Idag kommer vi att demonstrera tekniken för transdermal mätning av glomerulär filtrering eller tGFR hos möss. Det finns ett antal funktioner i denna metod som jag tycker är värda att nämna. Först av allt, för närvarande tGFR är det mest exakta sättet att bedöma njurfunktion hos möss.
För det andra utförs tGFR i medvetna, fritt rörliga möss så det undviker komplikationerna av anestesi. För det tredje, när du har bemästrat tekniken, det är rimligt att kunna utföra 30 till 40 tGFR mätningar på en enda dag. Slutligen kan tGFR-mätningar utföras upprepade gånger i en in vitro-möss.
Vad detta innebär är att vi kan utföra seriemätningar av njurfunktion i akuta och kroniska sjukdomsinställningar. Den största fördelen med denna teknik är att det gör det möjligt för forskare att mäta Glomerular Filtration Rate eller GFR i medvetna, fritt rörliga möss med hög precision och känslighet. En till två dagar före tGFR mätning, efter att ha bekräftat en brist på svar på tå nypa, placera en sövd mus i utsatt position på en värmedyna.
Med hjälp av en elektrisk rakapparat, trimma mot riktningen för tillväxt för att ta bort de flesta av pälsen från ena sidan av musens rygg från toppen av bakbenen upp till halsen och över revbenen. Använd en bomullstuss för att applicera ett tunt lager av depilationskräm på den exponerade huden mot tillväxtriktningen för att säkerställa att krämen appliceras så nära huden som möjligt och ta bort krämen efter en till tre minuter med rena bomullspinnar och varmt vatten. På dagen för förfarandet, trimma en sex med tre centimeter självhäftande patch till storleken på GFR-enheten innan du skalar av plåstrets baksida och sticker enheten till den självhäftande sidan av plåstret med de ljusavgivande dioderna placerade omedelbart ovanför det klara fönstret.
Stick sedan en liten bit av plåstret på batteriet. För att fästa bildskärmen, med den sövda musen i utsatt läge, rengör den förrakade huden med 70%etanol och justera bredden på en cirka 12 centimeter bit tejp genom att riva den på längden. Placera bandet under musen med två centimeter på ena sidan av djuret vikning över ena kanten av höger sida av bandet för enkel placering och borttagning efter mätningen.
Därefter ansluter du batteriet till enheten, tar bort uppbackningen från batteriet och säkert placerar batteriet på enheten. Enheten är klar att använda och dataanskaffningen börjar när de blå lysdioderna börjar blinka. Ta bort uppbackningen från plåstret på enheten och placera enheten på den rakade huden så att fönstret utsätta lysdioderna är över revbenen säkra den högra sidan av enheten med tejp.
Det är viktigt att säkerställa säker fastsättning av enheten utan att begränsa musens rörlighet eller sätta för mycket tryck på huden. Sedan fast linda den vänstra sidan av bandet runt musen och enheten. Låt enheten spela in en jämn bakgrundsavläsning i tre minuter.
Under tiden, värm svansen med en huvuddyna och ladda en insulinspruta med lämplig experimentell volym FITC-sinistrin för injektionen avrundad till närmaste 10 mikroliter. Administrera FITC-sinistrin intravenöst i en slät men snabb bolus. Det är viktigt att användaren är bekväm med IV injektioner eftersom det är nödvändigt att framgångsrikt administrera FITC-sinistrin i en bolus snarare än över flera försök som kommer att resultera i flera toppar i clearance kurvan.
För att mäta tGFR, placera musen i sin egen bur med övervakning tills full recumbency och låt FITC-sinistrin clearance registreras för 1,5 timmar. I slutet av mätperioden, placera musen på tråden rack ovanpå buren och låta musen att greppa metallstänger, dra bandet underifrån magen i en snabb jämn rörelse. Ta sedan bort eventuell tejp från enheten och plåstret från huden var noga med att batteriet inte kopplar från enheten och återför musen till sin bur.
Utvärdera data genom att försiktigt koppla bort batteriet och använda en USB-kabel för att ansluta enheten till datorn. Öppna läsprogramvaran och klicka på Anslut, Läs, Byt namn och Spara. Stäng sedan programmet och bearbeta och utvärdera data i analysprogramvaran enligt tillverkarens anvisningar.
Medan FITC-sinistrin snabbt rensas från cirkulationen hos friska möss, försenas detta clearance dramatiskt hos möss med akut njurskada. Hos möss med mycket svår akut njurskada kan det finnas mycket liten eller ingen clearance av FITC-sinistrinfluorescensen under hela 90-minutersmätningsperioden som indikerar en fullständig avsaknad av glomerulär filtrering. Transdermal GFR-mätning är minimalt invasiv och kan därför användas för att övervaka förändringar i njurfunktionen hos enskilda djur över flera tidspunkter.
I detta representativa experiment visade sekventiella mätningar förändringar i njurfunktionen vid noll, en, två och fyra dagar efter ischemi reperfusion skada. I denna mus kronisk njursjukdom modell, kan omvänt förhållandet av FITC-sinistrin halveringstiden till GFR direkt korrelerade till nedsatt njurfunktion observerats hos dessa djur. Fitc-sinistrin halveringstid korrelerar nära med den halvkvantitativa histologiska bedömningen av rörformig skada över hela intervallet av GFR-mätningar hos oskadade möss och hos möss med olika svårighetsgrader av ischemireperfusionsskada orsakad akut njurskada.
Däremot visar serum kreatinin och blod urea kväve en positiv men svagare korrelation med FITC-sinistrin clearance som anger de transkutant GFR mätningar ger ett mer tillförlitligt mått på njurskada än antingen serum kreatinin eller blod urea kväve. Depotmätning av GFR är ett känsligare mått på njurfunktionen än traditionella biomarkörer som kreatinin och BUN. Detta ger en mer exakt bedömning av effekten av nya terapier för njursjukdom i preklinisk forskning.
De mest kritiska stegen i denna metod är den korrekta fastsättning av enheten till musens rygg och den framgångsrika IV-administrationen av FITC-sinistrin. Dessa steg är avgörande för att få en korrekt bedömning av GFR hos möss.
