Hoy, vamos a demostrar la técnica de medición transdérmica de filtración glomerular o tGFR en ratones. Hay una serie de características de este método que creo que vale la pena mencionar. En primer lugar, actualmente tGFR es la forma más precisa de evaluar la función renal en ratones.
En segundo lugar, el tGFR se realiza en ratones conscientes y en movimiento libre para evitar las complicaciones de la anestesia. En tercer lugar, una vez que haya dominado la técnica, es razonable poder realizar mediciones de 30 a 40 tGFR en un solo día. Por último, las mediciones de tGFR se pueden realizar repetidamente en ratones in vitro.
Lo que esto significa es que podemos realizar mediciones en serie de la función renal en entornos de enfermedades agudas y crónicas. La principal ventaja de esta técnica es que permite a los investigadores medir la tasa de filtración glomerular o GFR en ratones conscientes y en movimiento libre con alta precisión y sensibilidad. De uno a dos días antes de la medición tGFR, después de confirmar la falta de respuesta al pellizco del dedo del otro, coloque un ratón anestesiado en la posición propensa en una almohadilla de calor.
Usando una afeitadora eléctrica, recorta contra la dirección del crecimiento para eliminar la mayor parte del pelaje de un lado de la parte posterior del ratón desde la parte superior de las patas traseras hasta el cuello y a través de las costillas. Usa un bastoncillo de algodón para aplicar una fina capa de crema de depilación a la piel expuesta en la dirección del crecimiento para asegurar que la crema se aplique lo más cerca posible de la piel y retire la crema después de uno a tres minutos con hisopos de algodón limpio y agua tibia. El día del procedimiento, recorte un parche adhesivo de seis por tres centímetros al tamaño del dispositivo GFR antes de despegar la parte posterior del parche y pegar el dispositivo en el lado adhesivo del parche con los diodos emisores de luz colocados inmediatamente por encima de la ventana transparente.
A continuación, pegue una pequeña parte del parche en la batería. Para fijar el monitor, con el ratón anestesiado en la posición propensa, limpie la piel preafeitada con 70% de etanol y ajuste el ancho de una cinta de aproximadamente 12 centímetros rasgándola longitudinalmente. Coloque la cinta debajo del ratón con dos centímetros en un lado del animal doblando sobre un borde del lado derecho de la cinta para facilitar la colocación y extracción después de la medición.
A continuación, conecte la batería al dispositivo, quitando el respaldo de la batería y colocando de forma segura la batería en el dispositivo. El dispositivo está listo para usar y la adquisición de datos comienza cuando los LED azules comienzan a parpadear. Retire el respaldo del parche en el dispositivo y coloque el dispositivo en la piel afeitada de modo que la ventana que expone los LED esté sobre las costillas asegurando el lado derecho del dispositivo con cinta adhesiva.
Es importante garantizar una fijación segura del dispositivo sin restringir la movilidad del ratón ni ejercer demasiada presión sobre la piel. A continuación, envuelva firmemente el lado izquierdo de la cinta alrededor del ratón y el dispositivo. Permita que el dispositivo grabe una lectura de fondo constante durante tres minutos.
Mientras tanto, caliente la cola con una almohadilla para la cabeza y cargue una jeringa de insulina con el volumen experimental adecuado de FITC-sinistrin para la inyección redondeada a los 10 microlitros más cercanos. Administrar la FITC-sinistrina por vía intravenosa en un bolo suave pero rápido. Es importante que el usuario se sienta cómodo con inyecciones intravenosas, ya que es necesario administrar con éxito la FITC-sinistrin en un bolo en lugar de varios intentos que dará lugar a múltiples picos en la curva de aclaramiento.
Para medir el tGFR, coloque el ratón en su propia jaula con monitoreo hasta la recumbencia completa y permita que el aclaramiento FITC-sinistrin se registre durante 1,5 horas. Al final del período de medición, coloque el ratón en el estante de alambre en la parte superior de la jaula y permitiendo que el ratón agarre las barras metálicas, tire de la cinta desde debajo del vientre en un movimiento suave y rápido. A continuación, retire cualquier cinta del dispositivo y el parche de la piel, teniendo cuidado de que la batería no se desconecte del dispositivo y devuelva el ratón a su jaula.
Para evaluar los datos, desconecte cuidadosamente la batería y utilice un cable USB para conectar el dispositivo al ordenador. Abra el software de lectura y haga clic en Conectar, Leer, Cambiar nombre y Guardar. A continuación, cierre el programa y procese y evalúe los datos en el software de análisis de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Mientras que FITC-sinistrin se elimina rápidamente de la circulación en ratones sanos, este aclaramiento se retrasa dramáticamente en ratones con lesión renal aguda. En ratones con lesión renal aguda muy grave, puede haber muy poco o ningún aclaramiento de la fluorescencia FITC-sinistrin durante todo el período de medición de 90 minutos, lo que indica una ausencia completa de filtración glomerular. La medición transdérmica de GFR es mínimamente invasiva y, por lo tanto, se puede utilizar para controlar los cambios en la función renal en animales individuales en varios puntos de tiempo.
De hecho, en este experimento representativo, las mediciones secuenciales demostraron cambios en la función renal a cero, uno, dos y cuatro días después de la lesión por reperfusión de isquemia. En este modelo de enfermedad renal crónica de ratón, la relación inversa de la vida media FITC-sinistrina con la GFR se puede correlacionar directamente con la función renal deteriorada observada en estos animales. De hecho, la vida media FITC-sinistrin se correlaciona estrechamente con la evaluación histológica semicuantitativa de la lesión tubular en toda la gama de mediciones de GFR en ratones no lesionados y en ratones con diferentes severidades de lesión aguda inducida por lesión por reperfusión de isquemia.
Por el contrario, la creatinina sérica y el nitrógeno de la urea en sangre demuestran una correlación positiva pero más débil con el aclaramiento de FITC-sinistrin, lo que indica que las mediciones transcutáneas de GFR proporcionan una medida más fiable de la lesión renal que la creatinina sérica o el nitrógeno de urea en sangre. La medición transdérmica de GFR es una medida más sensible de la función renal que los biomarcadores tradicionales como la creatinina y el BUN. Esto proporciona una evaluación más precisa de la eficacia de nuevas terapias para la enfermedad renal en la investigación preclínica.
Los pasos más críticos en este método son la fijación adecuada del dispositivo a la espalda del ratón y la administración IV exitosa de FITC-sinistrin. Estos pasos son esenciales para obtener una evaluación precisa de GFR en ratones.
