Name: isolation of glomeruli and in vivo labeling of glomerular cell surface proteins
Uploaded: 2019-01-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins at JoVE.com

Die Autoren danken Blanka Duvnjak für ihre außergewöhnliche technische Hilfe. Diese Arbeit wurde gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de) WO1811/2-1, M.W. und QU280/3-1, IQ Die Geldgeber hatten keine Rolle im Studiendesign, Datenerhebung, Datenanalyse, Entscheidung, zu veröffentlichen und der Manuskripterstellung.

Mäuse wurden als eigene Rasse von der lokalen Tierpflege-Anlage oder von Janvier Labs in Frankreich erhalten. Die Untersuchungen wurden nach den Richtlinien beschrieben in der Anleitung zur Pflege und Verwendung von Labortieren (US nationale Institute der Gesundheit-Veröffentlichung Nr. 85-23, revidiert 1996) durchgeführt. Alle Tierversuche wurden durchgeführt in Übereinstimmung mit den relevanten institutionellen Zulassungen (Landesregierung LANUV Referenz Nummer AZ:84-02.04. 2016.A435).
1...

<ol>
	<li>Jefferson, J. A., Alpers, C. E., Shankland, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocyte+biology+for+the+bedside.">Podocyte biology for the bedside.</a> American Journal of Kidney Disease. 58 (5), 835-845 (2011).</li><li>Konigshausen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+increases+glomerular+permeability+by+beta-arrestin+mediated+nephrin+endocytosis.">Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis.</a> Scientific Reports. 6, 39513 (2016).</li><li>Quack, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Arrestin2+mediates+nephrin+endocytosis+and+impairs+slit+diaphragm+integrity.">beta-Arrestin2 mediates nephrin endocytosis and impairs slit diaphragm integrity.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (38), 14110-14115 (2006).</li><li>Quack, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKC+alpha+mediates+beta-arrestin2-dependent+nephrin+endocytosis+in+hyperglycemia.">PKC alpha mediates beta-arrestin2-dependent nephrin endocytosis in hyperglycemia.</a> Journal of Biological Chemitry. 286 (15), 12959-12970 (2011).</li><li>Swiatecka-Urban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+Trafficking+at+the+Mature+Podocyte+Slit+Diaphragm.">Endocytic Trafficking at the Mature Podocyte Slit Diaphragm.</a> Frontiers in Pediatrics. 5, 32 (2017).</li><li>Swiatecka-Urban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+trafficking+in+podocyte+health+and+disease.">Membrane trafficking in podocyte health and disease.</a> Pediatric Nephrology. 28 (9), 1723-1737 (2013).</li><li>Soda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+dynamin,+synaptojanin,+and+endophilin+in+podocyte+foot+processes.">Role of dynamin, synaptojanin, and endophilin in podocyte foot processes.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4401-4411 (2012).</li><li>Kestila, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positionally+cloned+gene+for+a+novel+glomerular+protein--nephrin--is+mutated+in+congenital+nephrotic+syndrome.">Positionally cloned gene for a novel glomerular protein--nephrin--is mutated in congenital nephrotic syndrome.</a> Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).</li><li>Martin, C. E., Jones, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephrin+Signaling+in+the+Podocyte:+An+Updated+View+of+Signal+Regulation+at+the+Slit+Diaphragm+and+Beyond.">Nephrin Signaling in the Podocyte: An Updated View of Signal Regulation at the Slit Diaphragm and Beyond.</a> Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 9, 302 (2018).</li><li>Nielsen, J. S., McNagny, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+podocalyxin+in+health+and+disease.">The role of podocalyxin in health and disease.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (8), 1669-1676 (2009).</li><li>Yasuda, T., Saegusa, C., Kamakura, S., Sumimoto, H., Fukuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab27+effector+Slp2-a+transports+the+apical+signaling+molecule+podocalyxin+to+the+apical+surface+of+MDCK+II+cells+and+regulates+claudin-2+expression.">Rab27 effector Slp2-a transports the apical signaling molecule podocalyxin to the apical surface of MDCK II cells and regulates claudin-2 expression.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3229-3239 (2012).</li><li>Tossidou, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocytic+PKC-alpha+is+regulated+in+murine+and+human+diabetes+and+mediates+nephrin+endocytosis.">Podocytic PKC-alpha is regulated in murine and human diabetes and mediates nephrin endocytosis.</a> Public Library of Science One. 5 (4), 10185 (2010).</li><li>Qin, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+nephrin+triggers+its+internalization+by+raft-mediated+endocytosis.">Phosphorylation of nephrin triggers its internalization by raft-mediated endocytosis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (12), 2534-2545 (2009).</li><li>Waters, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+promotes+dynamin-dependent+endocytosis+of+nephrin.">Notch promotes dynamin-dependent endocytosis of nephrin.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (1), 27-35 (2012).</li><li>Zhang, X., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+tyrosine+kinases+endocytosis+in+endothelium:+biology+and+signaling.">Receptor tyrosine kinases endocytosis in endothelium: biology and signaling.</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 34 (9), 1831-1837 (2014).</li><li>Maes, H., Olmeda, D., Soengas, M. S., Agostinis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+trafficking+mechanisms+in+endothelial+cells+as+modulators+of+the+tumor+vasculature+and+targets+of+antiangiogenic+therapies.">Vesicular trafficking mechanisms in endothelial cells as modulators of the tumor vasculature and targets of antiangiogenic therapies.</a> Federation of European Biochemical Societies Journal. 283 (1), 25-38 (2016).</li><li>Satchell, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+immortalized+human+glomerular+endothelial+cells+expressing+fenestrations+in+response+to+VEGF.">Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF.</a> Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).</li><li>Takemoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+large+scale+isolation+of+kidney+glomeruli+from+mice.">A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice.</a> American Journal of Pathology. 161 (3), 799-805 (2002).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+glomeruli+from+mice:+A+practical+approach+for+beginners.">Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners.</a> Experimental and Therapeutic Medicine. 5 (5), 1322-1326 (2013).</li><li>Haase, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vivo+method+to+quantify+slit+diaphragm+protein+abundance+in+murine+proteinuric+kidney+disease.">A novel in vivo method to quantify slit diaphragm protein abundance in murine proteinuric kidney disease.</a> Public Library of Science One. 12 (6), 0179217 (2017).</li><li>Satoh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=aPKClambda+maintains+the+integrity+of+the+glomerular+slit+diaphragm+through+trafficking+of+nephrin+to+the+cell+surface.">aPKClambda maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface.</a> Journal of Biochemistry. 156 (2), 115-128 (2014).</li><li>Tomas, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombospondin+type-1+domain-containing+7A+in+idiopathic+membranous+nephropathy.">Thrombospondin type-1 domain-containing 7A in idiopathic membranous nephropathy.</a> New England Journal of Medicine. 371 (24), 2277-2287 (2014).</li><li>Daniels, G. M., Amara, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+labeling+of+neurotransmitter+transporters+at+the+cell+surface.">Selective labeling of neurotransmitter transporters at the cell surface.</a> Methods in Enzymology. 296, 307-318 (1998).</li><li>Ougaard, M. K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+Nephrotoxic+Nephritis+as+a+Model+of+Chronic+Kidney+Disease.">Murine Nephrotoxic Nephritis as a Model of Chronic Kidney Disease.</a> International Journal of Nephrology. 2018, 8424502 (2018).</li><li>Salant, D. J., Darby, C., Couser, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+membranous+glomerulonephritis+in+rats.+Quantitative+studies+of+glomerular+immune+deposit+formation+in+isolated+glomeruli+and+whole+animals.">Experimental membranous glomerulonephritis in rats. Quantitative studies of glomerular immune deposit formation in isolated glomeruli and whole animals.</a> Journal of Clinical Investigation. 66 (1), 71-81 (1980).</li></ol>

Die vorgestellte Methode ermöglicht erfolgreiche Isolierung der Glomeruli glomerulären RNS oder Protein zu untersuchen. Darüber hinaus können primäre glomeruläre Zellkulturen aus isolierten Glomeruli durchgeführt werden. Biotin vor glomerulären Isolierung angewendet wird, kann der glomerulären Zelle Oberflächenproteine Kennzeichnung durchgeführt werden. Mit dieser Methode in Vivo glomerulären Zelle Oberfläche Protein des Menschenhandels kann untersucht werden, und semi-Quantifizierung der Protein F?...

Proteinurie ist ein Markenzeichen der glomerulären Verletzungen und Störungen der glomerulären Filter1in der Regel begleitet. Der glomeruläre Filter besteht aus den gefensterten Endothels glomerulären Basalmembran und Podocytes. Die zarte molekulare Struktur des glomerulären Filters ist sehr dynamisch und je nach Zelle Oberfläche Protein Menschenhandel sowohl gesunden und kranken Nieren2,3,4,5,6 . Endozytose Zelle Oberflächenproteine nachweislich essentiell für das Überleben der Podocytes7. Nephrin und Podocalyxin sind transmembrane Proteine auf Podocytes. Nephrin ist das Rückgrat der glomerulären Schlitz Membran, während Podocalyxin eine Beschichtung die sekundäre Fuß Prozesse der Podocytes8,9,10Sialoglycoprotein. Endocytic Handel wurde zuvor für Nephrin und Podocalyxin3,11,12,13,14gezeigt.
Nach bestem Wissen und gewissen wurde Endozytose Zelle Oberflächenproteine nicht noch in glomerulären Endothelzellen in der Literatur beschrieben. Allerdings äußern Endothelzellen im Allgemeinen alle notwendigen Proteine für die verschiedenen Arten von Endozytose (d. h. Clathrin-abhängige, Floß-abhängige Endozytose)15,16. Daher kann Endothelzellen Oberfläche Handel mit dieser Methode verwenden, z. B. vaskulären endothelialen (VE) untersucht werden-Cadherin und intrazellulären Adhäsionsmolekül (ICAM-2) als Zelle Oberfläche Marker Protein für glomeruläre Endothelzellen17 .
Leider gibt es keine genaue in Vitro -Modell für zarte dreischichtigen glomerulären Filters in welche Zelle Oberfläche Protein Menschenhandel studiert werden kann. Das Ziel dieser Methode ist somit glomerulären Protein des Drogenhandels in Vivozu studieren. Dieses Protokoll enthält darüber hinaus Informationen zum Glomeruli, wodurch weitere Analyse der glomerulären RNA, Proteinen und Zellen zu isolieren. Ähnliche glomerulären Isolation beschrieb Techniken von verschiedenen Gruppen18,19.
Wir und andere haben früher, ex Vivo Kennzeichnung der glomerulären Zelle Oberflächenproteine von Biotinylierungen2,3,4,20,21. Jedoch wurden in diese ex-Vivo -Methode isoliert Glomeruli mechanischen Belastung ausgesetzt, die endocytic Handel beeinflussen können. Alternativ ist die Immunfluoreszenz Kennzeichnung der glomerulären Zelle Oberflächenproteine beträchtlich in der Literatur2,20,22benutzt worden. Mit dieser Methode jedoch nur eine kleine Anzahl von Proteinen innerhalb einer Folie analysiert werden kann, und Quantifizierung von Immunfluoreszenz Bildern ist oft schwierig.
Diese neuartige in-Vivo -Methode bietet ein zuverlässiges Werkzeug um glomerulären Zelle Oberfläche Protein Fülle und Menschenhandel genau in gesunden und kranken Nieren zu untersuchen, und es kann als Ergänzung zum Immunofluoreszenz Tests verwendet werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:671px;" width="669">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Motic SMZ168 BL</td>
			<td style="width:77px;">Motic</td>
			<td style="width:101px;">SMZ168BL</td>
			<td style="width:235px;">microscope for mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:257px;">KL1500LCD</td>
			<td style="width:77px;">Pulch and Lorenz microscopy</td>
			<td style="width:101px;">150500</td>
			<td>light for mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Rompun (Xylazin) 2%</td>
			<td style="width:77px;">Bayer</td>
			<td>PZN:01320422</td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Microfederschere</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">FD100R</td>
			<td>fine scissors, for cut into the aorta</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Durotip Feine Scheren</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BC210R</td>
			<td>for abdominal cut</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Anatomische Pinzette</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BD215R</td>
			<td>for surgery until the abdomen is opened</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Pr&#228;parierklemme</td>
			<td style="width:77px;">Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BJ008R</td>
			<td>for surgery&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Seraflex</td>
			<td style="width:77px;">Serag Wiessner</td>
			<td style="width:101px;">IC108000</td>
			<td>silk thread</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Ketamine 10%</td>
			<td style="width:77px;">Medistar</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Rompun (Xylazin) 2%</td>
			<td style="width:77px;">Bayer</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm</td>
			<td style="width:77px;">Portex</td>
			<td style="width:101px;">800/100/100</td>
			<td style="width:235px;">Catheter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm</td>
			<td style="width:77px;">Portex</td>
			<td style="width:101px;">800/100/200</td>
			<td style="width:235px;">Catheter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Harvard apparatus 11 Plus</td>
			<td style="width:77px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:101px;">70-2209</td>
			<td>syringe pump</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin</td>
			<td style="width:77px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">21335</td>
			<td>biotin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Dynabeads Untouched Mouse T-cells</td>
			<td style="width:77px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">11413D</td>
			<td>to embolize glomeruli</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Collagenase A</td>
			<td style="width:77px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">10103578001</td>
			<td>to digest kidney tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">DynaMag-2</td>
			<td style="width:77px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">123.21D</td>
			<td>Magnet catcher</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">100&#181;m cell stainer</td>
			<td style="width:77px;">Greiner-bio</td>
			<td style="width:101px;">542000</td>
			<td>for glomerular isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Axiovert 40 CFL</td>
			<td style="width:77px;">Zeiss</td>
			<td style="width:101px;">non available</td>
			<td>to confirm glomerular purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">TissueRuptor</td>
			<td style="width:77px;">Quiagen</td>
			<td style="width:101px;">9002755</td>
			<td>Tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">CHAPS</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">C3023</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Tris-HCL</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T5941</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">NaCl</td>
			<td style="width:77px;">VWR chemicals</td>
			<td style="width:101px;">27810295</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">NaF</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">201154</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">EDTA</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">E5134</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">ATP</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">34369-07-8</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:77px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">23225</td>
			<td>Follow the manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">nephrin antibody</td>
			<td style="width:77px;">Progen</td>
			<td style="width:101px;">GP-N2</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Polyclonal goat anti-podocalyxin antibody</td>
			<td style="width:77px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:101px;">AF15556-SP</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Streptavidin Agarose Resin</td>
			<td style="width:77px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">20347</td>
			<td>for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:257px;">Protein A sepharose CL-4B</td>
			<td style="width:77px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:101px;">17096303</td>
			<td>for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">polyclonal rabbit anti-p57 antibody</td>
			<td style="width:77px;">SCBT</td>
			<td style="width:101px;">sc-8298</td>
			<td>for Immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">mouse monoclonal anti-beta actin antibody, clone AC-74</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">A2228</td>
			<td>Western blot loading control</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">rabbit anti-p44/42</td>
			<td style="width:77px;">cell signalling</td>
			<td style="width:101px;">4695</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Pierce High sensitivity streptavidin-HRP</td>
			<td style="width:77px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">21130</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">polyclonal mouse ICAM-2 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF774</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">polyclonal mouse anti-VE-cadherin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF1002</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of glomeruli and in vivo labeling of glomerular cell surface proteins

Proteinurie ergibt sich aus der Störung des glomerulären Filters, der die gefensterten Endothels, glomeruläre Basalmembran und Podocytes mit ihren Schlitz Membranen zusammensetzt. Die zarte Struktur des glomerulären Filters, vor allem die Schlitz-Membran, stützt sich auf das Zusammenspiel der verschiedenen Zelle Oberflächenproteine. Studieren diese Zelle Oberflächenproteine wurde bisher zur in-vitro- Studien oder histologische Analyse beschränkt. Hier präsentieren wir Ihnen einen murinen in Vivo Biotinylierungen Kennzeichnung Methode, die die Untersuchung der glomerulären Zelle Oberflächenproteine physiologische und pathophysiologische Bedingungen ermöglicht. Dieses Protokoll enthält Informationen zur Maus Nieren durchspülen, Glomeruli zu isolieren und endogenen Immunopräzipitation eines Proteins des Interesses durchführen. Semi-Quantifizierung der glomerulären Zelle Oberfläche Fülle ist leicht zugänglich mit dieser neuartigen Methode und alle Proteine für Biotin Perfusion zugänglich und Immunopräzipitation kann untersucht werden. Isolierung der Glomeruli mit oder ohne Biotinylierungen ermöglicht darüber hinaus weitere Analyse der glomerulären RNA und Protein sowie primäre glomeruläre Zellkultur (z. B. primäre hemolytic Zellkultur).

Um die Glomeruli präzise zu isolieren, ist es notwendig, murine Nieren mit PBSCM ersten durchspülen. Perfusion mit PBSCM dreht Nieren blass (Abb. 1A). Embolisation der Glomeruli mit magnetischen Beads wird als braune Punkte auf der Oberfläche der Niere (Abbildung 1B) angezeigt. Isolierung der Glomeruli mit Magnet-Catcher kann Verunreinigungen mit renalen Tubuli (Abbildung ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins at JoVE.com

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolierung der Glomeruli und In Vivo Kennzeichnung der glomerulären Zelle Oberflächenproteine

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Kennzeichnung der glomerulären Zelle Oberflächenproteine mit Biotin murinen in Vivo . Dieses Protokoll enthält Informationen zur Maus Nieren durchspülen, Glomeruli zu isolieren und endogenen Immunopräzipitation des Proteins des Interesses durchführen.

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Nephrologie über die Rolle des Zelloberflächenproteinhandels bei Proteinurnen und nicht bei proteinurc Nierenerkrankungen zu beantworten. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie die Untersuchung des Zelloberflächen-Proteinhandels in-vivo erleichtert und dass mehr als ein Protein pro Experiment analysiert werden kann. Obwohl diese Methode Einen Einblick in den handel mit glomerulären Zelloberflächen bieten kann, kann sie auch auf andere Organsysteme angewendet werden, die durchsetzt sind und durch Isolationstechniken zugänglich sind.Beginnen Sie mit der Bestätigung eines Mangels an Reaktion auf Zehenkneifen und desinfizieren die ventrale Seite der anästhesierten Maus mit 70%isopropyl. Machen Sie einen Median schnitt durch die Haut vom Becken bis zum Brustbein und verwenden Sie eine Pinzette, um die Haut von der Bauchfaszie zu entfernen. Schneiden Sie die Haut auf beiden Seiten der Bauchmittellinie und machen Sie ein Medium durch die Bauchmuskelschicht von der Blase bis zum Xiphoid.Verwenden Sie die Schere und Zange, um die Muskeln in vier Quadranten zu teilen Und verwenden Sie zwei chirurgische Klemmen, um die oberen beiden Quadranten in Richtung des Halses der Tiere zu sichern. Legen Sie das Tier unter ein Sezieren des Mikroskops und verwenden Sie einen sterilen Swap, um die viszeralen Organe beiseite zu bewegen. Schneiden Sie mit einer feinen Schere das hepatische Phrenische Band.Mit feiner chirurgischer Pinzette, legen Sie eine Naht um die hepatische mesenterische Arterie kleial der Nierenarterien. Und um die Aorta, proximal zu den Nierenarterien, an der Nebenniere. Befreien Sie die distale Aorta von der Faszien, Fett und anderem Gewebe.Dann klemmen Sie die Vena cava und die Aorta auf der Höhe der Bifurkation und legen Sie eine weitere Naht um die Aorta distal der Nierenarterien. Verwenden Sie eine Pinzette, um die proximale Aortennaht zu straffen, den Blutfluss zu dämpfen und ein kleines Loch die Hälfte des Durchmessers der Aorta in die Aorta zu schneiden, distal zu den Nierenarterien. Legen Sie einen 10-Zentimeter-Katheter, der an einer 10-Milliliter-Spritze befestigt ist, die fünf Milliliter eiskalte SEiskalteS PBS plus Kalzium und Magnesium enthält, in die Aorta ein.Und fixieren Sie den Katheter mit den vorbereiteten Ligaturen. Dann beginnen Sie, die Nieren mit einem Durchfluss von zwei Millilitern pro Minute zu durchdringen. Mit einer feinen Schere, um ein Loch in die Nierenvene an den Nierenarterien zu schneiden und die Naht um die Leber- und Mesenterarterien zu straffen.Nach der Lieferung des gesamten PBS-Volumens ersetzen Sie die Perfusate durch fünf Milliliter eiskalte Seiskaltes PBS plus Kalzium und Magnesium, ergänzt mit 0,5 Milligramm pro Milliliter Biotin zur Oberflächenkennzeichnung. Fahren Sie fort, die Nieren mit einem Durchfluss von zwei Millilitern pro Minute zu durchdringen. Wenn das gesamte Volumen geliefert wurde, befestigen Sie eine Spritze mit fünf Millilitern eiskaltem PBS plus Kalzium und Magnesium, ergänzt mit 100 Millimolarglycin, an den Katheter.Die Glomeruli mit allen fünf Millilitern der Glycinlösung bei einem Durchfluss von zwei Millilitern pro Minute ablöschen. Dann durchdringen Sie die Nieren mit fünf Millilitereisis PBS plus Kalzium und Magnesium, ergänzt mit 200 Mikrolitermagnetperlen pro Milliliter bei einem Durchfluss von zwei Millilitern pro Minute. Die Embolie der Glomeruli mit den braunen Magnetperlen wird auf der Nierenoberfläche sichtbar sein.Wenn alle Perlen geliefert wurden, entfernen Sie die Kapsel der Nieren und ernten Sie die Nieren am Hilum. Legen Sie die Nieren in eine 10-Zentimeter-Zellkulturschale mit 15 Milliliter PBS plus Kalzium und Magnesium. Verwenden Sie eine neue doppelschneidende Klinge, um die Nieren in die kleinsten Stücke zu schneiden.Übertragen Sie das Gewebe in ein Zwei-Milliliter-Rohr mit einem Milliliter Kollagenase A für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius, mischen Sie die Gewebelösung sanft vor und nach der Verdauung mit einer modifizierten 1000 Mikroliter Pipettenspitze. Filtern Sie am Ende der Inkubation das verdaute Gewebe durch ein 100-Mikron-Zellsieb. Verwenden Sie einen Zellschaber und eiskalte PBS plus Kalzium und Magnesium, um das restliche Gewebe durch das Zellsieb zu zermahlen.Bringen Sie das Endvolumen der Niereneinzelzellsuspension bis zu 50 Milliliter mit frischer eiskalter PBS plus Kalzium und Magnesium und sammeln Sie die Nierenzellen durch Zentrifugation. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet mit etwas weniger als 1,5 Millilitereis pbS plus Kalzium und Magnesium während des Wirbelns wieder auf und übertragen Sie die glomeruläre Suspension in ein neues Zwei-Milliliter-Rohr. Um die Glomeruli zu waschen, legen Sie die Röhre in einen Magneten, um die Glomeruli zu aggregieren.Nach einer Minute verwenden Sie eine 1000-Mikroliter-Pipette, um den Überstand zu entfernen. Und entfernen Sie das Rohr vom Magneten. Fügen Sie dem Gewebe einen Milliliter PBS plus Kalzium und Magnesium hinzu.Pipette die Glomeruli auf und ab einmal und Wirbel die Zellen. Das Rohr zum Magneten zurückgeben und die Glomeruli wieder waschen, wie gerade gezeigt. Bis eine Probenreinheit durch Lichtmikroskopanalyse bei einer Vergrößerung von 40 bis 100 X mindestens 90% erreicht hat.Dann sammeln Sie die magnetische Perle gereinigt glomeruli durch Zentrifugation. Um eine Reinheit von mehr als 95 % zu erreichen, mussten die Glomeruli gründlich gewaschen werden, wie gezeigt. Biotinperfusion erleichtert die Kennzeichnung der Kapillarschlaufen in Biotin, aber nicht kontrolliertperfundiertemausiperierten Mausnieren.Die Immunfällung der Biotinfraktion glomerulärer Extrakte zeigt, dass die glomerulären Transmembranproteine Nephrin und Podocalyxin mit dem Biotin immunpräzipiert werden, jedoch nicht mit der Kontrollfraktion. Die Färbung der immunpräzipitierten Fraktion mit Streptavidin bestätigt ferner das Vorhandensein von Biotin-laded Nephrin in den biotin durchgesätzten, aber nicht kontrollierten perfundierten Tieren. Endotheliale Protein vaskuläre endotheliale Cadherin und intrazelluläre Adhäsion Molekül zwei sind auch innerhalb der Biotinfraktion immunpräzipiert.In der frühen Phase der nephrotoxischen Nephritis wird bei nephrotoxischen Nephritistieren im Vergleich zu Kontrollen eine reduzierte Expression von Zelloberfläche Nephrin beobachtet. Tatsächlich zeigt die densitometische Analyse eine signifikante Reduktion von Biotin laded Nephrin bei nephrotoxischen Nephritistieren im Vergleich zu Controllern. Quantitative Analysen des Gesamt-Nephrin-Zu-Aktivin-Verhältnisses zeigen keine signifikanten Unterschiede zwischen der Kontrolle und nephrotoxischen Nephritis-Mäusen.Darüber hinaus werden bei nephrotoxischer Nephritis und Kontrolltieren gleiche Mengen an Podozyten beobachtet. Bei der späten nephrotoxischen Nephritis zeigen nephrotoxische nephritische Tiere eine Wiederherstellung der Nephrinexpression ohne signifikante Unterschiede in der Zelloberfläche Nephrin, gemessen zwischen Kontroll- und nephrotoxischen nephritischen Mäusen, und einer gesamten Nephrinreduktion bei nephrotoxischen nephritischen Tieren. Darüber hinaus werden podocyte Zahlen im Vergleich zu Kontrolltieren verringert.Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Spritzen blase frei während ihrer Verbindung zu halten, um Luftembolie der Glomeruli zu vermeiden und unter eiskalten Bedingungen zu arbeiten, sobald die Nierenperfusion begonnen hat. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die Isolierung von Glomeruli RNA und Protein durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen über die Proteinexpression oder Wechselwirkungen in gesunden und kranken Nieren zu beantworten.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identifizierung von kleinen Molekülen-bindende Proteine ​​in nativer zellulären Umgebung von lebenden Zellen Photoaffinitatsmarkierung

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Forschung

Biochemie

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Isolierung von Zwischenfilamentproteinen aus mehreren Mausgeweben zur Untersuchung von altern-assoziierten posttranslationalen Modifikationen

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Reinigung von biotinylierten Zelloberflächenproteinen aus<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Epithel-Darmzellen

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation und Atemwege Messungen der Mitochondrien von Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-weite Quantifizierung des Benennens Homogenität auf der Ebene des einzelnen Moleküls

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

Blick nach außen: Isolierung von cyanobakteriellen freigesetzten Kohlenhydratpolymeren und Proteinen

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU

Extrem schnelle und spezifische metabolische Kennzeichnung von RNA In Vivo mit 4-Thiouracil (Ers4tU)

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Charakterisierung zellulärer Proteine mit in-zelliger schneller photochemischer Oxidation von Proteinen

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Querschnitt von reifem Reis (Oryza sativa L.) Kerne für die Rasterelektronenmikroskopie-Bildgebung mit Pipettenspitzen als Immobilisierungsunterstützung

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analyse der neutralen Lipidsynthese in Saccharomyces cerevisiae durch metabolische Markierung und Dünnschichtchromatographie

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...