I dag vil vi demonstrere teknikken for transdermal måling av glomerulær filtrering eller tGFR hos mus. Det finnes en rekke funksjoner i denne metoden som jeg tror er verdt å nevne. Først av alt, for tiden tGFR er den mest nøyaktige måten å vurdere nyrefunksjon hos mus.
For det andre utføres tGFR i bevisste, fritt bevegelige mus, slik at det unngår komplikasjoner av anestesi. For det tredje, når du har mestret teknikken, det er rimelig å kunne utføre 30 til 40 tGFR målinger på en enkelt dag. Til slutt kan tGFR-målinger utføres gjentatte ganger i en in vitro-mus.
Hva dette betyr er at vi kan utføre seriemålinger av nyrefunksjon i akutte og kroniske sykdomsinnstillinger. Den største fordelen med denne teknikken er at den gjør det mulig for forskere å måle Glomerular Filtration Rate eller GFR i bevisste, fritt bevegelige mus med høy presisjon og følsomhet. En til to dager før tGFR-målingen, etter å ha bekreftet mangel på respons på tåklemme, plasser en bedøvet mus i utsatt posisjon på en varmepute.
Bruk en elektrisk barbermaskin, trim mot vekstretningen for å fjerne det meste av pelsen fra den ene siden av musens rygg fra toppen av bakbenene opp til nakken og over ribbeina. Bruk en bomullspinne til å påføre et tynt lag med hårfjerningskrem på den eksponerte huden mot vekstretningen for å sikre at kremen påføres så nær huden som mulig og fjerne kremen etter ett til tre minutter med rene bomullspinner og varmt vann. På dagen for prosedyren, trim en seks og tre centimeter lim patch til størrelsen på GFR enheten før peeling av baksiden av og stikker enheten til den selvklebende siden av med lysdioder plassert rett over det klare vinduet.
Fest deretter en liten del av til batteriet. For å feste skjermen, med den bedøvede musen i utsatt stilling, rengjør den forsedlede huden med 70% etanol og juster bredden på et ca. 12 centimeter stykke tape ved å rive den på langs. Plasser båndet under musen med to centimeter på den ene siden av dyret som bretter over den ene kanten av høyre side av båndet for enkel plassering og fjerning etter målingen.
Deretter kobler du batteriet til enheten, fjerner baksiden fra batteriet og plasserer batteriet på enheten på en sikker måte. Enheten er klar til bruk og datainnhentingen begynner når de blå lysdiodene begynner å blinke. Fjern baksiden fra plasteret på enheten og plasser enheten på den barberte huden slik at vinduet som eksponerer lysdiodene er over ribbeina som fester høyre side av enheten med tape.
Det er viktig å sikre sikker feste av enheten uten å begrense musens mobilitet eller legge for mye press på huden. Deretter vikler du fast venstre side av båndet rundt musen og enheten. La enheten ta opp en jevn bakgrunnslesing i tre minutter.
I mellomtiden varmer halen med en hodepute og legger en insulinsprøyte med riktig eksperimentelt volum av FITC-sinistrin for injeksjonen avrundet til de nærmeste 10 mikroliter. Administrer FITC-sinistrin intravenøst i en jevn, men rask bolus. Det er viktig at brukeren er komfortabel med IV injeksjoner som det er nødvendig å administrere FITC-sinistrin i en bolus i stedet for over flere forsøk som vil resultere i flere topper i klaring kurven.
For å måle tGFR, plasser musen i sitt eget bur med overvåking til full recumbency og la FITC-sinistrin klaring registreres i 1,5 timer. På slutten av måleperioden plasserer du musen på trådstativet på toppen av buret og lar musen gripe metallstenger, trekk båndet fra under magen i en rask jevn bevegelse. Fjern deretter et tape fra enheten og plasteret fra huden, og ta vare på at batteriet ikke kobler fra enheten og returnerer musen til buret.
Hvis du vil evaluere dataene, kobler du forsiktig fra batteriet og bruker en USB-kabel til å koble enheten til datamaskinen. Åpne leseprogramvaren, og klikk Koble til, les, Gi nytt navn til og Lagre. Lukk deretter programmet og behandle og evaluere dataene i analyseprogramvaren i henhold til produsentens instruksjoner.
Mens FITC-sinistrin raskt blir fjernet fra sirkulasjonen hos friske mus, er denne clearance dramatisk forsinket hos mus med akutt nyreskade. Hos mus med svært alvorlig akutt nyreskade kan det være svært liten eller ingen clearance av FITC-sinistrinfluorescensen i hele 90-minutters måleperioden som indikerer fullstendig fravær av glomerulær filtrering. Transdermal GFR måling er minimalt invasiv og kan derfor brukes til å overvåke endringer i nyrefunksjon hos individuelle dyr over flere tidspunkter.
Faktisk i dette representative eksperimentet viste sekvensielle målinger endringer i nyrefunksjonen på null, en, to og fire dager etter iskemireperfusjonsskade. I denne mus kronisk nyresykdom modell, det inverse forholdet mellom FITC-sinistrin halveringstid til GFR kan direkte korrelert til nedsatt nyrefunksjon observert hos disse dyrene. Faktisk korrelerer FITC-sinistrin halveringstiden tett med den semi-kvantitative histologiske vurderingen av rørformet skade over hele spekteret av GFR-målinger hos uskadede mus og hos mus med ulike alvorlighetsgrader av iskemireperfusjonsskadeindusert akutt nyreskade.
I motsetning viser serumkreatinin og blod urea nitrogen en positiv, men svakere korrelasjon med FITC-sinistrin clearance indikerer transkutan GFR målinger gir et mer pålitelig mål på nyreskade enn enten serumkreatinin eller blod urea nitrogen. Transdermal måling av GFR er et mer følsomt mål på nyrefunksjon enn tradisjonelle biomarkører som kreatinin og BUN. Dette gir en mer nøyaktig vurdering av effekten av nye terapier for nyresykdom i preklinisk forskning.
De mest kritiske trinnene i denne metoden er riktig vedlegg av enheten til musens rygg og vellykket IV-administrasjon av FITC-sinistrin. Disse trinnene er avgjørende for å oppnå en nøyaktig vurdering av GFR hos mus.
