Vandaag zullen we de techniek van transdermale meting van glomerulaire filtratie of tGFR bij muizen demonstreren. Er zijn een aantal kenmerken van deze methode die ik denk dat het vermelden waard zijn. Allereerst is tGFR momenteel de meest nauwkeurige manier om de nierfunctie bij muizen te beoordelen.
Ten tweede wordt tGFR uitgevoerd in bewuste, vrij bewegende muizen, zodat het de complicaties van anesthesie vermijdt. Ten derde, als je eenmaal de techniek onder de knie hebt, is het redelijk om 30 tot 40 tGFR-metingen in één dag uit te kunnen voeren. Ten slotte kunnen tGFR-metingen herhaaldelijk worden uitgevoerd in een in vitro muizen.
Dit betekent dat we seriële metingen van de nierfunctie kunnen uitvoeren in acute en chronische ziekte-instellingen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het onderzoekers in staat stelt om de Glomerular Filtratie Rate of GFR te meten in bewuste, vrij bewegende muizen met hoge precisie en gevoeligheid. Een tot twee dagen voor de tGFR-meting, na bevestiging van een gebrek aan respons op teenknijpen, plaatst u een verdoofde muis in de gevoelige positie op een warmtekussen.
Met behulp van een elektrisch scheerapparaat, trim tegen de richting van de groei om het grootste deel van de vacht te verwijderen van de ene kant van de rug van de muis van de bovenkant van de achterpoten tot aan de nek en over de ribben. Gebruik een wattenstaafje om een dunne laag ontharingscrème aan te brengen op de blootgestelde huid tegen de groeirichting om ervoor te zorgen dat de crème zo dicht mogelijk bij de huid wordt aangebracht en verwijder de crème na één tot drie minuten met schone wattenstaafjes en warm water. Trim op de dag van de procedure een pleister van zes bij drie centimeter ter grootte van het GFR-apparaat voordat u de achterkant van de pleister afpelt en het apparaat aan de kleefzijde van de pleister plakt met de lichtgevende diodes die direct boven het heldere venster worden geplaatst.
Plak vervolgens een klein stukje van de pleister op de batterij. Om de monitor te bevestigen, met de verdoofde muis in de gevoelige positie, reinigt u de voorgeschoren huid met 70% ethanol en past u de breedte van een stuk tape van ongeveer 12 centimeter aan door deze in de lengte te scheuren. Plaats de tape onder de muis met twee centimeter aan de ene kant van het dier vouwen over een rand van de rechterkant van de tape voor eenvoudige plaatsing en verwijdering na de meting.
Sluit vervolgens de batterij aan op het apparaat, verwijder de achterkant van de batterij en plaats de batterij veilig op het apparaat. Het apparaat is klaar voor gebruik en de gegevensverwerving begint wanneer de blauwe LED's beginnen te knipperen. Verwijder de achterkant van de pleister op het apparaat en plaats het apparaat op de geschoren huid, zodat het venster dat de LED's blootstelt zich over de ribben bevindt die de rechterkant van het apparaat met tape beveiligen.
Het is belangrijk om een veilige bevestiging van het apparaat te garanderen zonder de mobiliteit van de muis te beperken of te veel druk op de huid te leggen. Wikkel vervolgens stevig de linkerkant van de tape rond de muis en het apparaat. Laat het apparaat gedurende drie minuten een stabiele achtergrondmeting opnemen.
Verwarm ondertussen de staart met een hoofdkussen en laad een insulinespuit met het juiste experimentele volume FITC-sinistrin voor de injectie afgerond op de dichtstbijzijnde 10 microliter. Beheer de FITC-sinistrine intraveneus in één gladde maar snelle bolus. Het is belangrijk dat de gebruiker comfortabel is met IV-injecties, omdat het noodzakelijk is om het FITC-sinistrin met succes in één bolus te beheren in plaats van meerdere pogingen die zullen resulteren in meerdere pieken in de klaringcurve.
Om de tGFR te meten, plaatst u de muis in zijn eigen kooi met controle tot volledige recumbency en laat u de FITC-sinistrin klaring gedurende 1,5 uur registreren. Plaats aan het einde van de meetperiode de muis op het draadrek bovenop de kooi en laat de muis de metalen staven grijpen, trek de tape in één snelle vloeiende beweging van onder de buik vandaan. Verwijder vervolgens tape van het apparaat en de pleister van de huid, waarbij ervoor wordt gezorgd dat de batterij niet loskoppelt van het apparaat en de muis terugbrengt naar zijn kooi.
Als u de gegevens wilt evalueren, moet u de batterij zorgvuldig loskoppelen en een USB-kabel gebruiken om het apparaat op de computer aan te sluiten. Open de leessoftware en klik op Verbinden, Lezen, Hernoemen en Opslaan. Sluit vervolgens het programma en verwerk en evalueer de gegevens in de analysesoftware volgens de instructies van de fabrikant.
Terwijl FITC-sinistrin snel uit de circulatie bij gezonde muizen wordt gehaald, wordt deze klaring dramatisch vertraagd bij muizen met acuut nierletsel. Bij muizen met zeer ernstig acuut nierletsel kan er zeer weinig of geen speling zijn van de FITC-sinistrine fluorescentie gedurende de gehele meetperiode van 90 minuten, wat wijst op een volledige afwezigheid van glomerulaire filtratie. Transdermale GFR-meting is minimaal invasief en kan daarom worden gebruikt om veranderingen in de nierfunctie bij individuele dieren over meerdere tijdstippen te monitoren.
Inderdaad in dit representatieve experiment, sequentiële metingen aangetoond veranderingen in de nierfunctie op nul, een, twee, en vier dagen na ischemie reperfusie letsel. In dit muisdiale nierziektemodel kan de omgekeerde relatie van het FITC-sinistrin halfleven met GFR direct worden gecorreleerd aan de verminderde nierfunctie die bij deze dieren wordt waargenomen. De halfwaardetijd van FITC-sinistrin correleert immers nauw met de semi-kwantitatieve histologische beoordeling van buisschade over het volledige scala van GFR-metingen bij niet-gewonde muizen en bij muizen met verschillende ernst van ischemiereperfusieletsel-geïnduceerde acute nierletsel.
Serum creatinine en bloedureumstikstof tonen daarentegen een positieve maar zwakkere correlatie met FITC-sinistrin-klaring, wat aangeeft dat de transcutane GFR-metingen een betrouwbaardere maatstaf zijn voor nierschade dan serumcreatinine of bloedureumstikstof. Transdermale meting van GFR is een gevoeligere maatstaf voor de nierfunctie dan traditionele biomarkers zoals creatinine en BUN. Dit biedt een nauwkeurigere beoordeling van de werkzaamheid van nieuwe therapieën voor nierziekten in preklinisch onderzoek.
De meest kritieke stappen in deze methode zijn de juiste bevestiging van het apparaat aan de rug van de muis en de succesvolle IV-toediening van FITC-sinistrin. Deze stappen zijn essentieel om een nauwkeurige beoordeling van GFR bij muizen te verkrijgen.
