Name: isolation of glomeruli and in vivo labeling of glomerular cell surface proteins
Uploaded: 2019-01-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins at JoVE.com

يشكر المؤلفون بلانكا دوفنجاك لها المساعدة التقنية استثنائية. ودعم هذا العمل Deutsche الأوقيانوغرافية (www.dfg.de) WO1811/2-1 إلى M.W. و QU280/3-1 للذكاء. وكان ممولاً أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات، وتحليل البيانات، وقرار نشر، وإعداد المخطوط.

وتم الحصول على الفئران كسلالة داخلية من مرفق الرعاية الحيوانية المحلية أو من "مختبرات جانفييه" في فرنسا. التحقيقات التي أجريت وفقا للمبادئ التوجيهية الواردة في الدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (الولايات المتحدة الوطنية معاهد للصحة المنشور رقم 85-23، تنقيح عام 1996). أجريت جميع التج...

<ol>
	<li>Jefferson, J. A., Alpers, C. E., Shankland, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocyte+biology+for+the+bedside.">Podocyte biology for the bedside.</a> American Journal of Kidney Disease. 58 (5), 835-845 (2011).</li><li>Konigshausen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+increases+glomerular+permeability+by+beta-arrestin+mediated+nephrin+endocytosis.">Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis.</a> Scientific Reports. 6, 39513 (2016).</li><li>Quack, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Arrestin2+mediates+nephrin+endocytosis+and+impairs+slit+diaphragm+integrity.">beta-Arrestin2 mediates nephrin endocytosis and impairs slit diaphragm integrity.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (38), 14110-14115 (2006).</li><li>Quack, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKC+alpha+mediates+beta-arrestin2-dependent+nephrin+endocytosis+in+hyperglycemia.">PKC alpha mediates beta-arrestin2-dependent nephrin endocytosis in hyperglycemia.</a> Journal of Biological Chemitry. 286 (15), 12959-12970 (2011).</li><li>Swiatecka-Urban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+Trafficking+at+the+Mature+Podocyte+Slit+Diaphragm.">Endocytic Trafficking at the Mature Podocyte Slit Diaphragm.</a> Frontiers in Pediatrics. 5, 32 (2017).</li><li>Swiatecka-Urban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+trafficking+in+podocyte+health+and+disease.">Membrane trafficking in podocyte health and disease.</a> Pediatric Nephrology. 28 (9), 1723-1737 (2013).</li><li>Soda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+dynamin,+synaptojanin,+and+endophilin+in+podocyte+foot+processes.">Role of dynamin, synaptojanin, and endophilin in podocyte foot processes.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4401-4411 (2012).</li><li>Kestila, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positionally+cloned+gene+for+a+novel+glomerular+protein--nephrin--is+mutated+in+congenital+nephrotic+syndrome.">Positionally cloned gene for a novel glomerular protein--nephrin--is mutated in congenital nephrotic syndrome.</a> Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).</li><li>Martin, C. E., Jones, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephrin+Signaling+in+the+Podocyte:+An+Updated+View+of+Signal+Regulation+at+the+Slit+Diaphragm+and+Beyond.">Nephrin Signaling in the Podocyte: An Updated View of Signal Regulation at the Slit Diaphragm and Beyond.</a> Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 9, 302 (2018).</li><li>Nielsen, J. S., McNagny, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+podocalyxin+in+health+and+disease.">The role of podocalyxin in health and disease.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (8), 1669-1676 (2009).</li><li>Yasuda, T., Saegusa, C., Kamakura, S., Sumimoto, H., Fukuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab27+effector+Slp2-a+transports+the+apical+signaling+molecule+podocalyxin+to+the+apical+surface+of+MDCK+II+cells+and+regulates+claudin-2+expression.">Rab27 effector Slp2-a transports the apical signaling molecule podocalyxin to the apical surface of MDCK II cells and regulates claudin-2 expression.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3229-3239 (2012).</li><li>Tossidou, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocytic+PKC-alpha+is+regulated+in+murine+and+human+diabetes+and+mediates+nephrin+endocytosis.">Podocytic PKC-alpha is regulated in murine and human diabetes and mediates nephrin endocytosis.</a> Public Library of Science One. 5 (4), 10185 (2010).</li><li>Qin, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+nephrin+triggers+its+internalization+by+raft-mediated+endocytosis.">Phosphorylation of nephrin triggers its internalization by raft-mediated endocytosis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (12), 2534-2545 (2009).</li><li>Waters, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+promotes+dynamin-dependent+endocytosis+of+nephrin.">Notch promotes dynamin-dependent endocytosis of nephrin.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (1), 27-35 (2012).</li><li>Zhang, X., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+tyrosine+kinases+endocytosis+in+endothelium:+biology+and+signaling.">Receptor tyrosine kinases endocytosis in endothelium: biology and signaling.</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 34 (9), 1831-1837 (2014).</li><li>Maes, H., Olmeda, D., Soengas, M. S., Agostinis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+trafficking+mechanisms+in+endothelial+cells+as+modulators+of+the+tumor+vasculature+and+targets+of+antiangiogenic+therapies.">Vesicular trafficking mechanisms in endothelial cells as modulators of the tumor vasculature and targets of antiangiogenic therapies.</a> Federation of European Biochemical Societies Journal. 283 (1), 25-38 (2016).</li><li>Satchell, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+immortalized+human+glomerular+endothelial+cells+expressing+fenestrations+in+response+to+VEGF.">Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF.</a> Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).</li><li>Takemoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+large+scale+isolation+of+kidney+glomeruli+from+mice.">A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice.</a> American Journal of Pathology. 161 (3), 799-805 (2002).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+glomeruli+from+mice:+A+practical+approach+for+beginners.">Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners.</a> Experimental and Therapeutic Medicine. 5 (5), 1322-1326 (2013).</li><li>Haase, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vivo+method+to+quantify+slit+diaphragm+protein+abundance+in+murine+proteinuric+kidney+disease.">A novel in vivo method to quantify slit diaphragm protein abundance in murine proteinuric kidney disease.</a> Public Library of Science One. 12 (6), 0179217 (2017).</li><li>Satoh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=aPKClambda+maintains+the+integrity+of+the+glomerular+slit+diaphragm+through+trafficking+of+nephrin+to+the+cell+surface.">aPKClambda maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface.</a> Journal of Biochemistry. 156 (2), 115-128 (2014).</li><li>Tomas, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombospondin+type-1+domain-containing+7A+in+idiopathic+membranous+nephropathy.">Thrombospondin type-1 domain-containing 7A in idiopathic membranous nephropathy.</a> New England Journal of Medicine. 371 (24), 2277-2287 (2014).</li><li>Daniels, G. M., Amara, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+labeling+of+neurotransmitter+transporters+at+the+cell+surface.">Selective labeling of neurotransmitter transporters at the cell surface.</a> Methods in Enzymology. 296, 307-318 (1998).</li><li>Ougaard, M. K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+Nephrotoxic+Nephritis+as+a+Model+of+Chronic+Kidney+Disease.">Murine Nephrotoxic Nephritis as a Model of Chronic Kidney Disease.</a> International Journal of Nephrology. 2018, 8424502 (2018).</li><li>Salant, D. J., Darby, C., Couser, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+membranous+glomerulonephritis+in+rats.+Quantitative+studies+of+glomerular+immune+deposit+formation+in+isolated+glomeruli+and+whole+animals.">Experimental membranous glomerulonephritis in rats. Quantitative studies of glomerular immune deposit formation in isolated glomeruli and whole animals.</a> Journal of Clinical Investigation. 66 (1), 71-81 (1980).</li></ol>

طريقة عرض يتيح نجاح عزل glomeruli للتحقيق في الجيش الملكي النيبالي الكبيبي أو البروتين. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يؤديها الثقافات الخلية الكبيبي الأولية من glomeruli معزولة. إذا تم تطبيق البيوتين قبل عزلة الكبيبي، يمكن إجراء وسم البروتينات السطحية خلية الكبيبي. باستخدام هذا الأسلوب، يمكن دراسته...

بيله هو السمة مميزة للإصابة الكبيبي، وعادة ما يصاحب اضطراب تصفية الكبيبي1. وتتألف التصفية الكبيبي البطانة فينيستراتيد والغشاء الكبيبي، وبودوسيتيس. التركيب الجزيئي الدقيق لتصفية الكبيبي درجة عالية من الديناميكية ورهنا بروتين سطح الخلية الاتجار في كلا الكليتين صحية والمريضة2،3،،من45،6 . ثبت الالتقام بروتينات السطحية خلية أساسية لبقاء بودوسيتيس7. نيفرين وبودوكاليكسين بالبروتينات ترانسميمبراني أعرب عن بودوسيتيس. نيفرين هو العمود الفقري للغشاء الكبيبي طولية، بينما بودوكاليكسين سيالوجليكوبروتين طلاء العمليات الثانوية سيرا على الأقدام من بودوسيتيس8،،من910. الاتجار اندوسيتيك سابقا وقد تبين نيفرين وبودوكاليكسين3،،من1112،،من1314.
على حد علمنا، الالتقام الخلية البروتينات السطحية قد لا بعد وصفت في خلايا بطانية الكبيبي في الأدب. ومع ذلك، عموما خلايا بطانية التعبير عن جميع البروتينات اللازمة لأنواع مختلفة من الالتقام (أي، تعتمد على كلاثرين، وتعتمد على طوف الالتقام)15،16. ولذلك، قد درس الاتجار بسطح الخلية البطانية بهذا الأسلوب باستخدام، على سبيل المثال، الأوعية الدموية غشائي (هاء)-كادهيرين وجزيء الالتصاق داخل الخلايا (ICAM-2) كخلية سطح البروتين علامة لخلايا بطانية الكبيبي17 .
ولسوء الحظ، ليس هناك دقيقة في المختبر نموذج لحساسة الطبقات الثلاث الكبيبي عامل التصفية في الخلية التي يمكن دراستها الاتجار بالبروتين السطحي. والهدف من هذا الأسلوب التالي لدراسة البروتين الكبيبي الاتجار في فيفو. وبالإضافة إلى ذلك، يتضمن هذا البروتوكول معلومات عن كيفية عزل glomeruli، تمكين مزيد من التحليل الكبيبي الجيش الملكي النيبالي، والبروتينات، أو خلايا. عزل الكبيبي مماثلة قد وصفت التقنيات بمختلف المجموعات18،19.
سابقا، ونحن وآخرون قد استخدمت السابقين فيفو وسم البروتينات السطحية خلية الكبيبي بيوتينيليشن2،3،4،،من2021. ومع ذلك، في هذا الأسلوب السابقين فيفو ، تعرضت glomeruli معزولة للإجهاد الميكانيكي، والتي قد تؤثر على الاتجار اندوسيتيك. وبدلاً من ذلك، على نطاق واسع قد استخدم الفلورة وسم البروتينات السطحية خلية الكبيبي في الأدب2،،من2022. مع هذا الأسلوب، ومع ذلك، يمكن تحليلها إلا عدد قليل من البروتينات داخل شريحة واحدة، وكوانتيتيشن الصور الفلورة في كثير من الأحيان صعبة.
يوفر هذا الأسلوب الرواية في فيفو أداة موثوقة لدراسة الخلية الكبيبي البروتين السطحي وفرة والاتجار دقة في صحية ومريضة الكلي، ويمكن استخدامه كإضافة إلى اختبارات الفلورة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:671px;" width="669">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Motic SMZ168 BL</td>
			<td style="width:77px;">Motic</td>
			<td style="width:101px;">SMZ168BL</td>
			<td style="width:235px;">microscope for mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:257px;">KL1500LCD</td>
			<td style="width:77px;">Pulch and Lorenz microscopy</td>
			<td style="width:101px;">150500</td>
			<td>light for mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Rompun (Xylazin) 2%</td>
			<td style="width:77px;">Bayer</td>
			<td>PZN:01320422</td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Microfederschere</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">FD100R</td>
			<td>fine scissors, for cut into the aorta</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Durotip Feine Scheren</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BC210R</td>
			<td>for abdominal cut</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Anatomische Pinzette</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BD215R</td>
			<td>for surgery until the abdomen is opened</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Pr&#228;parierklemme</td>
			<td style="width:77px;">Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BJ008R</td>
			<td>for surgery&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Seraflex</td>
			<td style="width:77px;">Serag Wiessner</td>
			<td style="width:101px;">IC108000</td>
			<td>silk thread</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Ketamine 10%</td>
			<td style="width:77px;">Medistar</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Rompun (Xylazin) 2%</td>
			<td style="width:77px;">Bayer</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm</td>
			<td style="width:77px;">Portex</td>
			<td style="width:101px;">800/100/100</td>
			<td style="width:235px;">Catheter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm</td>
			<td style="width:77px;">Portex</td>
			<td style="width:101px;">800/100/200</td>
			<td style="width:235px;">Catheter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Harvard apparatus 11 Plus</td>
			<td style="width:77px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:101px;">70-2209</td>
			<td>syringe pump</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin</td>
			<td style="width:77px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">21335</td>
			<td>biotin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Dynabeads Untouched Mouse T-cells</td>
			<td style="width:77px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">11413D</td>
			<td>to embolize glomeruli</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Collagenase A</td>
			<td style="width:77px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">10103578001</td>
			<td>to digest kidney tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">DynaMag-2</td>
			<td style="width:77px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">123.21D</td>
			<td>Magnet catcher</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">100&#181;m cell stainer</td>
			<td style="width:77px;">Greiner-bio</td>
			<td style="width:101px;">542000</td>
			<td>for glomerular isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Axiovert 40 CFL</td>
			<td style="width:77px;">Zeiss</td>
			<td style="width:101px;">non available</td>
			<td>to confirm glomerular purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">TissueRuptor</td>
			<td style="width:77px;">Quiagen</td>
			<td style="width:101px;">9002755</td>
			<td>Tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">CHAPS</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">C3023</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Tris-HCL</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T5941</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">NaCl</td>
			<td style="width:77px;">VWR chemicals</td>
			<td style="width:101px;">27810295</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">NaF</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">201154</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">EDTA</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">E5134</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">ATP</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">34369-07-8</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:77px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">23225</td>
			<td>Follow the manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">nephrin antibody</td>
			<td style="width:77px;">Progen</td>
			<td style="width:101px;">GP-N2</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Polyclonal goat anti-podocalyxin antibody</td>
			<td style="width:77px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:101px;">AF15556-SP</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Streptavidin Agarose Resin</td>
			<td style="width:77px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">20347</td>
			<td>for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:257px;">Protein A sepharose CL-4B</td>
			<td style="width:77px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:101px;">17096303</td>
			<td>for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">polyclonal rabbit anti-p57 antibody</td>
			<td style="width:77px;">SCBT</td>
			<td style="width:101px;">sc-8298</td>
			<td>for Immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">mouse monoclonal anti-beta actin antibody, clone AC-74</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">A2228</td>
			<td>Western blot loading control</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">rabbit anti-p44/42</td>
			<td style="width:77px;">cell signalling</td>
			<td style="width:101px;">4695</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Pierce High sensitivity streptavidin-HRP</td>
			<td style="width:77px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">21130</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">polyclonal mouse ICAM-2 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF774</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">polyclonal mouse anti-VE-cadherin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF1002</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of glomeruli and in vivo labeling of glomerular cell surface proteins

بروتينية ناتجة عن تعطيل عامل التصفية الكبيبي الذي يتكون البطانة فينيستراتيد والغشاء الكبيبي، وبودوسيتيس مع أغشية شق بهم. هيكل حساسة لتصفية الكبيبي، لا سيما الشق الحجاب الحاجز، يعتمد على التفاعل بين البروتينات السطحية الخلية المتنوعة. دراسة هذه الخلية البروتينات السطحية كانت حتى الآن محدودة للدراسات في المختبر أو تحليل النسجية. نقدم هنا، بيوتينيليشن مورين في فيفو وسم الأسلوب الذي يتيح دراسة الخلية الكبيبي البروتينات السطحية تحت الظروف الفسيولوجية وباثوفيسيولوجيك. هذا البروتوكول يتضمن معلومات عن كيفية نتخلل الكلي الماوس وعزل glomeruli وأداء إيمونوبريسيبيتيشن الذاتية من بروتين فائدة. كوانتيتيشن شبه خلية الكبيبي السطحية الوفرة متاحة بسهولة مع هذا الأسلوب الرواية، والوصول إلى نضح البيوتين جميع البروتينات ويمكن دراسة إيمونوبريسيبيتيشن. وباﻹضافة إلى ذلك، عزل glomeruli مع أو بدون بيوتينيليشن تمكن مزيد تحليل الكبيبي الجيش الملكي النيبالي والبروتين، فضلا عن ثقافة الخلية الكبيبي الأولية (أي، بودوسيتي الرئيسية الخلية الثقافة).

لعزل جلوميرولي بدقة، من الضروري أن نتخلل موريني الكلي مع ببسكم أولاً. يتحول التروية مع ببسكم الكلي شاحبة (الشكل 1أ). الانصمام glomeruli مع الخرز المغناطيسي سوف تظهر كنقط بني على السطح الكلي (الشكل 1ب). قد تظهر عزلة glomeruli مع الما?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins at JoVE.com

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

عزل جلوميرولي و في فيفو وسم البروتينات السطحية خلية الكبيبي

نقدم هنا بروتوكولا مورين في فيفو وسم البروتينات السطحية خلية الكبيبي مع البيوتين. هذا البروتوكول يتضمن معلومات عن كيفية نتخلل الكلي الماوس وعزل glomeruli وأداء إيمونوبريسيبيتيشن الذاتية من بروتين الفائدة.

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أمراض الكلى حول دور الاتجار ببروتين سطح الخلية في البروتينات وليس مرض الكلى البروتيني. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يسهل دراسة الاتجار البروتين السطحي الخلية في- vivo وأنه يمكن تحليل أكثر من بروتين واحد لكل تجربة. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة على الاتجار سطح الخلايا الكبيّة، يمكن أيضا أن تطبق على نظم الأعضاء الأخرى التي يتم perfused ويمكن الوصول إليها عن طريق تقنيات العزل.تبدأ من خلال تأكيد عدم وجود استجابة لقرصة إصبع والتطهير الجانب البطني من الماوس تخدير مع 70٪ isopropyl. جعل قطع متوسط من خلال الجلد من الحوض إلى القص واستخدام ملاقط لإزالة الجلد من اللفافة البطنية. قطع الجلد على جانبي خط وسط البطن وجعل المتوسطة من خلال طبقة عضلات البطن من المثانة إلى xiphoid.استخدام مقص ملقط لتقسيم العضلات إلى أربعة أرباع واستخدام اثنين من المشابك الجراحية لتأمين الربعين العلويين نحو عنق الحيوانات. وضع الحيوان تحت المجهر تشريح واستخدام مبادلة عقيمة لنقل جانبا الأجهزة الحشوية. باستخدام مقص غرامة، وقطع الرباط الكبدي.باستخدام ملاقط الجراحية غرامة، ووضع خياطة واحدة حول الشريان المينارت الكبدي برانيال الشرايين الكلوية. وحول الشريان الأورطي، القريب من الشرايين الكلوية، في الغدة الكظرية. حرّر الشريان الأورطي من اللفة والدهون والأنسجة الأخرى.ثم، المشبك في الوريد الكافا والشراية الأبهر في ذروة التشعب ووضع خياطة أخرى حول الشريان الأورطي من الشرايين الكلوية. استخدام ملاقط لتشد خياطة الأبهر القريبة، مما يخفف من تدفق الدم وقطع حفرة صغيرة نصف قطر الشريان الأورطي في الشريان الأورطي، وينعزل إلى الشرايين الكلوية. أدخل قسطرة 10 سنتيمترا تعلق على حقنة 10 ملليلتر تحتوي على خمسة ملليلتر من الجليد البارد PBS بالإضافة إلى الكالسيوم والمغنيسيوم في الشريان الأورطي.وأصلح القسطرة بالأربطة المعدة ثم تبدأ في ضخ الكلى بمعدل تدفق مليلتر اثنين في الدقيقة. باستخدام مقص غرامة لقطع ثقب في الوريد الكلوي في الشرايين الكلوية وتضييق خياطة حول الشرايين الكبدية والميناتريانتي.بعد أن تم تسليم كامل حجم برنامج تلفزيوني استبدال perfusate مع خمسة ملليلتر من الجليد البارد PBS بالإضافة إلى الكالسيوم والمغنيسيوم تكملها 0.5 ملليغرام لكل ملليلتر البيوتين لوضع العلامات السطحية. الاستمرار في ضخ الكلى بمعدل تدفق ميليليمترين في الدقيقة. عندما تم تسليم وحدة التخزين بأكملها، نعلق حقنة تحتوي على خمسة ملليلترات من الجليد البارد برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى الكالسيوم والمغنيسيوم تكملها 100 ملليمولار جليسين إلى القسطرة.إخماد الكبيبات مع جميع المليلترات الخمسة من محلول الجليسين بمعدل تدفق مليلترين في الدقيقة. ثم اثقب الكلى بخمس ملليلترات من الثلج البارد PBS بالإضافة إلى الكالسيوم والمغنيسيوم المكملة مع 200 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي لكل ملليلتر بمعدل تدفق ملليلتر في الدقيقة. وسوف الانصمام من الكبيبات مع الخرز المغناطيسي البني تكون مرئية على سطح الكلى.عندما تم تسليم كل من الخرز إزالة كبسولة الكلى وحصاد الكلى في هيلوم. ضع الكلى في طبق ثقافة الخلايا 10 سم يحتوي على 15 ملليلتر من PBS بالإضافة إلى الكالسيوم والمغنيسيوم. استخدام شفرة جديدة مزدوجة الحواف لقطع الكلى إلى أصغر القطع الممكنة.نقل الأنسجة إلى أنبوب ملليلتر اثنين تحتوي على ملليلتر واحد من الكولاجيناز A لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية، وخلط حل الأنسجة بلطف قبل وبعد الهضم مع تعديل 1000 ميكروليت ماص تلميح. في نهاية الحضانة ، قم بفرز الأنسجة المهضمة من خلال مصفاة خلايا 100 ميكرون. استخدام مكشطة الخلية والجليد البارد PBS بالإضافة إلى الكالسيوم والمغنيسيوم لهرس الأنسجة المتبقية من خلال مصفاة الخلية.جلب الحجم النهائي من تعليق الخلايا الكلوية واحدة تصل إلى 50 ملليلتر مع الجليد الطازجة الباردة PBS بالإضافة إلى الكالسيوم والمغنيسيوم وجمع خلايا الكلى عن طريق الطرد المركزي. إزالة supernatant ثم إعادة تعليق بيليه مع أقل قليلا من 1.5 ملليلتر من الجليد البارد برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى الكالسيوم والمغنيسيوم في حين دوامة ونقل تعليق الكبيات في أنبوب جديد ملليلتر. لغسل الكبيبات، ضع الأنبوب في مغناطيس لتجميع الكبيات.بعد دقيقة واحدة، استخدم ماصة 1000 ميكرولتر لإزالة المابس. و أزيل الأنبوب من المغناطيس إضافة ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى الكالسيوم والمغنيسيوم إلى الأنسجة.الميّزة الكبيميرولي أعلى ولون مرة واحدة ودوامة الخلايا. عودة أنبوب إلى المغناطيس وغسل كبيبرولي مرة أخرى كما أظهرت للتو. حتى وصلت نقاء عينة ما لا يقل عن 90٪ عن طريق ضوء تحليل المجهر في 40 إلى 100 X التكبير.ثم جمع الخرز المغناطيسي تنقية glomeruli بواسطة الطرد المركزي. لتحقيق أكبر من نقاء 95٪، والكبيبيuli بحاجة إلى أن تغسل جيدا كما هو موضح. بيوتين perfusion يسهل وضع العلامات من الحلقات الشعرية في البيوتين ولكن لا تسيطر على الكلى الماوس perfused.هطول الأمطار المناعية من جزء البيوتين من مقتطفات الكبيبية يكشف أن البروتينات عبر الmembrane الكبيبية nephrin وpodocalyxin هي مناعية مع البيوتين ولكن ليس مع جزء السيطرة. تلوين من الكسر المناعي مع streptavidin يؤكد كذلك وجود البيوتين يثن nephrin في الحيوانات التي تم غرسها في البيوتين ولكن لا السيطرة على الحيوانات التي غرست. إن بروتين البطانية الوعائية الوعائية كادهيرين التصاق داخل الخلايا وجزيء التصاق داخل الخلايا اثنين أيضاً مناعية داخل جزء البيوتين.في المرحلة المبكرة من التهاب الكلية الكلى الكلي لوحظ انخفاض التعبير عن نيخر سطح الخلية في التهاب الكلية الكلوية مقارنة بالضوابط. في الواقع تحليل densitometic يظهر انخفاضا كبيرا من البيوتين اِثنت كلي في التهاب الكلية الكلى الكلى مقارنة مع وحدات التحكم. التحليل الكمي لمجموع نسبة الكلى إلى actin يكشف عن عدم وجود اختلافات كبيرة بين السيطرة وداء التهاب الكلية الكلى.بالإضافة إلى ذلك ، لوحظت كميات متساوية من podocytes في التهاب الكلية الكلوية والحيوانات التحكم. في أواخر التهاب الكلية الكلوية، تظهر الكلى السمية الكلية انتعاشاً في تعبير الكلى مع عدم وجود اختلافات كبيرة في كلية سطح الخلية مقاسة بين فئران الكلى التحكمية والسمية الكلوية الكلية والانخفاض الكلي الكلي في الكلى في الكلى. وعلاوة على ذلك، يتم تقليل أعداد podocyte بالمقارنة مع الحيوانات السيطرة.أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر للحفاظ على حقن فقاعة خالية أثناء اتصالها من أجل تجنب انسداد الهواء من الكبيبات والعمل في ظل ظروف البرد الجليد مرة واحدة بدأت ضخ الكلى. بعد هذا الإجراء يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل عزل رنا كبيبات الكريات والبروتين للإجابة على أسئلة إضافية حول تعبير البروتين أو التفاعلات في الكلى الصحية والمُرَضَة.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

تحديد البروتينات ملزمة جزيء صغير في الخلوي البيئة الأصلية التي تعيش خلية Photoaffinity وصفها

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

عزل بروتينات الشعيرة المتوسطة من أنسجة الفئران المتعددة لدراسة التعديلات المرتبطة بالشيخوخة بعد الترجمة

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

تنقية البروتينات السطحية للبروتينات الخلية من<em&gt; ريبيسفالوس ميكروبلوس</em&gt; الخلايا الظهارية الظهارية

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

والعزلة وقياسات الجهاز التنفسي من الميتوكوندريا من التمويل نبات

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

تحديد كمية البروتين على نطاق المنظومة وسم التجانس على مستوى جزيء واحد

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

يبحث إلى الخارج: عزل البوليمرات الكربوهيدرات السيانوبكتيرية المفرج عنها والبروتينات

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU

سريع للغاية ومحددة وضع العلامات الأيضية من الحمض النووي الريبي في فيفو مع 4-ثيوراسيل (Ers4tU)

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

توصيف البروتينات الخلوية مع الأكسدة الضوئية السريعة في الخلية من البروتينات

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

المقطع المستعرض من الأرز الناضج(Oryza sativa L.) حبات لمسح المجهر الإلكتروني التصوير باستخدام نصائح ماصة كدعم تعطيل

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

تحليل توليف الدهون المحايدة في Saccharomyces cerevisiae بواسطة وضع العلامات الأيضية وكروماتوغرافيا طبقة رقيقة

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...