Name: isolation of glomeruli and in vivo labeling of glomerular cell surface proteins
Uploaded: 2019-01-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins at JoVE.com

המחברים מודים Duvnjak בלנקה על סיוע טכני יוצא דופן שלה. עבודה זו נתמכה על ידי פתוח (www.dfg.de) WO1811/2-1 כדי M.W. ו- QU280/3-1 על מנת משכל Funder היה לא תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, ניתוח נתונים, ההחלטה לפרסם ולאחר ההכנה של כתב היד.

עכברים התקבלו כמו גזע ללא צורך במיקור חוץ מתקן טיפול בבעלי חיים מקומיים או מעבדות Janvier בצרפת. החקירות נערכו על פי ההנחיות המפורטות במדריך עבור טיפול, שימוש של חיות מעבדה (ארה ב נבחרת מוסדות של בריאות פרסום מס ' 85-23, תוקן 1996). כל הניסויים בוצעו על פי האישורים מוסדיים הרלוונטיים (ממשלת מדינת LANUV ...

<ol>
	<li>Jefferson, J. A., Alpers, C. E., Shankland, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocyte+biology+for+the+bedside.">Podocyte biology for the bedside.</a> American Journal of Kidney Disease. 58 (5), 835-845 (2011).</li><li>Konigshausen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+increases+glomerular+permeability+by+beta-arrestin+mediated+nephrin+endocytosis.">Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis.</a> Scientific Reports. 6, 39513 (2016).</li><li>Quack, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Arrestin2+mediates+nephrin+endocytosis+and+impairs+slit+diaphragm+integrity.">beta-Arrestin2 mediates nephrin endocytosis and impairs slit diaphragm integrity.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (38), 14110-14115 (2006).</li><li>Quack, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKC+alpha+mediates+beta-arrestin2-dependent+nephrin+endocytosis+in+hyperglycemia.">PKC alpha mediates beta-arrestin2-dependent nephrin endocytosis in hyperglycemia.</a> Journal of Biological Chemitry. 286 (15), 12959-12970 (2011).</li><li>Swiatecka-Urban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+Trafficking+at+the+Mature+Podocyte+Slit+Diaphragm.">Endocytic Trafficking at the Mature Podocyte Slit Diaphragm.</a> Frontiers in Pediatrics. 5, 32 (2017).</li><li>Swiatecka-Urban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+trafficking+in+podocyte+health+and+disease.">Membrane trafficking in podocyte health and disease.</a> Pediatric Nephrology. 28 (9), 1723-1737 (2013).</li><li>Soda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+dynamin,+synaptojanin,+and+endophilin+in+podocyte+foot+processes.">Role of dynamin, synaptojanin, and endophilin in podocyte foot processes.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4401-4411 (2012).</li><li>Kestila, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positionally+cloned+gene+for+a+novel+glomerular+protein--nephrin--is+mutated+in+congenital+nephrotic+syndrome.">Positionally cloned gene for a novel glomerular protein--nephrin--is mutated in congenital nephrotic syndrome.</a> Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).</li><li>Martin, C. E., Jones, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephrin+Signaling+in+the+Podocyte:+An+Updated+View+of+Signal+Regulation+at+the+Slit+Diaphragm+and+Beyond.">Nephrin Signaling in the Podocyte: An Updated View of Signal Regulation at the Slit Diaphragm and Beyond.</a> Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 9, 302 (2018).</li><li>Nielsen, J. S., McNagny, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+podocalyxin+in+health+and+disease.">The role of podocalyxin in health and disease.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (8), 1669-1676 (2009).</li><li>Yasuda, T., Saegusa, C., Kamakura, S., Sumimoto, H., Fukuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab27+effector+Slp2-a+transports+the+apical+signaling+molecule+podocalyxin+to+the+apical+surface+of+MDCK+II+cells+and+regulates+claudin-2+expression.">Rab27 effector Slp2-a transports the apical signaling molecule podocalyxin to the apical surface of MDCK II cells and regulates claudin-2 expression.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3229-3239 (2012).</li><li>Tossidou, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocytic+PKC-alpha+is+regulated+in+murine+and+human+diabetes+and+mediates+nephrin+endocytosis.">Podocytic PKC-alpha is regulated in murine and human diabetes and mediates nephrin endocytosis.</a> Public Library of Science One. 5 (4), 10185 (2010).</li><li>Qin, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+nephrin+triggers+its+internalization+by+raft-mediated+endocytosis.">Phosphorylation of nephrin triggers its internalization by raft-mediated endocytosis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (12), 2534-2545 (2009).</li><li>Waters, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+promotes+dynamin-dependent+endocytosis+of+nephrin.">Notch promotes dynamin-dependent endocytosis of nephrin.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (1), 27-35 (2012).</li><li>Zhang, X., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+tyrosine+kinases+endocytosis+in+endothelium:+biology+and+signaling.">Receptor tyrosine kinases endocytosis in endothelium: biology and signaling.</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 34 (9), 1831-1837 (2014).</li><li>Maes, H., Olmeda, D., Soengas, M. S., Agostinis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+trafficking+mechanisms+in+endothelial+cells+as+modulators+of+the+tumor+vasculature+and+targets+of+antiangiogenic+therapies.">Vesicular trafficking mechanisms in endothelial cells as modulators of the tumor vasculature and targets of antiangiogenic therapies.</a> Federation of European Biochemical Societies Journal. 283 (1), 25-38 (2016).</li><li>Satchell, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+immortalized+human+glomerular+endothelial+cells+expressing+fenestrations+in+response+to+VEGF.">Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF.</a> Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).</li><li>Takemoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+large+scale+isolation+of+kidney+glomeruli+from+mice.">A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice.</a> American Journal of Pathology. 161 (3), 799-805 (2002).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+glomeruli+from+mice:+A+practical+approach+for+beginners.">Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners.</a> Experimental and Therapeutic Medicine. 5 (5), 1322-1326 (2013).</li><li>Haase, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vivo+method+to+quantify+slit+diaphragm+protein+abundance+in+murine+proteinuric+kidney+disease.">A novel in vivo method to quantify slit diaphragm protein abundance in murine proteinuric kidney disease.</a> Public Library of Science One. 12 (6), 0179217 (2017).</li><li>Satoh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=aPKClambda+maintains+the+integrity+of+the+glomerular+slit+diaphragm+through+trafficking+of+nephrin+to+the+cell+surface.">aPKClambda maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface.</a> Journal of Biochemistry. 156 (2), 115-128 (2014).</li><li>Tomas, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombospondin+type-1+domain-containing+7A+in+idiopathic+membranous+nephropathy.">Thrombospondin type-1 domain-containing 7A in idiopathic membranous nephropathy.</a> New England Journal of Medicine. 371 (24), 2277-2287 (2014).</li><li>Daniels, G. M., Amara, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+labeling+of+neurotransmitter+transporters+at+the+cell+surface.">Selective labeling of neurotransmitter transporters at the cell surface.</a> Methods in Enzymology. 296, 307-318 (1998).</li><li>Ougaard, M. K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+Nephrotoxic+Nephritis+as+a+Model+of+Chronic+Kidney+Disease.">Murine Nephrotoxic Nephritis as a Model of Chronic Kidney Disease.</a> International Journal of Nephrology. 2018, 8424502 (2018).</li><li>Salant, D. J., Darby, C., Couser, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+membranous+glomerulonephritis+in+rats.+Quantitative+studies+of+glomerular+immune+deposit+formation+in+isolated+glomeruli+and+whole+animals.">Experimental membranous glomerulonephritis in rats. Quantitative studies of glomerular immune deposit formation in isolated glomeruli and whole animals.</a> Journal of Clinical Investigation. 66 (1), 71-81 (1980).</li></ol>

השיטה הציג מאפשר בידוד מוצלחת של glomeruli לחקור glomerular RNA או החלבון. בנוסף, ניתן לבצע תרביות תאים glomerular הראשית glomeruli מבודד. אם ביוטין מוחל לפני glomerular בידוד, תיוג של חלבונים פני שטח התא glomerular יכולה להתבצע. בשיטה זו, אין ויוו glomerular תא הדם סחר יכול להילמד, כימות למחצה של חלבון שפע אפשרית. השלבים ?...

פרוטאינוריה מהווה סימן היכר של פציעה glomerular ומלווה בדרך כלל שיבוש מסנן glomerular1. המסנן glomerular מורכב של אנדותל fenestrated, גלומרולרי במרתף, podocytes. המבנה המולקולרי העדין של המסנן glomerular היא דינמית מאוד על תאי הדם בבני אדם בשתי הכליות בריאים וחולים2,3,4,5,6 . אנדוציטוזה של חלבונים פני שטח התא הוכח חיונית להישרדותו של podocytes7. Nephrin podocalyxin transmembrane חלבונים לידי ביטוי podocytes בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. Nephrin הוא עמוד השדרה של הסרעפת שסע glomerular, בעוד podocalyxin הוא sialoglycoprotein ציפוי תהליכי רגל משני podocytes8,9,10. סחר endocytic שהוצג בעבר עבור nephrin ו- podocalyxin3,11,12,13,14.
לפי מיטב ידיעתנו, אנדוציטוזה של חלבונים פני שטח התא לא עוד תואר בתאי האנדותל glomerular בספרות. עם זאת, תאי אנדותל לבטא באופן כללי כל החלבונים הדרושים עבור סוגים שונים של אנדוציטוזה (קרי, אנדוציטוזה clathrin תלוית, תלויי-רפסודה)15,16. לכן, תאי אנדותל משטח סחר עשויים להילמד בשיטה זו משתמשים, לדוגמה, אנדותל כלי הדם (VE)-קדהרין, מולקולה אדהזיה תאיים (ICAM-2) כמו תא משטח סמן חלבון תאי אנדותל glomerular17 .
למרבה הצער, יש אין מודל מדויק במבחנה למסנן עדין שלוש שכבות glomerular בתא שבו הדם סחר יכול להילמד. המטרה של שיטה זו היא ובכך ללמוד חלבון glomerular סחר ויוו. בנוסף, פרוטוקול זה מכיל מידע על כיצד לבודד glomeruli, המאפשר ניתוח של glomerular RNA, חלבונים, או תאים. דומה בידוד glomerular טכניקות תוארו על ידי שונים קבוצות18,19.
בעבר, אנחנו ואחרים השתמשו שמחוץ תיוג של חלבונים פני שטח התא glomerular מאת biotinylation2,3,4,20,21. עם זאת, בשיטה זו שמחוץ , מבודד glomeruli נחשפו ללחץ מכני, העלולים להשפיע על סחר endocytic. לחלופין, immunofluorescence תיוג של חלבונים פני שטח התא glomerular בהרחבה שימש בספרות2,20,22. בשיטה זו, עם זאת, ניתן לנתח כמות קטנה של חלבונים בתוך שקופית אחת, כימות של immunofluorescence תמונות קשה לעיתים קרובות.
השיטה הרומן ויוו מציעה כלי אמין ללמוד glomerular תא הדם שפע וסחר במדויק בתוך בריאים וחולים הכליות, זה יכול לשמש כתוספת בדיקות immunofluorescence.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:671px;" width="669">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Motic SMZ168 BL</td>
			<td style="width:77px;">Motic</td>
			<td style="width:101px;">SMZ168BL</td>
			<td style="width:235px;">microscope for mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:257px;">KL1500LCD</td>
			<td style="width:77px;">Pulch and Lorenz microscopy</td>
			<td style="width:101px;">150500</td>
			<td>light for mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Rompun (Xylazin) 2%</td>
			<td style="width:77px;">Bayer</td>
			<td>PZN:01320422</td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Microfederschere</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">FD100R</td>
			<td>fine scissors, for cut into the aorta</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Durotip Feine Scheren</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BC210R</td>
			<td>for abdominal cut</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Anatomische Pinzette</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BD215R</td>
			<td>for surgery until the abdomen is opened</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Pr&#228;parierklemme</td>
			<td style="width:77px;">Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BJ008R</td>
			<td>for surgery&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Seraflex</td>
			<td style="width:77px;">Serag Wiessner</td>
			<td style="width:101px;">IC108000</td>
			<td>silk thread</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Ketamine 10%</td>
			<td style="width:77px;">Medistar</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Rompun (Xylazin) 2%</td>
			<td style="width:77px;">Bayer</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm</td>
			<td style="width:77px;">Portex</td>
			<td style="width:101px;">800/100/100</td>
			<td style="width:235px;">Catheter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm</td>
			<td style="width:77px;">Portex</td>
			<td style="width:101px;">800/100/200</td>
			<td style="width:235px;">Catheter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Harvard apparatus 11 Plus</td>
			<td style="width:77px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:101px;">70-2209</td>
			<td>syringe pump</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin</td>
			<td style="width:77px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">21335</td>
			<td>biotin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Dynabeads Untouched Mouse T-cells</td>
			<td style="width:77px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">11413D</td>
			<td>to embolize glomeruli</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Collagenase A</td>
			<td style="width:77px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">10103578001</td>
			<td>to digest kidney tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">DynaMag-2</td>
			<td style="width:77px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">123.21D</td>
			<td>Magnet catcher</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">100&#181;m cell stainer</td>
			<td style="width:77px;">Greiner-bio</td>
			<td style="width:101px;">542000</td>
			<td>for glomerular isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Axiovert 40 CFL</td>
			<td style="width:77px;">Zeiss</td>
			<td style="width:101px;">non available</td>
			<td>to confirm glomerular purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">TissueRuptor</td>
			<td style="width:77px;">Quiagen</td>
			<td style="width:101px;">9002755</td>
			<td>Tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">CHAPS</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">C3023</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Tris-HCL</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T5941</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">NaCl</td>
			<td style="width:77px;">VWR chemicals</td>
			<td style="width:101px;">27810295</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">NaF</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">201154</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">EDTA</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">E5134</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">ATP</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">34369-07-8</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:77px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">23225</td>
			<td>Follow the manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">nephrin antibody</td>
			<td style="width:77px;">Progen</td>
			<td style="width:101px;">GP-N2</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Polyclonal goat anti-podocalyxin antibody</td>
			<td style="width:77px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:101px;">AF15556-SP</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Streptavidin Agarose Resin</td>
			<td style="width:77px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">20347</td>
			<td>for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:257px;">Protein A sepharose CL-4B</td>
			<td style="width:77px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:101px;">17096303</td>
			<td>for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">polyclonal rabbit anti-p57 antibody</td>
			<td style="width:77px;">SCBT</td>
			<td style="width:101px;">sc-8298</td>
			<td>for Immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">mouse monoclonal anti-beta actin antibody, clone AC-74</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">A2228</td>
			<td>Western blot loading control</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">rabbit anti-p44/42</td>
			<td style="width:77px;">cell signalling</td>
			<td style="width:101px;">4695</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Pierce High sensitivity streptavidin-HRP</td>
			<td style="width:77px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">21130</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">polyclonal mouse ICAM-2 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF774</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">polyclonal mouse anti-VE-cadherin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF1002</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of glomeruli and in vivo labeling of glomerular cell surface proteins

פרוטאינוריה נובעת שיבוש המסנן glomerular המורכבת אנדותל fenestrated גלומרולרי במרתף, podocytes עם דיאפרגמות חריץ שלהם. המבנה העדין של המסנן glomerular, במיוחד הסרעפת שסע, מסתמכת על יחסי הגומלין של חלבונים פני שטח התא מגוונות. לומדים אלה חלבונים פני שטח התא כה הוגבלה במבחנה בלימודים או ניתוח היסטולוגית. כאן, אנו מציגים biotinylation מאתר ויוו תיוג שיטה, אשר מאפשר חקר חלבונים פני שטח התא glomerular בתנאים הפיזיולוגיות, pathophysiologic. פרוטוקול זה מכיל מידע על אופן perfuse העכבר הכליות, לבודד glomeruli, ולבצע immunoprecipitation אנדוגני של חלבון עניין. כימות למחצה של שפע פני שטח התא glomerular ונותרות עם שיטה חדשנית זו, נגיש זלוף ביוטין כל החלבונים, ניתן יהיה ללמוד immunoprecipitation. בנוסף, בידוד של glomeruli עם או בלי biotinylation מאפשר עוד ניתוח של glomerular RNA, חלבון, כמו גם תרבית תאים glomerular הראשית (קרי, תרבית תאים של podocyte הראשית).

כדי לבודד glomeruli באופן מדויק, יש צורך perfuse מאתר הכליות עם PBSCM קודם. זלוף עם PBSCM פונה הכליות חיוור (איור 1א'). אמבוליזציה של glomeruli עם חרוזים מגנטי יהיה גלוי כנקודות חום על פני כליות (איור 1B). בידוד של glomeruli עם התפסן מגנט עשוי להראו...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins at JoVE.com

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

בידוד של Glomeruli, In Vivo תיוג של חלבונים פני שטח התא Glomerular

כאן אנו מציגים עבור מאתר ויוו תיוג של חלבונים פני שטח התא glomerular עם ביוטין פרוטוקול. פרוטוקול זה מכיל מידע על אופן perfuse העכבר הכליות, לבודד glomeruli, ולבצע immunoprecipitation אנדוגני של החלבון עניין.

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום נפרולוגיה על התפקיד של חלבון פני השטח התא סחר במחלת כליות פרוטאינורית ולא פרוטאינורית. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא מקלה על המחקר של חלבון פני השטח התא סחר in-vivo, כי יותר מחלבון אחד ניתן לנתח לכל ניסוי. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לתוך סחר משטח התא גלומרולרי, ניתן להחיל גם על מערכות איברים אחרות כי הם חדור נגישים על ידי טכניקות בידוד.התחל על ידי אישור חוסר תגובה לצביטת בוהן וחיטוי הצד הגחוני של העכבר הרדמה עם 70% isopropyl. בצע חציון לחתוך דרך העור מהאגן אל עצם החזה ולהשתמש פינצטה כדי להסיר את העור מן fascia הבטן. חותכים את העור משני צידי קו האמצע הבטן ולעשות מדיום דרך שכבת שריר הבטן משלפוחית השתן כדי xiphoid.השתמש במספריים ומלקחיים כדי לחלק את השרירים לארבעה רבעים ולהשתמש בשני מלחציים כירורגיים כדי לאבטח את שני הרבעים העליונים לכיוון הצוואר של בעלי החיים. מניחים את החיה תחת מיקרוסקופ לנתח ולהשתמש החלפה סטרילית כדי להזיז הצידה את האיברים הקרביים. באמצעות מספריים עדין, לחתוך את הרצועה phrenic כבד.באמצעות פינצטה כירורגית עדינים, מניחים תפר אחד סביב העורק המזנטרי ב כבד של עורקי הכליה. וסובב את בית האבות, קרוב לעורקי הכליה, בלוטת יותרת הכליה. שחררו את אבי העורקים הדיסטלי מהפאשיה, השומן ורקמות אחרות.לאחר מכן, מהדקים את הוונה קאווה ואת אבי העורקים בשיא הביפורציה ומ מניחים תפר נוסף סביב דיסטל אבי העורקים של כליות. השתמש פינצטה כדי להדק את התפר אבי העורקים proximal, להחריש את זרימת הדם לחתוך חור קטן מחצית קוטר אבי העורקים לתוך אבי העורקים, דיסטלי לעורקי הכליות. הכנס קטטר 10 ס"מ מחובר מזרק 10 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של קרח קר PBS בתוספת סידן ומגנזיום לתוך בית הדם.ולתקן את הקטטר עם הקשירה המוכנה. ואז להתחיל לזלזל בכליות בקצב זרימה של שני מיליליטר לדקה. שימוש במספריים עדין כדי לחתוך חור לתוך וריד הכליה בעורקי הכליה ומהדק את התפר סביב עורקי כבד מזנטי.לאחר הנפח כולו של PBS נמסר להחליף את perfusate עם חמישה מיליליטר של קרח קר PBS בתוספת סידן ומגנזיום בתוספת 0.5 מיליגרם למיליליטר ביוטין עבור תיוג פני השטח. המשך לבלבל את הכליות בקצב זרימה של שני מיליליטר לדקה. כאשר הנפח כולו נמסר, לצרף מזרק המכיל חמישה מיליליטר של קרח קר PBS בתוספת סידן ומגנזיום בתוספת 100 גליצין מילימולר לקטטר.הרוו את הגלומרולי עם כל חמשת המיליליטרים של תות תזמת הגליצין בקצב זרימה של שני מיליליטר לדקה. לאחר מכן לחדד את הכליות עם חמישה מיליליטר של קרח קר PBS בתוספת סידן ומגנזיום בתוספת 200 microliters של חרוזים מגנטיים למיליליטר בקצב זרימה של שני מיליליטר לדקה. האמבוליזציה של הגלומרולי עם חרוזים מגנטיים חומים תהיה גלויה על פני הכליה.כאשר כל חרוזים נמסרו להסיר את הקפסולה של הכליות לקצור את הכליות ב hilum. מניחים את הכליות בצלחת תרבות תאים 10 ס"מ המכיל 15 מיליליטר של PBS בתוספת סידן ומגנזיום. השתמש בלהב חדש עם קצוות כפולים כדי לחתוך את הכליות לחתיכות הקטנות ביותר האפשריות.מעבירים את הרקמה לצינור של שני מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של קולגן A למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס, ומערבבים בעדינות את ת פתרון הרקמה לפני ואחרי העיכול עם קצה פיפלט 1000 מיקרוליטר שונה. בסוף הדגירה, לסנן את הרקמה מתעכל דרך מסננת תא 100 מיקרון. השתמש מגרד תאים קר קרח PBS בתוספת סידן ומגנזיום כדי לרסק את הרקמה הנותרת דרך מסננת התא.להביא את הנפח הסופי של ההשעיה תא יחיד כליה עד 50 מיליליטר עם PBS קר קרח טרי בתוספת סידן ומגנזיום ולאסוף את תאי הכליות על ידי צנטריפוגה. הסר את supernatant ואז להשעות מחדש את גלולה עם קצת פחות מ 1.5 מיליליטר של קרח קר PBS בתוספת סידן ומגנזיום תוך מערבולת ולהעביר את ההשעיה גלומרולרי לתוך צינור חדש שני מיליליטר. כדי לשטוף את glomeruli, מניחים את הצינור לתוך מגנט כדי לצבור את glomeruli.לאחר דקה אחת, השתמש פיפטה 1000 microliter כדי להסיר את supernatant. ולהסיר את הצינור מהמגנט. מוסיפים מיליליטר אחד של PBS בתוספת סידן ומגנזיום לרקמות.פיפטה גלומרולי למעלה ולמטה פעם אחת ומערבולת התאים. להחזיר את הצינור למגנט ולשטוף את glomeruli שוב כפי שהוכח רק. עד שטוהר מדגם הגיע לפחות ל-90% על-ידי ניתוח מיקרוסקופ אור בהגדלה של 40 עד 100 X.ואז לאסוף את גלומרולי מטוהר חרוז מגנטי על ידי צנטריפוגה. כדי להשיג טוהר של יותר מ-95%, היה צורך לשטוף את הגלומרולי ביסודיות כפי שהוכח. זלבול ביוטין מקל על תיוג של לולאות נימי ביוטין אבל לא נשלט כליות עכבר מנוזרות.משקעים חיסוניים של שבר ביוטין של תמציות גלומרולרי מגלה כי חלבוני transmembrane גלומרולרי nephrin ו podocalyxin הם immunoprecipitated עם ביוטין אבל לא עם שבר הבקרה. כתמים של שבר immunoprecipitated עם סטרפטבידין עוד יותר מאשר את נוכחותו של נפרין בחור ביוטין בביוטין מחורש אך לא שליטה בעלי חיים מחושלים. קדרן אנדותל חלבון אנדותל ומולקולת הידבקות תאית 2 הם גם immunoprecipitated בתוך שבר ביוטין.בשלב המוקדם של nephritis nephrotoxic ביטוי מופחת של נפרין פני השטח של התא נצפתה בבעלי חיים nephrotoxic nephritis בהשוואה לפקדים. ואכן ניתוח densitometic מראה הפחתה משמעותית של נפרין laded ביוטין בבעלי חיים nephrotoxic nephritis בהשוואה לבקרים. ניתוח כמותי של יחס הנפרין לאקטין הכולל אינו מגלה הבדלים משמעותיים בין עכברי הנפרוטוקסיים.בנוסף, כמויות שוות של podocytes נצפו nephrotoxic nephritis ובעלי חיים שליטה. בדלקת נפריטיס נפרוטוקסית מאוחרת, בעלי חיים נפרוטוקסיים נפריטיים מפגינים התאוששות של ביטוי נפרין ללא הבדלים משמעותיים בנפרין פני השטח של התא הנפרין שנמדדו בין עכברים נפרוטיים נפרוטוקסיים לבין הפחתה כוללת של הנפרין בבעלי חיים נפריתיים נפרוטוקסיים. יתר על כן, מספרי podocyte מצטמצם בהשוואה לבעלי חיים שליטה.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על מזרקים בועה חופשי במהלך הקשר שלהם על מנת למנוע תסחיף אוויר של glomeruli ולעבוד בתנאים קרים כקרח פעם חליטה בכליות החלה. בעקבות הליך זה ניתן לבצע שיטות אחרות כמו בידוד של RNA glomeruli וחלבון כדי לענות על שאלות נוספות על ביטוי חלבון או אינטראקציות בכליות בריאות וחוליות.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

זיהוי של חלבונים קושרי מולקולה קטנים בסביבה נייד Native ידי תיוג Live- תא Photoaffinity

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

בידוד של חלבונים ביניים חלבונים מ רקמות עכבר מרובות לחקר ההזדקנות הקשורים שינויים טרנסלוציוניים

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

טיהור של biotinylated Cell חלבונים משטח מ<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; תאים אפיתל גוט

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

בידוד, מדידות הנשימה של המיטוכונדריה מ תודרנית לבנה

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

פרוטאום ברוחב כימות של תיוג הומוגניות ברמת מולקולה בודדת

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

מבט כלפי חוץ: בידוד של Cyanobacterial שוחרר פולימרים פחמימות וחלבונים

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU

מהירה מאוד וספציפית תיוג מטבולי של RNA ב Vivo עם 4-Thiouracil (Ers4tU)

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

אפיון חלבונים סלולריים עם החמצון בתוך תא מהיר לפוטוכימיקלים של חלבונים

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

חתך רוחבי של אורז בוגר (Oryza sativa L.) גרעינים לסריקת הדמיית מיקרוסקופיה אלקטרונית באמצעות טיפים פיפטה כתמיכה ללא תנועה

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

ניתוח של סינתזת שומנים נייטרלית ב cerevisiae Saccharomyces על ידי תיוג מטבולי כרומטוגרפיה שכבה דקה

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...