Name: isolation of glomeruli and in vivo labeling of glomerular cell surface proteins
Uploaded: 2019-01-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins at JoVE.com

Les auteurs remercient Blanka Duvnjak pour son aide technique exceptionnel. Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de) WO1811/2-1 à M.W. et QU280/3-1 à Q.I. Le bailleur de fonds n’avait aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte de données, analyse des données, décision de publier et préparation du manuscrit.

Souris ont été obtenues comme une race interne de l’établissement de soins animaux locaux ou des laboratoires de Janvier en France. Les enquêtes ont été menées conformément aux lignes directrices énoncées dans le Guide pour soins et Use of Laboratory Animals (US National instituts de santé Publication n ° 85-23, révisée en 1996). Toutes les expériences animales ont été effectuées selon les autorisations institutionnelles pertinentes (gouvernement de l’état LANUV AZ:84 numéro de référence-02.04. ...

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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+Nephrotoxic+Nephritis+as+a+Model+of+Chronic+Kidney+Disease.">Murine Nephrotoxic Nephritis as a Model of Chronic Kidney Disease.</a> International Journal of Nephrology. 2018, 8424502 (2018).</li><li>Salant, D. J., Darby, C., Couser, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+membranous+glomerulonephritis+in+rats.+Quantitative+studies+of+glomerular+immune+deposit+formation+in+isolated+glomeruli+and+whole+animals.">Experimental membranous glomerulonephritis in rats. Quantitative studies of glomerular immune deposit formation in isolated glomeruli and whole animals.</a> Journal of Clinical Investigation. 66 (1), 71-81 (1980).</li></ol>

La méthode présentée permet la réussite de l’isolement des glomérules d’enquêter glomérulaire ARN ou protéine. En outre, les cultures primaires de cellules glomérulaires peuvent être effectuées depuis les glomérules isolés. Si biotine est appliqué avant l’isolement glomérulaire, marquage des protéines de surface de cellules glomérulaire peut être effectuée. Avec cette méthode, in vivo des cellules glomérulaires traite des protéine de surface peut être étudiée, et la détermination ...

Une protéinurie est une caractéristique des lésions glomérulaires et accompagne habituellement les perturbations du filtre glomérulaire1. Le filtre glomérulaire est composé de l’endothélium fenêtrée et membrane basale glomérulaire podocytes. La délicate structure moléculaire du filtre glomérulaire est très dynamique et soumise à la protéine de surface cellulaire traite les deux reins sains et malades,2,3,4,5,6 . Endocytose des protéines de surface cellulaire s’est avéré essentiel pour la survie des podocytes7. Néphrine et podocalyxin sont des protéines transmembranaires exprimées sur les podocytes. Néphrine est l’épine dorsale de la membrane glomérulaire fente, tandis que podocalyxin est une sialoglycoprotéine revêtements le pied secondaire des podocytes8,9,10. Trafic d’endocytose a déjà démontré pour néphrine et podocalyxin3,11,12,13,14.
Au meilleur de nos connaissances, l’endocytose des protéines de surface cellulaire n’a pas encore été décrite dans les cellules endothéliales glomérulaires dans la littérature. Cependant, les cellules endothéliales expriment en général toutes les protéines nécessaires pour les différents types d’endocytose (c.-à-d. l’endocytose clathrine dépendant, dépendante du radeau)15,16. Donc, le trafic de surface de cellules endothéliales peut être étudié avec cette méthode en utilisant, par exemple, vasculaire endothéliale (VE)-cadhérine et la molécule d’adhérence intracellulaire (ICAM-2) comme une cellule de surface protéine marqueur pour les cellules endothéliales glomérulaire17 .
Malheureusement, il n’y a aucun modèle précis in vitro pour le filtre glomérulaire trois couches délicat dans quelle cellule traite de la protéine de surface peut être étudiée. L’objectif de cette méthode est donc d’étudier protéine glomérulaire traite en vivo. En outre, ce protocole contient des informations sur la façon d’isoler les glomérules, permettant ainsi des analyses glomérulaire ARN, protéines ou cellules plus loin. Un isolement glomérulaire similaire techniques ont été décrites par différents groupes18,19.
Auparavant, nous et autres avons utilisé ex vivo marquage des protéines de surface de cellules glomérulaire par biotinylation2,3,4,20,21. Toutefois, cette méthode ex vivo , glomérules isolés ont été exposés à des contraintes mécaniques, qui peuvent influer sur le trafic endocytose. Alternativement, l’immunofluorescence marquage des protéines de surface de cellules glomérulaires a largement été utilisé dans la littérature2,20,22. Avec cette méthode, toutefois, seul un petit nombre de protéines peut être analysé dans une diapositive et analyse quantitative d’images d’immunofluorescence est souvent difficile.
Cette méthode novatrice en vivo propose un outil fiable pour étudier les cellules glomérulaires protéine de surface abondance et traite avec précision en sains et malades reins, et il peut être utilisé comme un ajout aux tests d’immunofluorescence.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:671px;" width="669">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Motic SMZ168 BL</td>
			<td style="width:77px;">Motic</td>
			<td style="width:101px;">SMZ168BL</td>
			<td style="width:235px;">microscope for mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:257px;">KL1500LCD</td>
			<td style="width:77px;">Pulch and Lorenz microscopy</td>
			<td style="width:101px;">150500</td>
			<td>light for mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Rompun (Xylazin) 2%</td>
			<td style="width:77px;">Bayer</td>
			<td>PZN:01320422</td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Microfederschere</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">FD100R</td>
			<td>fine scissors, for cut into the aorta</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Durotip Feine Scheren</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BC210R</td>
			<td>for abdominal cut</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Anatomische Pinzette</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BD215R</td>
			<td>for surgery until the abdomen is opened</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Pr&#228;parierklemme</td>
			<td style="width:77px;">Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BJ008R</td>
			<td>for surgery&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Seraflex</td>
			<td style="width:77px;">Serag Wiessner</td>
			<td style="width:101px;">IC108000</td>
			<td>silk thread</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Ketamine 10%</td>
			<td style="width:77px;">Medistar</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Rompun (Xylazin) 2%</td>
			<td style="width:77px;">Bayer</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm</td>
			<td style="width:77px;">Portex</td>
			<td style="width:101px;">800/100/100</td>
			<td style="width:235px;">Catheter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm</td>
			<td style="width:77px;">Portex</td>
			<td style="width:101px;">800/100/200</td>
			<td style="width:235px;">Catheter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Harvard apparatus 11 Plus</td>
			<td style="width:77px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:101px;">70-2209</td>
			<td>syringe pump</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin</td>
			<td style="width:77px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">21335</td>
			<td>biotin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Dynabeads Untouched Mouse T-cells</td>
			<td style="width:77px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">11413D</td>
			<td>to embolize glomeruli</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Collagenase A</td>
			<td style="width:77px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">10103578001</td>
			<td>to digest kidney tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">DynaMag-2</td>
			<td style="width:77px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">123.21D</td>
			<td>Magnet catcher</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">100&#181;m cell stainer</td>
			<td style="width:77px;">Greiner-bio</td>
			<td style="width:101px;">542000</td>
			<td>for glomerular isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Axiovert 40 CFL</td>
			<td style="width:77px;">Zeiss</td>
			<td style="width:101px;">non available</td>
			<td>to confirm glomerular purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">TissueRuptor</td>
			<td style="width:77px;">Quiagen</td>
			<td style="width:101px;">9002755</td>
			<td>Tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">CHAPS</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">C3023</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Tris-HCL</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T5941</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">NaCl</td>
			<td style="width:77px;">VWR chemicals</td>
			<td style="width:101px;">27810295</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">NaF</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">201154</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">EDTA</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">E5134</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">ATP</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">34369-07-8</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:77px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">23225</td>
			<td>Follow the manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">nephrin antibody</td>
			<td style="width:77px;">Progen</td>
			<td style="width:101px;">GP-N2</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Polyclonal goat anti-podocalyxin antibody</td>
			<td style="width:77px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:101px;">AF15556-SP</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Streptavidin Agarose Resin</td>
			<td style="width:77px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">20347</td>
			<td>for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:257px;">Protein A sepharose CL-4B</td>
			<td style="width:77px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:101px;">17096303</td>
			<td>for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">polyclonal rabbit anti-p57 antibody</td>
			<td style="width:77px;">SCBT</td>
			<td style="width:101px;">sc-8298</td>
			<td>for Immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">mouse monoclonal anti-beta actin antibody, clone AC-74</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">A2228</td>
			<td>Western blot loading control</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">rabbit anti-p44/42</td>
			<td style="width:77px;">cell signalling</td>
			<td style="width:101px;">4695</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Pierce High sensitivity streptavidin-HRP</td>
			<td style="width:77px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">21130</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">polyclonal mouse ICAM-2 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF774</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">polyclonal mouse anti-VE-cadherin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF1002</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of glomeruli and in vivo labeling of glomerular cell surface proteins

Protéinurie résulte de la rupture du filtre glomérulaire qui est composé de l’endothélium fenêtrée, membrane basale glomérulaire et podocytes avec leurs membranes de fente. La structure délicate du filtre glomérulaire, en particulier le diaphragme de fente, s’appuie sur l’interaction entre les protéines de surface de diverses cellules. Étudier ces protéines de surface de cellules a été jusqu'à présent limitée à des études in vitro ou l’analyse histologique. Nous présentons ici une biotinylation murine en vivo étiquetage méthode, ce qui permet l’étude des protéines de surface de cellules glomérulaire dans des conditions physiologiques et physiopathologiques. Ce protocole contient des informations sur la façon de perfuse les reins de souris, isoler les glomérules et effectuer d’immunoprécipitation endogène d’une protéine d’intérêt. La détermination semi-quantitative de l’abondance de surface cellulaire glomérulaire est disponible avec cette nouvelle méthode et toutes les protéines accessibles à la perfusion de biotine et immunoprécipitation peut être étudiée. En outre, isolement des glomérules avec ou sans biotinylation permet davantage l’analyse de RNA glomérulaire et protéines, mais aussi la culture primaire de cellules glomérulaire (c.-à-d., culture de cellules primaires podocyte).

Pour isoler des glomérules avec précision, il est nécessaire de perfuse reins murins avec PBSCM tout d’abord. Une perfusion de PBSCM tourne reins pâles (Figure 1A). Embolisation des glomérules avec billes magnétiques seront visible comme des points bruns sur la surface du rein (Figure 1B). Isolement des glomérules avec le récupérateur de l’aimant peut montrer la contamination avec de...

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Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolement des glomérules et In Vivo , marquage des protéines de Surface de cellules glomérulaire

Nous présentons ici un protocole pour l’étiquetage des murins in vivo des protéines de surface de cellules glomérulaire avec de la biotine. Ce protocole contient des informations sur la façon de perfuse les reins de souris, isoler les glomérules et effectuer d’immunoprécipitation endogène de la protéine d’intérêt.

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de la néphrologie sur le rôle du trafic de protéines de surface cellulaire dans les maladies rénales protéiques et non protéinées. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle facilite l’étude du trafic de protéines de surface cellulaire in vivo et que plus d’une protéine peut être analysée par expérience. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu du trafic de surface des cellules glomerular, peut également être appliquée à d’autres systèmes d’organes qui sont perfusés et sont accessibles par des techniques d’isolement.Commencez par confirmer un manque de réponse au pincement des pieds et désinfecter le côté ventral de la souris anesthésiée avec 70% d’isopropyl. Faire une coupe médiane à travers la peau du bassin au sternum et utiliser des pinces à épiler pour enlever la peau du fascia abdominal. Couper la peau des deux côtés de la ligne médiane abdominale et faire un milieu à travers la couche musculaire abdominale de la vessie au xiphoïde.Utilisez les ciseaux et les forceps pour diviser les muscles en quatre quadrants et utilisez deux pinces chirurgicales pour fixer les deux quadrants supérieurs vers le cou des animaux. Placez l’animal sous un microscope disséquant et utilisez un échange stérile pour déplacer de côté les organes viscérals. À l’aide de ciseaux fins, couper le ligament phrénique hépatique.À l’aide de pinces chirurgicales fines, placez une suture autour de l’artère mésentérique hépatique branial des artères rénales. Et autour de l’aorte, proximale aux artères rénales, à la glande surrénale. Libérez l’aorte distale du fascia, de la graisse et d’autres tissus.Puis, pincez la vena cava et l’aorte à la hauteur de la bifurcation et placez une autre suture autour de l’aorte distal des artères rénales. Utilisez des pincettes pour resserrer la suture aortique proximale, atténuant le flux sanguin et couper un petit trou la moitié du diamètre de l’aorte dans l’aorte, distal aux artères rénales. Insérez un cathéter de 10 centimètres attaché à une seringue de 10 millilitres contenant cinq millilitres de PBS glacé plus calcium et magnésium dans l’aorte.Et fixer le cathéter avec les ligatures préparées. Commencez ensuite à perfuser les reins à un débit de deux millilitres par minute. À l’aide de ciseaux fins pour couper un trou dans la veine rénale des artères rénales et resserrer la suture autour des artères hépatique et mésentérique.Après que le volume entier de PBS ait été livré remplace le perfusate par cinq millilitres de PBS froid de glace plus le calcium et le magnésium complétés avec 0.5 milligrammes par biotine millilitres pour l’étiquetage de surface. Continuer à parcourir les reins à un débit de deux millilitres par minute. Lorsque tout le volume a été livré, fixez une seringue contenant cinq millilitres de PBS glacé ainsi que du calcium et du magnésium complétés par de la glycine de 100 millimlaires au cathéter.Étanchez le glomeruli avec les cinq millilitres de la solution glycine à un débit de deux millilitres par minute. Puis parcourir les reins avec cinq millilitres de PBS glacé plus le calcium et le magnésium complété par 200 microlitres de perles magnétiques par millilitre à un débit de deux millilitres par minute. L’embolisation du glomeruli avec les perles magnétiques brunes sera visible sur la surface rénale.Lorsque toutes les perles ont été livrées enlever la capsule des reins et de récolter les reins à l’hilum. Placez les reins dans un plat de culture cellulaire de 10 centimètres contenant 15 millilitres de PBS plus calcium et magnésium. Utilisez une nouvelle lame à double tranchant pour couper les reins en plus petits morceaux possibles.Transférer le tissu dans un tube de deux millilitres contenant un millilitre de collagène A pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius, en mélangeant la solution tissulaire doucement avant et après la digestion avec une pointe de pipette modifiée de 1000 microlitres. À la fin de l’incubation, filtrer le tissu digéré à travers une passoire cellulaire de 100 microns. Utilisez un grattoir cellulaire et un PBS glacé, ainsi que du calcium et du magnésium pour écraser le reste du tissu à travers la passoire cellulaire.Apportez le volume final de la suspension d’une seule cellule rénale jusqu’à 50 millilitres avec pbs froid glacé frais plus calcium et magnésium et recueillir les cellules rénales par centrifugation. Retirez le supernatant puis suspendez la pastille avec un peu moins de 1,5 millilitres de PBS glacé plus calcium et magnésium tout en vortexant et transférez la suspension glomerular dans un nouveau tube de deux millilitres. Pour laver le glomeruli, placez le tube dans un aimant pour agréger le glomeruli.Après une minute, utilisez une pipette de 1000 microlitres pour enlever le supernatant. Et retirez le tube de l’aimant. Ajouter un millilitre de PBS plus le calcium et le magnésium aux tissus.Pipette le glomeruli de haut en bas une fois et vortex les cellules. Remettre le tube à l’aimant et laver le glomeruli à nouveau comme il vient de le démontrer. Jusqu’à ce qu’une pureté de l’échantillon ait atteint au moins 90 % par analyse au microscope léger à un grossissement de 40 à 100 X.Puis recueillir la perle magnétique purifié glomeruli par centrifugation. Pour atteindre une pureté supérieure à 95%, le glomeruli devait être lavé à fond comme démontré. La perfusion de biotine facilite l’étiquetage des boucles capillaires dans les reins de souris perfusés biotine mais non contrôlés.Les précipitations immunitaires de la fraction de biotine des extraits glomériques révèlent que les protéines transmembranes glomerular néphrin et podocalyxin sont immunoprécipitées avec la biotine mais pas avec la fraction de contrôle. La coloration de la fraction immunoprécipitée avec la streptavidine confirme davantage la présence de néphrine laded de biotine dans les animaux perfusés de biotine mais pas de contrôle perfusé. La cadhérine endothéliale vasculaire de protéine endothéliale et la molécule intracellulaire d’adhérence deux sont également immunopréciées dans la fraction de biotine.Dans la phase précoce de néphrite néphrotoxique, une expression réduite de la néphrine de surface cellulaire est observée chez les animaux néphrite néphrotoxiques par rapport aux témoins. En effet, l’analyse densitometic montre une réduction significative de la néphrine laded de biotine chez les animaux néphrite néphrotoxiques comparés aux contrôleurs. L’analyse quantitative du rapport néphrine-actine total ne révèle aucune différence significative entre les souris témoins et néphrites néphrotoxiques.En outre, des quantités égales de podocytes sont observées chez les néphrites néphrotoxiques et les animaux témoins. Dans la néphrite néphrotoxique tardive, les animaux néphritiques néphrotoxiques présentent une récupération de l’expression néphrin sans différences significatives dans la néphrine de surface cellulaire mesurée entre les souris nephritiques de contrôle et néphrotoxiques et une réduction totale globale de néphrine chez les animaux néphritiques néphrotoxiques. De plus, le nombre de podocytes diminue par rapport aux animaux de contrôle.Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de garder les seringues bulle libre pendant leur connexion afin d’éviter l’embolie de l’air du glomeruli et de travailler dans des conditions glacées une fois la perfusion rénale a commencé. Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme l’isolement de l’ARN glomeruli et des protéines peuvent être effectuées pour répondre à d’autres questions sur l’expression des protéines ou les interactions dans les reins sains et maladies.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identification des protéines de petites molécules de liaison dans un Natif cellulaire Environnement par des cellules vivantes photoaffinité Étiquetage

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Recherche

Biochimie

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Isolation des protéines de filament intermédiaires à partir de tissus de souris multiples pour étudier les modifications post-traductionnelles associées au vieillissement

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification des protéines de surface cellulaire biotinylées de<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Cellules intestinales épithéliales

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolement et mesures respiratoire des mitochondries d’Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Échelle du protéome Quantification d’homogénéité à l’échelle de la molécule unique d’étiquetage

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

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Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU

Étiquetage métabolique extrêmement rapide et spécifique de l'ARN In Vivo avec 4-Thiouracil (Ers4tU)

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Caractériser les protéines cellulaires avec l’oxydation photochimique rapide à cellule des protéines

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Sectionnement transversal du riz mature (Oryza sativa L.) Noyaux pour l’imagerie par microscopie électronique à balayage à l’aide d’embouts de pipette comme support d’immobilisation

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analyse de la synthèse lipidique neutre chez Saccharomyces cerevisiae par marquage métabolique et chromatographie sur couche mince

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...