Hoje, estaremos demonstrando a técnica de medição transdérmica de filtração glomerular ou tGFR em camundongos. Há uma série de características deste método que eu acho que vale a pena mencionar. Em primeiro lugar, atualmente o tGFR é a maneira mais precisa de avaliar a função renal em camundongos.
Em segundo lugar, o tGFR é realizado em camundongos conscientes e em movimento livre, evitando as complicações da anestesia. Em terceiro lugar, uma vez que você tenha dominado a técnica, é razoável ser capaz de realizar medições de 30 a 40 tGFR em um único dia. Finalmente, as medições de tGFR podem ser realizadas repetidamente em camundongos in vitro.
O que isso significa é que podemos realizar medições seriais da função renal em ambientes de doenças agudas e crônicas. A principal vantagem dessa técnica é que permite aos pesquisadores medir a Taxa de Filtragem Glomerular ou GFR em camundongos conscientes e em movimento livre com alta precisão e sensibilidade. Um a dois dias antes da medição do tGFR, depois de confirmar a falta de resposta ao aperto do dedo do pé, coloque um mouse anestesiado na posição propensa em uma almofada de aquecimento.
Usando uma máquina de barbear elétrica, apare contra a direção do crescimento para remover a maior parte da pele de um lado das costas do mouse do topo das patas traseiras até o pescoço e através das costelas. Use um broto de algodão para aplicar uma fina camada de creme de depilação na pele exposta contra a direção do crescimento para garantir que o creme seja aplicado o mais próximo possível da pele e remova o creme após um a três minutos com cotonetes de algodão limpo e água morna. No dia do procedimento, corte um patch adesivo de seis por três centímetros para o tamanho do dispositivo GFR antes de descascar a parte de trás do patch e colocar o dispositivo no lado adesivo do patch com os diodos emissores de luz posicionados imediatamente acima da janela clara.
Em seguida, coloque um pequeno pedaço do patch na bateria. Para fixar o monitor, com o rato anestesiado na posição propensa, limpe a pele pré-raspada com 70% de etanol e ajuste a largura de um pedaço de fita de aproximadamente 12 centímetros rasgando-a longitudinalmente. Coloque a fita sob o mouse com dois centímetros em um lado do animal dobrando sobre uma borda do lado direito da fita para fácil colocação e remoção após a medição.
Em seguida, conecte a bateria ao dispositivo, removendo o apoio da bateria e colocando a bateria com segurança no dispositivo. O dispositivo está pronto para uso e a aquisição de dados começa quando os LEDs azuis começam a piscar. Remova o apoio do patch no dispositivo e coloque o dispositivo sobre a pele raspada de tal forma que a janela que expo os LEDs esteja sobre as costelas que protegem o lado direito do dispositivo com fita.
É importante garantir a fixação segura do dispositivo sem restringir a mobilidade do mouse ou colocar muita pressão na pele. Em seguida, enrole firmemente o lado esquerdo da fita ao redor do mouse e do dispositivo. Deixe que o dispositivo grave uma leitura de fundo constante por três minutos.
Enquanto isso, aqueça a cauda com uma almofada para a cabeça e carregue uma seringa de insulina com o volume experimental apropriado de FITC-sinistrin para a injeção arredondada para os 10 microliters mais próximos. Administre o FITC-sinistrino por via intravenosa em um bolus liso, mas rápido. É importante que o usuário esteja confortável com injeções intravenosas, pois é necessário administrar com sucesso o FITC-sinistrin em um bolus, em vez de várias tentativas que resultarão em múltiplos picos na curva de liberação.
Para medir o tGFR, coloque o mouse em sua própria gaiola com monitoramento até a recumedência total e permita que o fitc-sinistrino seja registrado por 1,5 horas. No final do período de medição, coloque o mouse no rack de arame em cima da gaiola e permitindo que o mouse segure as barras de metal, puxe a fita debaixo da barriga em um movimento rápido e suave. Em seguida, remova qualquer fita do dispositivo e do patch da pele, tomando cuidado para que a bateria não desconecte do dispositivo e devolva o mouse para sua gaiola.
Para avaliar os dados, desconecte cuidadosamente a bateria e use um cabo USB para conectar o dispositivo ao computador. Abra o software de leitura e clique em Conectar, Ler, Renomear e Salvar. Em seguida, feche o programa e o processo e avalie os dados no software de análise de acordo com as instruções do fabricante.
Enquanto fitc-sinistrina é rapidamente liberado da circulação em camundongos saudáveis, esta liberação é dramaticamente retardada em camundongos com lesão renal aguda. Em camundongos com lesão renal aguda muito grave, pode haver muito pouco ou nenhum despejo da fluorescência FITC-sinistrina durante todo o período de medição de 90 minutos indicando uma completa ausência de filtragem glomerular. A medição transdérmica de GFR é minimamente invasiva e, portanto, pode ser usada para monitorar alterações na função renal em animais individuais ao longo de vários pontos de tempo.
De fato, neste experimento representativo, medições sequenciais demonstraram alterações na função renal em zero, um, dois e quatro dias após a lesão de reperfusão da isquemia. Neste modelo de doença renal crônica do camundongo, a relação inversa da meia-vida FITC-sinistrina com a RS pode estar diretamente correlacionada com a função renal prejudicada observada nesses animais. De fato, a meia-vida FITC-sinistrina correlaciona-se estreitamente com a avaliação histológica semi-quantitativa da lesão tubular sobre toda a gama de medidas de GFR em camundongos não feridos e em camundongos com diferentes gravidades da lesão renal aguda induzida por lesão aguda induzida por lesão de isquemia.
Em contraste, a creatinina séum e o nitrogênio da ureia sanguínea demonstram uma correlação positiva, mas mais fraca, com o despejo fitc-sinistrina indicando que as medidas transcutâneas de GFR fornecem uma medida mais confiável de lesão renal do que creatinina sérea ou nitrogênio de ureia sanguínea. A medição transdérmica da RS É uma medida mais sensível da função renal do que os biomarcadores tradicionais, como creatinina e BUN. Isso fornece uma avaliação mais precisa da eficácia de novas terapias para doenças renais em pesquisas pré-clínicas.
Os passos mais críticos neste método são o devido apego do dispositivo às costas do mouse e a bem sucedida administração IV do FITC-sinistrin. Essas etapas são essenciais para obter uma avaliação precisa da RSG em camundongos.
