Måle interaksjoner Globular og trådformede proteiner av kjernefysiske magnetisk resonans spektroskopi (NRM) og Mikroskala Thermophoresis (MST)

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i proteininteraksjonsfeltet, for eksempel om protein binder seg direkte til et lite eller et stort molekyl. Den største fordelen med denne teknikken er at det er enkel og rask måte å oppdage direkte interaksjoner på atomnivå. Slå på luftstrømmen med utløsing kommandoen ej.

Dette vil bringe prøven opp fra magneten. Plasser nå prøven i en spinner på toppen av magneten i åpningen. Sett inn med kommandoen ij.

Vent til prøven legger seg inne i magneten før du fortsetter. Opprett et nytt datasett ved hjelp av edc-kommandoen og last inn standard proton NMR-parametere ved å velge eksperimentet ZGPR. Fyll ut feltene NAVN, eksperimentnummer og behandlet datamappenummer.

Velg løsningsmidlet i feltet Angi løsningsmiddel og klikk på Utfør getprosol for å lese standard probehead og løsningsmiddelavhengige parametere. Lås prøven til det deutererte løsningsmidlet ved hjelp av låsekommandoen og vent til den er ferdig med å feie og oppnår lås. Korriger resonansfrekvensen til magneten ved å justere prøven ved hjelp av det automatiske justeringskommandoatomet.

Overvåk wobblekurven til den automatiske justeringen er fullført. Shim magnetfeltet ved hjelp av topshim. Skiming gjør justering til magnetfeltet.

Oppnå ensartethet rundt prøven. Det er god praksis å lagre dette i verdier med kommandoen wsh, og lese dem ved hjelp av rsh før topshim, hvis du bruker de samme eller lignende eksemplene. Juster nå mottakerforsterking med rga-kommandoen for å oppnå maksimalt signal-til-støy-forhold.

Plasser midten av spekteret på vannresonansforskyvningen, og sett 90 graders protonpuls ved høy effekt ved hjelp av calibo1p1. Samle proton spekteret ved hjelp av null gå zg kommandoen og prosessen med efp. Dette inkluderer eksponentiell multiplikasjon, fri induksjonsforfall som omfatter linjeforstørking, Fourier transformasjon av FID og PK for å anvende fasekorreksjon.

Bruk automatisk fasekorrigering apk og automatisk baseline korreksjon absn ved hjelp av polynom uten integrering alternativet. Opprett et nytt datasett for SOFAST HMBC-eksperimentet ved å velge SFHMQC3GPPH i eksperimentet. Kopier den optimaliserte P1 og O1 fra protonspekteret og fyll P1 avhengige pulser ved hjelp av kommandoen getprosol 1H p1 plw1, hvor p1 er den optimaliserte P1-verdien, og plw1 er effektnivået for P1. Nå optimalisere CNST54 konstant for å sette forskyvningen for midt kjemisk skift.

Optimaliser også CNST55 for å definere båndbredden for å omfatte de spektrale områdene av interesse, slik at mottakeren får optimalisert. Hvis du vil velge disse parameterne, trekker du ut den første FID-en fra det todimensjonale spekteret og ser etter det observerte signalet for å definere dem. I tillegg varierer avslapningsforsinkelsen, antall skanninger og dummy-skanninger for å oppnå akseptabel signalfølsomhet med kommando gs, som gjør det mulig å gå og skanne for å overvåke datakvaliteten i sanntid.

Til slutt registrerer du spektra ved hjelp av Zero Go zg. Angi behandlingsparameterne til størrelsen på de direkte F2- og indirekte F1-dimensjonene i spekteret, med valgfri lineær prediksjon i den indirekte dimensjonen. Velg QSINE som Vindu-funksjonen, og angi et Sinus-klokkeskift på to for å behandle det todimensjonale spekteret.

Skriv inn kommandoen xfb for å behandle dataene i begge retninger med vindusfunksjon og Fourier-transformasjon. Bruk kommandoen apk2d til å utføre automatisk fasekorrigering i begge retninger. Korriger grunnlinjen med den automatiske baselinekorrigeringsfunksjonen abs2 for 2D-data.

Dette gjelder en polynomfunksjon mellom ppm-verdiene som er definert i behandlingsparametrene, og vil produsere et 2D-spektrum for videre analyse. Hvis du planlegger å utføre seriell behandling for sammenligning av samhandlingsdata med et annet molekyl, lagrer du behandlingsparametrene med kommandoen wpar og tilbakekaller dem med rpar. Skriv inn kommandoen pp for å starte prosessen med toppplukking.

Definer ppm-området, minimumsintensiteten og maksimalt antall topper basert på forventede topper. Klikk deretter OK. Kontroller resultatene ved visuell inspeksjon. Om nødvendig, kjør prosessen på nytt til resultatene er tilfredsstillende basert på spektrakvalitet.

Generer en toppliste med pp-kommandoen. Denne topplisten inneholder datahøyde- og toppintensitetsinformasjon som standard. Topplisten kan eksporteres til etterfølgende spektrum og kan leses av andre programmer.

Nå observere protein HSQC spektra for endringer i topp intensiteter eller bevegelse i kjemiske skift som indikerer interaksjon med et annet molekyl. Hvis det interagerende molekylet er stort, forvent reduksjoner i toppintensiteter sammen med forsvinning av noen topper. Importer topplisten til neste datasett ved å klikke på topper-fanen og velge import med et høyreklikk i toppvinduet.

Visualiser toppene over spekteret, og flytt dem om nødvendig til nye posisjoner. Klikk på tilbakestillingsintensiteter for fullstendig tabell for å generere en toppliste for spekteret som inkluderer intensiteter. Denne topplisten vil overføre posisjonsinformasjonen fra den lagrede topplisten.

Eksporter topplistene fra forskjellige datasett til et regneark eller et annet matematisk program for analyse ved å velge Eksporter-funksjonen. Beregn endringen i toppintensiteter med funksjonen toppintensitet i komplekst spektrum, toppintensitet i proteinspektrum for hver topp. Verdier kan konverteres til prosentvis endring ved multiplikasjon med 100.

Legg merke til at toppvolumer også er nyttige, selv om toppintensiteter er lettere å måle for topper som er plassert nær hverandre, som vanligvis er tilfelle for proteiner med høy tetthet av relativt brede topper. N15HSQCs ble kjøpt for vill type E-PRD, samt R1914E mutant, i nærvær eller fravær av VimRod. Spekteret av vill type E-PRD viser forventet antall godt løste topper, noe som indikerer et riktig brettet protein.

I nærvær av VimRod viser spekteret omfattende linjeut utvidelse og toppforsvinning, tilsvarende binding mellom E-PRD og VimRod. Det observeres liten endring mellom spekteret av R1914E-mutanten alene og ved tilsetning av VimRod, noe som indikerer mangel på binding til denne muterte E-PRD. Her ble E-PRD-toppintensitetene i nærvær og fravær av VimRod sammenlignet og plottet som de relative toppintensitetene for å indikere omfanget av topputviding i E-PRD-komplekset.

For å validere og kvantisere bindingen av VimRod og E-PRD ble MST-analyse ved hjelp av His6-VimRod merket med fluorescerende RED-tris-NTA-fargestoff som mål, utført ved hjelp av synkende konsentrasjoner av E-PRD ligand. Dataene var egnet med en standard modell av ett-sted ligand binding og ga en KD på 25,7 pluss eller minus 2,1 mikromos. Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske å bruke identiske oppkjøps- og behandlingsbetingelser.

vil slite på grunn av tilgang til isotop merket proteinprøver for innsamling av NMR spektra. Implikasjonene av denne teknikken strekker seg mot terapi av kreft, infeksjon eller nevrodegenerativ sykdom fordi de involverer dannelse av proteininteraksjoner som er kompromittert i sykdommen.