Name: transdermal measurement of glomerular filtration rate in mice
Uploaded: 2018-10-21T15:00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transdermal Measurement of Glomerular Filtration Rate in Mice at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Vanderbilt Center for nyre sykdom (VCKD), og ble delvis finansiert av følgende tilskudd: DOD PR161028 og R01DK112688 (Mark de Caestecker)
Vi erkjenner støtte til LS, PM og BW av MRC, EPSRC og BBSRC-finansierte UK regenerativ medisin plattform "Sikkerhet og effekt, fokus på Imaging teknologi Hub" (MR/K026739/1).

Alle dyreforsøk ble utført i henhold til lokale retningslinjer i Storbritannia og USA. Eksperimenter utført ved Universitetet i Liverpool ble utført under en lisensen gitt under UK dyr (vitenskapelig prosedyrer) Act 1986 og ble godkjent av etikk Universitetet i Liverpool. Alle dyr eksperimenter utført ved Vanderbilt University Medical Center ble godkjent av Vanderbilt institusjonelle Animal Care og bruk komiteen.
1. klargjør FITC-sinistrin
<ol><li>Forberede 40 mg/mL FITC-sinistrin i fosfat bufret saltvann (PBS). Merk: Dele kan lagres på 20 ° C i flere måneder med ingen merkbar nedgang i kvalitet; men flere fryse-Tin-sykluser bør unngås. FITC-sinistrin er følsomt for lys - holde røret beskyttet mot lyset.</li>
	<li>Beregne volumet av FITC-sinistrin kreves for hver musen:<ol>
<li>Veie hver musen på hver dag til målingen.</li>
		<li>Den anbefalte dosen er 0,15 mg FITC-sinistrin per gram kroppsvekt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. musen forberedelse
<ol><li>Forbered separat burene for mus mens gjennomgår GFR målinger. Gi absorberende papirhåndklær og noen pelleter av mat.</li>
</ol>3. fjerne hår fra musa (1-2 dager før GFR måling)
<ol><li>Bedøve musen med 3% isoflurane, og når musen er i hvilemodus, opprettholde anestesi med 1,5-2% isoflurane, avhengig puste av musen. Plass musen utsatt på en heten pute.</li>
	<li>Bruk en elektrisk barbermaskin, går mot retning av fur, til å fjerne det meste av fur fra den ene musen er tilbake. Barbere fra toppen av bakbena opp til halsen, og over ribbeina.</li>
	<li>Påfør et tynt lag av hårfjerning krem barberte området med en bomullspinne (figur 1A). Flytte bomullspinne mot retning av fur slik at kremen brukes så nær huden som mulig.</li>
	<li>Fjern kremen etter 1-3 min spylt av med bomull vattpinner og varmt vann. Ikke Utfør måling hvis huden vises veldig rødt og irritert etter mål, og ikke gjenta hårfjerning innen 72 timer å unngå å skade huden.</li>
</ol>4. forberede Transdermal GFR skjermen
<ol><li>Bruk en av de to størrelsene av oppdateringene som er tilgjengelige. Først er 2,5 x 3 cm2 i størrelse og kan brukes for målinger i mus direkte. Andre oppdateringer er 6 x 3 cm2 i størrelse og er ment å brukes i rotter eller større dyrene men kan kuttes til en mindre størrelse for bruk i mus.</li>
	<li>Skrell støtte av en side av oppdateringen og stikke GFR enheten på den selvklebende siden, posisjonering lysdioder akkurat over vinduet klart.</li>
	<li>Kutt overflødig selvklebende oppdateringen passer til størrelsen på batteriet og stikke en side av oppdateringen til batteriet.</li>
</ol>5. Koble Transdermal GFR skjermen
<ol><li>Anaesthetize musen med isoflurane som beskrevet i trinn 3.1 og Plasser musen utsatt på en heten pute. Bedøve mus bare for plassering av transdermal GFR skjermen og injeksjon av FITC-sinistrin; Tillat for å gjenopprette bedøvelsen for måling av FITC forfall.</li>
	<li>Rengjør pre barbert huden med 70% etanol. Plasser ca 12 cm hypoallergeniske silke tape under musen (figur 1B; bredde på tapen skal reduseres til 1,5 til 2 cm slik at det ikke er for bred for musen).</li>
	<li>Plasser båndet slik at bare ca 2 cm er musen er høyre, og resten er på venstre. Brett over en av kantene på høyre side av bånd for enkel plassering og flytting etter måling. Venstre-høyre instruksjoner for fremgangsmåten 5.3 og 5.6 er enheten plassering på høyre side av dyret og kan byttes for enheten plassering på venstre side av dyret hvis nødvendig.</li>
	<li>Koble batteriet til enheten, fjerner støtte fra batteriet og sikkert plasser den på toppen av enheten. Enheten er klar til bruk og datainnsamling starter når blå lys utslipp diodene (LED) begynner å blinke.</li>
	<li>Fjern støtte fra enheten og plasser på barbert huden. Posisjon enheten slik at vinduet utsette lysdioder er over ribbeina-har ikke det for nær i ryggraden eller lemmer (figur 1 c).</li>
	<li>Sikre enheten med det hvite båndet. Sikre retten første (figur 1 d), bryte det tett rundt kanten av enheten, og deretter pakke til venstre rundt musen og enheten (figur 1E). Ideelt sett venstre side av båndet dekker bare enheten, og høyre side slutter under musen er magen.</li>
	<li>Fest båndet ved å trykke seg sammen med omkretsen av musen er kroppen. Båndet må festes godt, men ikke stramt. Hvis det er for løs og enheten vil flytte rundt for mye og forårsake bevegelse gjenstander. Men bør det ikke være så tett at det begrenser pusting eller bevegelse eller legger for mye press på huden.</li>
	<li>La enheten urørt i 3 minutter før FITC-sinistrin injeksjon å tillate jevn bakgrunn lesing tas. I denne tiden, varm halen med heten pute eller hanske fylt med varmt vann å forberede hale blodåre injeksjon (Hvis denne ruten).</li>
</ol>6. FITC-sinistrin injeksjon
<ol><li>Klargjør en insulinsprøyte med den beregnede mengden av FITC-sinistrin kreves for injeksjon (dette kan bli avrundet til nærmeste 10 μL).</li>
	<li>Administrere FITC-sinistrin ved halen vene eller retro-orbital innsetting. FITC-sinistrin skal administreres i en glatt men rask bolus for å unngå flere topper på klaring kurven. Det er bedre å administrere bare en delvis dose enn å få flere forsøk på å administrere FITC-sinistrin.</li>
</ol>7. måle GFR
<ol><li>Plass musen i et bur på egen hånd til å gjenopprette isoflurane bedøvelsen og for varigheten av tidsperioden.</li>
	<li>Observere musen i buret for 1,5 t og deretter fjerne enheten. Fjerne enheten fra bevisst musen er rask, effektiv og generelt godt tolerert av musen, men nye brukere kanskje foretrekker å anaesthetize musen for dette trinnet.<ol>
<li>Som en alternativ anaesthetize musen med isoflurane.</li>
		<li>Som det andre alternativet, Plasser musen på wire rack på buret, slik at musen å forstå metallstenger mens enheten er fjernet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trekk av hvite gips tape fra under magen i en rask, jevn bevegelse, og fjerne enheten og svart gips fra huden. Pass på at batteriet ikke kobler fra enheten ennå.</li>
	<li>Tilbake musen til buret sitt hjem.</li>
</ol>8. lesing og evaluere Data
<ol><li>Nøye koble batteriet fra enheten</li>
	<li>Koble enheten til USB-kabelen og koble kabelen til datamaskinen</li>
	<li>Åpne programvaren (Sensor_ctrl_app.exe)</li>
	<li>I rekkefølge, klikk på "connect", "lese" og "nytt navn", og "lagre", Lukk programmet</li>
	<li>Behandle og evaluere data i analyseprogramvare som beskrevet i de respektive håndboken</li>
</ol>

<ol>
	<li>Schreiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+measurement+of+renal+function+in+conscious+mice.">Transcutaneous measurement of renal function in conscious mice.</a> American Journal of Physiology - Renal Physiology. 303 (5), F783-F788 (2012).</li><li>Friedemann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+kinetic+model+for+the+transcutaneous+measurement+of+glomerular+filtration+rate+in+experimental+animals.">Improved kinetic model for the transcutaneous measurement of glomerular filtration rate in experimental animals.</a> Kidney International. 90 (6), 1377-1385 (2016).</li><li>Schock-Kusch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+transcutaneous+measurement+of+renal+function+in+various+strains+of+conscious+mice.">Reliability of transcutaneous measurement of renal function in various strains of conscious mice.</a> PLoS One. 8 (8), e71519 (2013).</li><li>Schock-Kusch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+assessment+of+renal+function+in+conscious+rats+with+a+device+for+measuring+FITC-sinistrin+disappearance+curves.">Transcutaneous assessment of renal function in conscious rats with a device for measuring FITC-sinistrin disappearance curves.</a> Kidney International. 79 (11), 1254-1258 (2011).</li><li>Herrera P&#233;rez, Z., Weinfurter, S., Gretz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+Assessment+of+Renal+Function+in+Conscious+Rodents.">Transcutaneous Assessment of Renal Function in Conscious Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), 53767 (2016).</li><li>Cowley, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+glomerular+filtration+rate+reduction+determined+in+conscious+Dahl+salt-sensitive+hypertensive+rats.">Progression of glomerular filtration rate reduction determined in conscious Dahl salt-sensitive hypertensive rats.</a> Hypertension. 62 (1), 85-90 (2013).</li><li>Scarfe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measures+of+kidney+function+by+minimally+invasive+techniques+correlate+with+histological+glomerular+damage+in+SCID+mice+with+adriamycin-induced+nephropathy.">Measures of kidney function by minimally invasive techniques correlate with histological glomerular damage in SCID mice with adriamycin-induced nephropathy.</a> Scientific Reports. 5, 13601 (2015).</li><li>Lazzeri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocycle-related+tubular+cell+hypertrophy+and+progenitor+proliferation+recover+renal+function+after+acute+kidney+injury.">Endocycle-related tubular cell hypertrophy and progenitor proliferation recover renal function after acute kidney injury.</a> Nature Communications. 9 (1), 1344 (2018).</li><li>Street, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+adenosine+1a+receptor+signaling+on+GFR+early+after+the+induction+of+sepsis.">The role of adenosine 1a receptor signaling on GFR early after the induction of sepsis.</a> American Journal of Physiology - Renal Physiology. 314 (5), F788-F797 (2018).</li><li>Skrypnyk, N. I., Harris, R. C., de Caestecker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemia-reperfusion+model+of+acute+kidney+injury+and+post+injury+fibrosis+in+mice.">Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post injury fibrosis in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxemic+acute+renal+failure+is+attenuated+in+caspase-1-deficient+mice.">Endotoxemic acute renal failure is attenuated in caspase-1-deficient mice.</a> American Journal of Physiology - Renal Physiology. 288 (5), F997-F1004 (2005).</li><li>Eisner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+contribution+of+tubular+secretion+to+creatinine+clearance+in+mice.">Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice.</a> Kidney International. 77 (6), 519-526 (2010).</li><li>Bankir, L., Yang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+urea+and+glucose+handling+by+the+kidney,+and+the+urine+concentrating+mechanism.">New insights into urea and glucose handling by the kidney, and the urine concentrating mechanism.</a> Kidney International. 81 (12), 1179-1198 (2012).</li><li>Qi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+determination+of+glomerular+filtration+rate+in+conscious+mice+using+FITC-inulin+clearance.">Serial determination of glomerular filtration rate in conscious mice using FITC-inulin clearance.</a> American Journal of Physiology - Renal Physiology. 286 (3), F590-F596 (2004).</li><li>Peters, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinetic+basis+of+glomerular+filtration+rate+measurement+and+new+concepts+of+indexation+to+body+size.">The kinetic basis of glomerular filtration rate measurement and new concepts of indexation to body size.</a> European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 31 (1), 137-149 (2004).</li><li>Chapman, M. E., Hu, L., Plato, C. F., Kohan, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioimpedance+spectroscopy+for+the+estimation+of+body+fluid+volumes+in+mice.">Bioimpedance spectroscopy for the estimation of body fluid volumes in mice.</a> American Journal of Physiology - Renal Physiology. 299 (1), F280-F283 (2010).</li></ol>

D S-K, JF og YS er ansatte på MediBeacon GmbH produsent og distributør av transdermal GFR skjermen. D S-K og JF er oppfinnere på patenter og patentsøknader på presentert teknologien.

Dette manuskriptet og på trening videoen gir praktiske retningslinjer for bruk av transdermal GFR skjermer i mus. De viktigste trinnene i prosedyren er riktig feste enheten på dyrets tilbake, og sikkert innpakning målebåndet rundt magen. Den beste posisjonen er litt venstre eller høyre på midtlinjen, over brystkasse. Oppdateringen og enheten må være godt festet til huden, men de bør ikke være så stramt at de begrenser pust, bevegelse, eller påvirke huden blodsirkulasjonen under enheten, da dette vil føre til feil/unøyaktige målinger. I tillegg siden overvåking oppstår i bevisst mus etter at de har gjenvunnet fra anestesi, korrekt plassering av enheten fra kroppen med lavest forstyrrelser fra bevegelse resultater i transdermal målinger med liten bevegelse gjenstander. Derfor er det viktig at enheten ikke er plassert for nært til øvre lemmer slik at mus kan flytte skuldrene fritt.
Det er viktig å epilere meg musene én til to dager før GFR måling, som Versace påvirker måling av FITC-sinistrin fortolling, med innledende data indikerer at hårfjerning umiddelbart før måling av transdermal GFR øker den tilsynelatende halveringstiden av FITC-sinistrin. Mekanismen for dette er ukjent. Derfor, for å få pålitelige målinger over flere tidspunkt og mellom eksperimenter, er det tilrådelig å epilere meg musene på forhånd, slik at huden til å gjenopprette fra denne prosessen før du fortsetter med GFR målinger. Hårfjerning krem bør ikke brukes til det samme området av huden innen 72 timer av et tidligere program, å unngå kjemisk skade huden. I mange tilfeller pels ettervekst tar flere dager eller opptil en uke, og så re-søknad av hårfjerning krem innen 72 timer kan lett unngås.
Fordi opp til 50% av serum creatinine skilles ut av rørformede delen i mus13, og fordi det er økt reabsorpsjon av urea fra nyre tubuli når mus er dehydrert14, serum creatinine og BUN er dårlig markører på nyre funksjon. Men på grunn av deres bekvemmelighet fortsatt disse analyser brukes som viktigste mål på nyre funksjon i preklinisk studier av AKI og Parallelt i mus. Men i samsvar med store bidrag av rørformede sekresjon til creatinine utskillelse i mus med normal eller nær normal nyrefunksjonen13, serum creatinine viste liten sammenheng med FITC-sinistrin klaring på høy klareringsrate (lav FITC-sinistrin half-life), som indikerer at creatinine er en ufølsom mål nyrefunksjonen i mus med mild nyre skader. I kontrast, mens BUN samsvarer med FITC-sinistrin klarering i mus med mild nedsatt nyrefunksjon, er det dårlig sammenheng mellom BUN og FITC-sinistrin klarering i mus med mer alvorlige nyre skader (høy FITC-sinistrin half-life). Dette skyldes trolig virkningene av urea reabsorpsjon tilknyttet dehydrering i syke dyr med alvorlig nyre skader.
En stor fordel av transdermal GFR måling, sammenlignet med alle andre bolus klarering eller konstant tilførsel teknikker for GFR måling, er at den ikke krever nøye timet blod og urin samlinger. Dette kan være spesielt utfordrende i mus som har lav total blod volum og urin produksjon sammenlignet med rotter. Videre må mus håndteres for vedlegg av enhet og injeksjon, men ikke for flere venipunctures, som kreves for klassisk bolus klaring eksperimenter15. Videre varigheten av anestesi er kort, og som sådan er det mulig å utføre gjentatte målinger i individuelle mus over tid. Frekvensen som målinger kan utføres primært avhengig helsetilstanden til mus, forskeren evner for intravenøs injeksjoner og institusjonelle batterier på gjentatte anestesi økter. I sunn, uskadet mus, kan transdermal GFR målinger utføres daglig, med minimal eller ingen negative effekter på musen. Imidlertid skadet mus lider av AKI eller Parallelt er usannsynlig å tåle gjentatt anestesi økter som sunn musene, og dermed frekvensen av målinger skal reduseres.
Hovedbegrensningen transdermal GFR måling, sammenlignet med bolus klaring metoder å måle GFR i mus er at utskillelsen kinetics måles bare endringer i relativ fluorescens intensitet over tid, og ikke absolutt tracer konsentrasjoner. Derfor er det bare mulig å måle hastigheten konstant of enkelt eksponentiell nedbrytning av utskillelsen kinetic, som er et nært anslag over GFR normalisert ekstracellulære volum16. For å uttrykke GFR i mL/min, har det ekstracellulære volumet av dyret fastsettes ved hjelp av en konverteringsfaktor som ble etablert i tidligere studier som samtidig målinger av plasma konsentrasjoner av FITC-sinistrin ble utført1. Men denne konverteringsfaktor kan ikke riktig anslo ekstracellulære flytende volumer like bra i alle mus, siden væske volum kan påvirkes av en rekke utenforliggende faktorer inkludert alder, kjønn, hydration status (som påvirkes av kirurgiske intervensjoner samt nyre skader), og17. Men i motsetning til bolus dosering metode for å vurdere GFR i mus er transkutan GFR måling underlagt mindre operatøravhengig variasjon som den ikke påvirkes av dosering feil eller feil i timingen av blod.
En annen begrensning transkutan GFR måleverdien teknikken er at planlagte signal Skift kan oppstå i løpet av målingen på grunn av bleking hud fluorophores og anestesi kreves for enhet vedlegg og tracer injeksjon. Denne begrensningen ble behandlet av Friedemann og kolleger ved å implementere en korreksjon algoritmen3. Gjennomføringen av denne algoritmen førte til en forbedring i presisjon av transdermal teknikken sammenlignes med konstant tilførsel teknikk GFR vurdering.
Et vanlig spørsmål er om pigmentering i annen mus stammer påvirker transdermal FITC-sinistrin klarering. Pigmentering reduserer FITC-sinistrin signal intensiteten siden mørke pigmenter absorberer blå magnetisering og grønne utslipp signaler fra FITC-sinistrin målinger. Men frekvensen utskillelse av FITC-sinistrin er uavhengig av totalt signalet intensitet. Videre mens målt signalet er lavere, er bakgrunn signalet også lavere pigmentert mus. Bakgrunn signalet er en blanding av autofluorescence av hud fluorophores og refleksjon av eksitasjon lyset, har vi funnet at bakgrunnen til maksimalt signalet er sammenlignbare, eller enda bedre, i pigmentert dyr. I tillegg bevegelse gjenstander, som er forårsaket av eksponering av omkringliggende huden å reflektert lys, reduseres i pigmentert mus siden det reflekterte lyset er også absorbert av pigmentert hud.
Avslutningsvis lar teknikken vi har presentert nøyaktig måling av GFR i bevisst, fritt flytte mus for alle hudtyper. Teknikken er uavhengig av blodprøve, kan det brukes flere ganger på samme dyret for langsgående observasjoner i Parallelt modeller, samt for måling av raske endringer i GFR som oppstår etter induksjon av AKI.

Bruk av transkutan GFR skjermer i mus ble først rapportert av Schreiber og kolleger i 2012 og ble validert ved å sammenligne GFR målinger Hentet ved hjelp av denne teknikken, med resultatene oppnås ved direkte måling av FITC-sinistrin bolus klaring fra seriell blodprøver1. Hittil har det vært 35 fagfellevurderte publikasjoner som transkutan GFR skjermer har blitt brukt i rotter og mus (en liste over artikler og konferansen Sammendrag hvor prekliniske GFR skjermen ble brukt kan finnes på den MediBeacon nettstedet2). Transdermal GFR mål i rotter og mus har blitt beskrevet i en rekke publikasjoner1,3,4,5, og en video tutorial som viser bruken rotter har vært publisert6. Imidlertid presenterer måling i mus flere tekniske utfordringer. Her gir vi den første detaljert praktisk guiden til bruk av transdermal GFR skjermer i mus.
Det finnes en rekke grunner Hvorfor etterforskere begynner å favorisere bruk av transdermal GFR skjermer å vurdere nyrefunksjonen på gnager modeller. Transdermal måling av FITC-sinistrin klaring har vist seg å gi et mer følsomme og nøyaktige mål nyrefunksjonen sammenlignet med tradisjonelle parameterne for nyre funksjon som serum creatinine og blod urea nitrogen (BUN)7, 8. Ved å implementere en forbedret evaluering algoritme, vist Friedemann og kolleger at systemet når presisjon sammenlignes med gull standard, konstant tilførsel teknikken for GFR måling3. Nyere studier har også vist at sekvensiell analyse bruker transkutan GFR skjermer kan brukes til å studere tidlig endringer i nyre-funksjon i tillegg til funksjonelle utvinning etter induksjon av akutt nyre skader (AKI) uten å forstyrre dyr blod volum eller hemodynamics, blod siden analysen ikke krever sammenhengende prøvetaking9,10. Muligheten til å måle GFR med høy presisjon og følsomhet flere ganger i samme dyr gjør denne teknikken attraktive for en rekke forskjellige forskningsdisipliner. Transdermal GFR skjermer har blitt brukt av legemiddelindustrien for å vurdere toksisitet av romanen forbindelser og universiteter for grunnleggende og translasjonsforskning forskning.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Transdermal GFR monitor (comes with 1 device, 2 batteries and 1 charger)</td>
			<td>MediBeacon GmbH</td>
			<td>TDM-MH001</td>
			<td>Reading software: MPD Lab; Analysis software: MPD Studio</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional Batteries</td>
			<td>MediBeacon GmBH</td>
			<td>PWR-BT0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attachment patches</td>
			<td>MediBeacon GmbH</td>
			<td>small: PTC-SM001; large: PTC-LG001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-sinistrin</td>
			<td>MediBeacon GmbH</td>
			<td>FTC-FS001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoallergenic silk tape</td>
			<td>e.g. Durapore (1538-2), or Kendall (7138C), or Leukosilk (01032-00)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaesthesia chamber, isoflurane, oxygen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat pad</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric shaver</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory (hair removal) cream</td>
			<td>e.g. Veet or Nair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton buds</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scales</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol wipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transdermal measurement of glomerular filtration rate in mice

Transdermal er glomerular filtrering rate (GFR) en etablert teknikk som brukes til å vurdere nyrefunksjonen i musen og rotte modeller av akutt nyre skader og kronisk nyresykdom. Målesystemet består av en miniatyriserte fluorescens detektor som er direkte knyttet til huden på baksiden av bevisst, fritt bevegelige dyr, og måler utskillelse kinetics av de ytre GFR tracer, fluorescein-isothiocyanate (FITC) konjugert sinistrin (en inulin analog). Dette systemet har blitt beskrevet i detalj i rotter. Men på grunn av deres mindre størrelse presenterer måling av transkutan GFR i mus flere tekniske utfordringer. I dette papiret gir vi derfor den første detaljert praktisk guiden til bruk av transdermal GFR skjermer i mus basert på de kombinert erfaringen med tre forskjellige etterforskere som har vært utført denne analysen i mus over flere år.

I denne delen presenterer vi representant resultatene av bruk av transdermal GFR skjermen. Transdermal skjermen har vært brukt i en rekke musen stammer og modeller av AKI og Parallelt2.
Figur 2 viser representant FITC-sinistrin klaring kurver i mannlige BALB/c mus før og etter iskemi reperfusion skader (IRI) med samtidig kontralateral nephrectomy. FITC-sinistrin er raskt fjernet fra sirkulasjonen i sunne mus (figur 2A), men klaring forsinkes dramatisk i mus med AKI (figur 2B, C). I mus med svært alvorlig AKI, kan det ikke være noen endring i FITC-sinistrin fluorescens i løpet av 90-minutters måleperioden, angir et fullstendig fravær av glomerular filtrering (figur 2C).
Transdermal GFR er minimal invasiv og kan brukes til å overvåke endringer i nyrefunksjon i samme mus over flere tidspunkt. Figur 3 viser endringer i GFR bestemmes av sekvensiell transdermal FITC-sinistrin klaring målinger ved baseline og 1, 2 og 4 dager etter inducing IRI (unilateral iskemi med samtidige kontralateral nephrectomy). Dataene inneholder FITC-sinistrin klaring half-life (figur 3A) og GFR (figur 3B) beregnet fra den målte FITC-sinistrin klaring half-life, som beskrevet av Schreiber et al1.
I Figur 4, ble kronisk nyresykdom (Parallelt) indusert i mannlige BALB/c mus ved å utføre langvarig ensidige IRI etterfulgt av forsinket kontralateral nephrectomy, som beskrevet11. GFR ble vurdert av transdermal FITC-sinistrin klaring på dag 26 etter første IRI. Økningen i FITC-sinistrin halveringstid (figur 4A), og derfor nedgangen i GFR (figur 4B) angir svekket nyre funksjon i disse musene. Disse dataene viser at transkutan GFR måling kan brukes til å måle endringer i nyre-funksjon i mus med Parallelt.
Figur 5A viser at FITC-sinistrin halveringstid samsvarer nært med semi kvantitative histologiske vurdering av rørformede skader over hele utvalg av GFR målene i uskadet mus og mus med ulike alvorlighetsgrader IRI forårsaket Aki. Derimot serum creatinine og blod urea nitrogen (BUN) viste en positiv men svakere korrelasjon med FITC-sinistrin klaring (figur 5B, C), som indikerer at transkutan GFR målinger gir et mer pålitelig mål på nyre skade (rørformet skade score) følgende IRI forårsaket AKI enn enten serum creatinine eller BUN.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58520/58520fig1.jpg"> Figur 1: feste transdermal GFR skjermen. Fotografier av hårfjerning (A), plassering av båndet under musen (B), plasseringen av enheten på musen er huden (C), og sikre enheten ved innpakning målebåndet rundt musen og enheten (D-E) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58520/58520fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58520/58520fig2.jpg"> Figur 2: eksempel FITC-sinistrin klaring kurver i mannlige BALB/c mus før og etter iskemi reperfusion skader (IRI) med samtidig kontralateral nephrectomy. Klaring kurver på grunnlinjen (A) og én dag etter IRI kirurgi (B) i samme musen, indikerer svekket nyre funksjon i denne musen. (C) klaring kurve fra en mer alvorlig skadet mus dagen etter IRI kirurgi. Det var ingen klarering av FITC-sinistrin i løpet av måleperioden, indikerer nyresvikt. Svart datapunkter representerer rådata, blå linjene representerer den 3-rom passformen og grønne linjene representerer 95% konfidensintervall. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58520/58520fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58520/58520fig3.jpg"> Figur 3: mannlige BALB/c mus, alderen 8-10 ukens gjennomgikk ensidige iskemi med samtidige kontralateral nephrectomy (n = 5). GFR ble vurdert ved baseline og dager 1, 2 og 4 etter operasjonen, og sammenlignet med humbug-opererte kontroll mus (n = 5). FITC-sinistrin halveringstid i (A) ble brukt sammen med kroppsvekten av mus, beregne GFR med (B). Datapunkt representerer enkelte dyr, og feilfelt representerer betyr og standardfeil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58520/58520fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58520/58520fig4.jpg"> Figur 4: mannlige BALB/c mus alderen 8-10 ukens gjennomgikk ensidige iskemi med forsinket kontralateral nephrectomy på dag 8 (n = 5). GFR ble vurdert av på dag 26 og var i forhold til alder-matchet sunn kontroll mus (n = 5). FITC-sinistrin halveringstid i (A) ble brukt sammen med kroppsvekten av mus, beregne GFR med (B). Datapunkt representerer enkelte dyr, og feilfelt representerer middelverdi og standardavvik. Rørformede skade ble scoret 0-50 basert på graden av nekrose og kastet dannelsen av en blendet observatør (forskeren) på periodiske acid-Schiff-farget nyre deler. Denne metoden ble Wang og kolleger12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58520/58520fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58520/58520fig5.jpg"> Figur 5: korrelasjon av tre mål nyreskader funksjon (histologiske evaluering av rørformede skade (n = 39), serum creatinine (n = 30) og blod urea nitrogen (BUN) (n = 30)) med FITC-sinistrin klaring (half-life). Mannlige BALB/c mus gjennomgikk varierende perioder for ensidig nyre pedicle klemskruen (25 – 45 min) eller humbug kirurgi, med samtidige kontralateral nephrectomy å indusere forskjellige alvorlighetsgraden av AKI, og nyre Funksjonsparametere og histopatologi ble vurdert på dag 4 etter IRI. Rørformede skade score viste en sterk positiv sammenheng med FITC-sinistrin klaring (A; R2 = 0,88), mens serum creatinine (B), og BUN (C) begge viste positiv men svakere korrelasjon med FITC-sinistrin klaring (R2 = 0.64 og 0.52, henholdsvis). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58520/58520fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Transdermal Measurement of Glomerular Filtration Rate in Mice at JoVE.com

Transdermal Measurement of Glomerular Filtration Rate in Mice

Transdermal måling av Glomerular filtrering i mus

Her beskriver vi en protokoll for å måle glomerular filtrering rate (GFR) i bevisst, fritt flytte mus med en transdermal GFR skjerm.

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of ...

I dag vil vi demonstrere teknikken for transdermal måling av glomerulær filtrering eller tGFR hos mus. Det finnes en rekke funksjoner i denne metoden som jeg tror er verdt å nevne. Først av alt, for tiden tGFR er den mest nøyaktige måten å vurdere nyrefunksjon hos mus.For det andre utføres tGFR i bevisste, fritt bevegelige mus, slik at det unngår komplikasjoner av anestesi. For det tredje, når du har mestret teknikken, det er rimelig å kunne utføre 30 til 40 tGFR målinger på en enkelt dag. Til slutt kan tGFR-målinger utføres gjentatte ganger i en in vitro-mus.Hva dette betyr er at vi kan utføre seriemålinger av nyrefunksjon i akutte og kroniske sykdomsinnstillinger. Den største fordelen med denne teknikken er at den gjør det mulig for forskere å måle Glomerular Filtration Rate eller GFR i bevisste, fritt bevegelige mus med høy presisjon og følsomhet. En til to dager før tGFR-målingen, etter å ha bekreftet mangel på respons på tåklemme, plasser en bedøvet mus i utsatt posisjon på en varmepute.Bruk en elektrisk barbermaskin, trim mot vekstretningen for å fjerne det meste av pelsen fra den ene siden av musens rygg fra toppen av bakbenene opp til nakken og over ribbeina. Bruk en bomullspinne til å påføre et tynt lag med hårfjerningskrem på den eksponerte huden mot vekstretningen for å sikre at kremen påføres så nær huden som mulig og fjerne kremen etter ett til tre minutter med rene bomullspinner og varmt vann. På dagen for prosedyren, trim en seks og tre centimeter lim patch til størrelsen på GFR enheten før peeling av baksiden av og stikker enheten til den selvklebende siden av med lysdioder plassert rett over det klare vinduet.Fest deretter en liten del av til batteriet. For å feste skjermen, med den bedøvede musen i utsatt stilling, rengjør den forsedlede huden med 70% etanol og juster bredden på et ca. 12 centimeter stykke tape ved å rive den på langs. Plasser båndet under musen med to centimeter på den ene siden av dyret som bretter over den ene kanten av høyre side av båndet for enkel plassering og fjerning etter målingen.Deretter kobler du batteriet til enheten, fjerner baksiden fra batteriet og plasserer batteriet på enheten på en sikker måte. Enheten er klar til bruk og datainnhentingen begynner når de blå lysdiodene begynner å blinke. Fjern baksiden fra plasteret på enheten og plasser enheten på den barberte huden slik at vinduet som eksponerer lysdiodene er over ribbeina som fester høyre side av enheten med tape.Det er viktig å sikre sikker feste av enheten uten å begrense musens mobilitet eller legge for mye press på huden. Deretter vikler du fast venstre side av båndet rundt musen og enheten. La enheten ta opp en jevn bakgrunnslesing i tre minutter.I mellomtiden varmer halen med en hodepute og legger en insulinsprøyte med riktig eksperimentelt volum av FITC-sinistrin for injeksjonen avrundet til de nærmeste 10 mikroliter. Administrer FITC-sinistrin intravenøst i en jevn, men rask bolus. Det er viktig at brukeren er komfortabel med IV injeksjoner som det er nødvendig å administrere FITC-sinistrin i en bolus i stedet for over flere forsøk som vil resultere i flere topper i klaring kurven.For å måle tGFR, plasser musen i sitt eget bur med overvåking til full recumbency og la FITC-sinistrin klaring registreres i 1,5 timer. På slutten av måleperioden plasserer du musen på trådstativet på toppen av buret og lar musen gripe metallstenger, trekk båndet fra under magen i en rask jevn bevegelse. Fjern deretter et tape fra enheten og plasteret fra huden, og ta vare på at batteriet ikke kobler fra enheten og returnerer musen til buret.Hvis du vil evaluere dataene, kobler du forsiktig fra batteriet og bruker en USB-kabel til å koble enheten til datamaskinen. Åpne leseprogramvaren, og klikk Koble til, les, Gi nytt navn til og Lagre. Lukk deretter programmet og behandle og evaluere dataene i analyseprogramvaren i henhold til produsentens instruksjoner.Mens FITC-sinistrin raskt blir fjernet fra sirkulasjonen hos friske mus, er denne clearance dramatisk forsinket hos mus med akutt nyreskade. Hos mus med svært alvorlig akutt nyreskade kan det være svært liten eller ingen clearance av FITC-sinistrinfluorescensen i hele 90-minutters måleperioden som indikerer fullstendig fravær av glomerulær filtrering. Transdermal GFR måling er minimalt invasiv og kan derfor brukes til å overvåke endringer i nyrefunksjon hos individuelle dyr over flere tidspunkter.Faktisk i dette representative eksperimentet viste sekvensielle målinger endringer i nyrefunksjonen på null, en, to og fire dager etter iskemireperfusjonsskade. I denne mus kronisk nyresykdom modell, det inverse forholdet mellom FITC-sinistrin halveringstid til GFR kan direkte korrelert til nedsatt nyrefunksjon observert hos disse dyrene. Faktisk korrelerer FITC-sinistrin halveringstiden tett med den semi-kvantitative histologiske vurderingen av rørformet skade over hele spekteret av GFR-målinger hos uskadede mus og hos mus med ulike alvorlighetsgrader av iskemireperfusjonsskadeindusert akutt nyreskade.I motsetning viser serumkreatinin og blod urea nitrogen en positiv, men svakere korrelasjon med FITC-sinistrin clearance indikerer transkutan GFR målinger gir et mer pålitelig mål på nyreskade enn enten serumkreatinin eller blod urea nitrogen. Transdermal måling av GFR er et mer følsomt mål på nyrefunksjon enn tradisjonelle biomarkører som kreatinin og BUN. Dette gir en mer nøyaktig vurdering av effekten av nye terapier for nyresykdom i preklinisk forskning.De mest kritiske trinnene i denne metoden er riktig vedlegg av enheten til musens rygg og vellykket IV-administrasjon av FITC-sinistrin. Disse trinnene er avgjørende for å oppnå en nøyaktig vurdering av GFR hos mus.

Research

JoVE Journal

Medicine

Implantation of Radiotelemetry Transmitters Yielding Data on ECG, Heart Rate, Core Body Temperature and Activity in Free-moving Laboratory Mice

Implantasjon av Radiotelemetry Transmitters gir data på EKG, puls, Core kroppstemperatur og aktivitet i fritt bevegelige Laboratory Mus

The laboratory mouse is the animal species of choice for most biomedical research, in both the academic sphere and the pharmaceutical industry. Mice are a ...

The Measurement and Treatment of Suppression in Amblyopia

Den Måling og behandling av undertrykkelse i Amblyopi

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current ...

Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Kvantifisere Glomerular permeabilitet i Fluorescent Macromolecules Bruke 2-Photon Mikroskopi i München Wistar rotter

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

I utero Måling av puls i Mouse av invasiv M-modus Ekkokardiografi

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

Carotisar infusjoner for farmakokinetiske og farmakodynamiske Analyse av Taxaner i Mus

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Automated Measurement of Pulmonary Emphysema and Small Airway Remodeling in Cigarette Smoke-exposed Mice

Automatisert Måling av lungeemfysem og Small Airway Ombygging i sigarettrøyk utsatte Mus

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1).  Animal models of COPD are used to identify molecules that ...

Measurement of the Pressure-volume Curve in Mouse Lungs

Måling av trykk volum Curve i Muse Lunger

In recent decades the mouse has become the primary animal model of a variety of lung diseases. In models of emphysema or fibrosis, the essential ...

Long-term Blood Pressure Measurement in Freely Moving Mice Using Telemetry

Langsiktig blodtrykksmåling i fritt bevegelige Mus Bruke Telemetri

During the development of new vasoactive agents, arterial blood pressure monitoring is crucial for evaluating the efficacy of the new proposed drugs. ...

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

Vurdering av nyrefunksjon i musen modeller av Glomerular sykdom

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

Highly Sensitive Measurement of Glomerular Permeability in Mice with Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70

Svært følsom måling av Glomerulær permeabilitet i mus med Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70

The loss of albumin in urine (albuminuria) predicts cardiovascular outcome. Under physiological conditions, small amounts of albumin are filtered by the ...