreringshastighed eller GFR i bevidste, frit bevægende mus med høj præcision og følsomhed. En til to dage før tGFR måling, efter at have bekræftet en manglende reaktion på tå knivspids, placere en bedøvet mus i den udsatte position på en varmepude.
Brug en elektrisk barbermaskine, trim mod retningen af vækst for at fjerne det meste af pelsen fra den ene side af musens ryg fra toppen af bagbenene op til halsen og på tværs af ribbenene. Brug en vatpind til at anvende et tyndt lag af hårfjerning creme til den eksponerede hud mod vækstretningen for at sikre, at cremen påføres så tæt på huden som muligt og fjerne cremen efter et til tre minutter med rene vatpinde og varmt vand. På dagen for proceduren, trim en seks af tre centimeter klæbende plaster til størrelsen af GFR enheden, før skrælning bagsiden af plasteret og stikning enheden til den klæbende side af plasteret med lysdioder placeret umiddelbart over det klare vindue.
Sæt derefter et lille stykke af plasteret på batteriet. For at fastgøre skærmen, med bedøvet mus i udsat position, rense den forbarberedte hud med 70% ethanol og justere bredden af en ca 12 centimeter stykke tape ved at rive det på langs. Placer båndet under musen med to centimeter på den ene side af dyret folde over den ene kant af højre side af båndet for nem placering og fjernelse efter målingen.
Derefter skal du slutte batteriet til enheden, fjerne bagen fra batteriet og placere batteriet sikkert på enheden. Enheden er klar til brug, og dataindsamlingen begynder, når de blå LED'er begynder at blinke. Fjern bagsiden fra plasteret på enheden, og anvis enheden på den barberede hud, så vinduet, der udsætter LED'erne, er over ribbenene, der sikrer højre side af enheden med tape.
Det er vigtigt at sikre sikker fastgørelse af enheden uden at begrænse musens mobilitet eller lægge for meget pres på huden. Pak derefter forsigtigt venstre side af båndet rundt om musen og enheden. Lad enheden optage en konstant baggrundsaflæsning i tre minutter.
I mellemtiden opvarmes halen med en hovedpude, og der ilægges en insulinsprøjte med det passende eksperimentelle volumen FITC-sinistrin til injektionen afrundet til nærmeste 10 mikroliter. Administrere FITC-sinistrin intravenøst i en glat, men hurtig bolus. Det er vigtigt, at brugeren er fortrolig med IV injektioner, da det er nødvendigt at administrere FITC-sinistrin i en bolus snarere end over flere forsøg, som vil resultere i flere toppe i clearance kurven.
For at måle tGFR skal musen i sit eget bur med overvågning, indtil den er fuld recumbency, og fitc-sinistrinclearance registreres i 1,5 timer. I slutningen af måleperioden skal du placere musen på trådstativet oven på buret og lade musen gribe fat i metalstængerne, trække båndet ned under maven i en hurtig glat bevægelse. Fjern derefter tap fra enheden og plasteret fra huden og pas på, at batteriet ikke afbryder forbindelsen til enheden og returnerer musen til buret.
Hvis du vil evaluere dataene, skal du tage batteriet ud og bruge et USB-kabel til at slutte enheden til computeren. Åbn læsesoftwaren, og klik på Opret forbindelse, Læs, Omdøb og Gem. Luk derefter programmet og bearbejde og evaluere dataene i analysesoftwaren i henhold til producentens anvisninger.
Mens FITC-sinistrin hurtigt ryddes fra omløb i raske mus, denne clearance er dramatisk forsinket i mus med akut nyreskade. Hos mus med meget alvorlig akut nyreskade kan der være meget lidt eller ingen clearance af FITC-sinistrinfluorescens i hele den 90-minutters måleperiode, hvilket indikerer en fuldstændig fravær af glomerulær filtrering. Transdermal GFR-måling er minimalt invasiv og kan derfor bruges til at overvåge ændringer i nyrefunktionen hos de enkelte dyr over flere tidspunkter.
Faktisk i dette repræsentative eksperiment, sekventielle målinger viste ændringer i nyrefunktion på nul, en, to og fire dage efter iskæmi reperfusion skade. I denne mus kronisk nyresygdom model, den omvendte forholdet mellem FITC-sinistrin halveringstid til GFR kan være direkte korreleret med nedsat nyrefunktion observeret hos disse dyr. Faktisk korrelerer FITC-sinistrin halveringstid tæt med den semi-kvantitative histologiske vurdering af rørskade over hele spektret af GFR-målinger i skadesramte mus og hos mus med forskellige sværhedsgrader af iskæmi reperfusion skade-induceret akut nyreskade.
I modsætning hertil viser serumcreatinin og bloduranitrogen en positiv, men svagere korrelation med FITC-sinistrinclearance, der indikerer de transkutane GFR-målinger, giver et mere pålideligt mål for nyreskader end enten serumcreatinin eller urinstoffældning. Transdermal måling af GFR er et mere følsomt mål for nyrefunktion end traditionelle biomarkører såsom kreatinin og BUN. Dette giver en mere præcis vurdering af effekten af nye behandlinger for nyresygdom i præklinisk forskning.
De mest kritiske trin i denne metode er den korrekte fastgørelse af enheden til musens ryg og den vellykkede IV administration af FITC-sinistrin. Disse trin er afgørende for at opnå en nøjagtig vurdering af GFR hos mus.
