Mäta interaktion av klotformig och fintrådiga proteiner av kärnmagnetisk resonansspektroskopi (NMR) och hur provtagningsutrustningen skall Thermophoresis (MST)

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom proteininteraktionsfältet som om protein binder till en liten eller en stor molekyl direkt. Den största fördelen med denna teknik är att det är enkelt och snabbt sätt att upptäcka direkta interaktioner på atomnivå. Slå på luftflödet med utkastkommandot ej.

Detta kommer att föra provet upp från magneten. Nu, placera provet inom en spinner ovanpå magneten i öppningen. Infoga med kommandot ij.

Vänta tills provet lagt sig inuti magneten innan du fortsätter. Skapa en ny datauppsättning med hjälp av EDC-kommandot och ladda standard proton-NMR-parametrar genom att välja experimentet ZGPR. Fyll i fälten NAMN, experimentnummer och bearbetat datamappsnummer.

Välj lösningsmedlet i Set lösningsmedelsfältet och klicka på Execute getprosol för att läsa standardprobhead och lösningsmedelsberoende parametrar. Lås provet till det deutererade lösningsmedlet med hjälp av låskommandot och vänta tills det är klart sotning och uppnår lås. Korrigera magnetens resonansfrekvens genom att stämma provet med hjälp av det automatiska trimkommandot atma.

Övervaka wobblekurvan tills den automatiska justeringen är klar. Shim det magnetiska fältet med hjälp av topshim. Shimming gör justering till magnetfältet.

Uppnå enhetlighet runt provet. Det är god praxis att lagra detta i värden med kommandot wsh, och läsa dem med hjälp av rsh innan topshim, om du använder samma eller liknande prover. Justera nu mottagarens förstärkning med kommandot RGA för att uppnå maximalt signal-brusförhållande.

Placera mitten av spektrumet på vattenresonansförskjutningen, och ställ in 90 graders protonpuls vid hög effekt med hjälp av calibo1p1. Samla in protonspektrumet med hjälp av kommandot zero go zg och process med efp. Detta inkluderar exponentiell multiplikation, den fria induktionen förfaller som inkorporerar att öka, Fourier omformning av FID, och pk att applicera arrangera gradvis korrigering.

Applicera den automatiska faskorrigerings-apken och den automatiska baslinjekorrigerings absn med hjälp av alternativet polynom utan integration. Skapa en ny datauppsättning för SOFAST HMBC-experimentet genom att välja SFHMQC3GPPH i experiment. Kopiera den optimerade P1 och O1 från protonspektrumet och befolka P1-beroende pulser genom att använda kommandot getprosol 1H p1 plw1, där P1 är det optimerade P1-värdet, och plw1 är effektnivån för P1. Nu, optimera CNST54 konstant för att ställa offset för amide kemiska shift.

Optimera också CNST55 för att definiera bandbredden för att omfatta de spektrala regionerna av intresse, vilket gör att mottagaren vinner att optimeras. För att välja dessa parametrar, extrahera den första FID från det tvådimensionella spektrumet och leta efter den observerade signalen för att definiera dem. Dessutom variera avkoppling dröjsmål, antal skanningar, och dummy skanningar för att få godtagbara signalkänslighet med kommandot gs, som möjliggör gå och skanna för att övervaka datakvalitet i realtid.

Slutligen, spela in spektra med hjälp av Zero Go zg. Ställ in bearbetningsparametrarna till storleken på de direkta F2- och indirekta F1-dimensionerna för spektrumet, med valfri linjär förutsägelse i den indirekta dimensionen. Välj QSINE som Funktionen Fönster och ange en Sine bell shift av två för att bearbeta det tvådimensionella spektrumet.

Ange kommandot xfb för att bearbeta data i båda riktningarna med fönsterfunktion och Fourier-omvandling. Använd kommandot apk2d för att utföra automatisk faskorrigering i båda riktningarna. Korrigera baslinjen med den automatiska baslinjekorrigeringsfunktionen abs2 för 2D-data.

Detta gäller en polynomfunktion mellan de ppm-värden som definieras i bearbetningsparametrarna, och kommer att producera ett 2D-spektrum för vidare analys. Om planering för att utföra seriell bearbetning för jämförelse av interaktionsdata med en annan molekyl, lagra bearbetningsparametrar med kommandot wpar och återkalla dem med rpar. Ange kommandot pp för att påbörja processen med toppplockning.

Definiera ppm-intervallet, lägsta intensitet och maximalt antal toppar baserat på förväntade toppar. Klicka sedan på OK. Verifiera resultaten genom visuell inspektion. Om det behövs, åter köra processen tills resultaten är tillfredsställande baserat på spektra kvalitet.

Generera en topplista med kommandot pp. Den här topplistan innehåller datahöjd och toppintensitetsinformation som standard. Topplistan kan exporteras till efterföljande spektrum och kan läsas av andra program.

Observera nu proteinet HSQC-spektra för förändringar i toppintensiteter eller rörelse i kemiska förskjutningar som indikerar interaktion med en annan molekyl. Om den interagerande molekylen är stor, förvänta minskningar i topp intensiteter tillsammans med försvinnandet av vissa toppar. Importera topplistan till nästa datauppsättning genom att klicka på toppfliken och välja import med ett högerklick i fönstret Peaks.

Visualisera topparna över spektrumet och vid behov, flytta dem till nya positioner. Klicka på resetintensiteter för komplett tabell för att generera en topplista för det spektrum som innehåller intensiteter. Denna topplista kommer att föra över positionsinformationen från den lagrade topplistan.

Exportera topplistorna från olika datauppsättningar till ett kalkylblad eller något annat matematiskt program för analys genom att välja funktionen Exportera. Beräkna förändringen i toppintensiteter med funktionen toppintensitet i komplext spektrum, toppintensitet i proteinspektrum för varje topp. Värden kan konverteras till procentuell förändring med multiplikation med 100.

Observera att toppvolymer också är användbara, även om toppintensiteter är lättare att mäta för toppar som är placerade nära varandra, vilket vanligtvis är fallet för proteiner med en hög densitet av relativt breda toppar. N15HSQCs förvärvades för den vilda typen E-PRD, liksom R1914E mutant, i närvaro eller frånvaro av VimRod. Spektrumet av vilda typ E-PRD visar det förväntade antalet väl lösta toppar, vilket tyder på ett korrekt vikt protein.

I närvaro av VimRod, visar spektrumet omfattande linje breddning och topp försvinnande, motsvarande bindning mellan E-PRD och VimRod. Liten förändring observeras mellan spektrumet av R1914E mutant på egen hand och vid tillägg av VimRod, vilket tyder på en brist på bindande för denna mutanta E-PRD. Här jämfördes E-PRD toppintensiteterna i närvaro och frånvaro av VimRod och ritades som de relativa toppintensiteterna för att indikera intervallet av topp breddning i E-PRD-komplexet.

För att validera och kvantifiera bindningen av VimRod och E-PRD utfördes MST-analys med his6-VimRod märkt med fluorescerande RÖD-tris-NTA-färgämne som mål, med hjälp av minskande koncentrationer av E-PRD-liganden. Uppgifterna var lämpliga med en standardmodell av en-plats ligand bindning och gav en KD på 25,7 plus eller minus 2,1 mikromolar. Medan du försöker denna procedur, är det viktigt att komma ihåg att använda identiska förvärv och bearbetning villkor.

kommer att kämpa på grund av tillgång till isotop märkta proteinprover för insamling av NMR-spektra. Konsekvenserna av denna teknik sträcker sig mot terapi av cancer, infektion eller neurodegenerativa sjukdom eftersom de innebär bildandet av protein interaktioner som äventyras i sjukdomen.