Name: isolation of glomeruli and in vivo labeling of glomerular cell surface proteins
Uploaded: 2019-01-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins at JoVE.com

लेखक उसे असाधारण तकनीकी सहायता के लिए Blanka Duvnjak धंयवाद । यह काम ड्यूश Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de) WO1811/2-1 से M.W. और QU280/3-1 से I.Q. तक समर्थित था funder अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह, डेटा विश्लेषण, प्रकाशित करने के लिए निर्णय, और पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी ।

चूहों को स्थानीय पशु देखभाल सुविधा से या फ्रांस में Janvier लैब्स से एक घर में नस्ल के रूप में प्राप्त किया गया । जांच की देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए गाइड में उल्लिखित दिशानिर्देशों के अनुसार...

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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+Nephrotoxic+Nephritis+as+a+Model+of+Chronic+Kidney+Disease.">Murine Nephrotoxic Nephritis as a Model of Chronic Kidney Disease.</a> International Journal of Nephrology. 2018, 8424502 (2018).</li><li>Salant, D. J., Darby, C., Couser, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+membranous+glomerulonephritis+in+rats.+Quantitative+studies+of+glomerular+immune+deposit+formation+in+isolated+glomeruli+and+whole+animals.">Experimental membranous glomerulonephritis in rats. Quantitative studies of glomerular immune deposit formation in isolated glomeruli and whole animals.</a> Journal of Clinical Investigation. 66 (1), 71-81 (1980).</li></ol>

प्रस्तुत विधि glomeruli के सफल अलगाव glomerular आरएनए या प्रोटीन की जांच करने के लिए सक्षम बनाता है । इसके अलावा, प्राथमिक glomerular कोशिका संस्कृतियों अलग glomeruli से किया जा सकता है । अगर बायोटिन glomerular अलगाव से पहले लागू किया ?...

Proteinuria glomerular चोट की एक बानगी है और आम तौर पर glomerular फ़िल्टर1के साथ व्यवधान । glomerular फिल्टर fenestrated endothelium, glomerular तहखाने झिल्ली, और podocytes से बना है । glomerular फिल्टर की नाजुक आणविक संरचना अत्यधिक गतिशील और कोशिका की सतह के अधीन है दोनों स्वस्थ और रोगग्रस्त गुर्दे में प्रोटीन की तस्करी2,3,4,5,6 . सेल की सतह प्रोटीन के Endocytosis7podocytes के अस्तित्व के लिए आवश्यक हो दिखाया गया है । Nephrin और podocalyxin transmembrane प्रोटीन podocytes पर व्यक्त कर रहे हैं । Nephrin glomerular भट्ठा डायाफ्राम की रीढ़ है, जबकि podocalyxin एक sialoglycoprotein कोटिंग podocytes8,9,10के माध्यमिक पैर प्रक्रियाओं है । Endocytic ्े पहले nephrin और podocalyxin3,11,12,13,14के लिए दिखाया जा चुका है ।
हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, सेल सतह प्रोटीन के endocytosis अभी तक साहित्य में glomerular endothelial कोशिकाओं में वर्णित नहीं किया गया है । हालांकि, सामांय में endothelial कोशिकाओं endocytosis के विभिंन प्रकार के लिए सभी आवश्यक प्रोटीन व्यक्त (यानी, clathrin निर्भर, बेड़ा निर्भर endocytosis)15,16। इसलिए, endothelial सेल भूतल तस्करी का उपयोग कर इस विधि के साथ अध्ययन किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, संवहनी endothelial (VE)-cadherin और intracellular आसंजन अणु (िकैम-2) glomerular endothelial कोशिकाओं के लिए एक सेल सतह मार्कर प्रोटीन के रूप में17 .
दुर्भाग्य से, वहां कोई सटीक इन विट्रो मॉडल नाजुक तीन स्तरित glomerular फ़िल्टर जिसमें कोशिका सतह प्रोटीन तस्करी के लिए अध्ययन किया जा सकता है के लिए है । इस पद्धति का लक्ष्य वीवो मेंglomerular प्रोटीन के तस्करी का अध्ययन करने के लिए इस प्रकार है । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल कैसे glomeruli को अलग करने के लिए, glomerular आरएनए, प्रोटीन, या कोशिकाओं के आगे विश्लेषण को सक्षम करने के बारे में जानकारी शामिल है । इसी प्रकार की glomerular आइसोलेशन तकनीक का वर्णन विभिन्न समूहों द्वारा18,19.
पहले, हम और दूसरों biotinylation2,3,4,20,21द्वारा glomerular सेल सतह प्रोटीन के पूर्व vivo लेबलिंग का इस्तेमाल किया है । हालांकि, इस पूर्व vivo विधि में, पृथक glomeruli यांत्रिक तनाव के संपर्क में थे, जो endocytic तस्करी को प्रभावित कर सकते हैं । वैकल्पिक रूप से, इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग glomerular कोशिका की सतह प्रोटीन बड़े पैमाने पर साहित्य में इस्तेमाल किया गया है2,20,22. इस विधि के साथ, तथापि, केवल प्रोटीन की एक छोटी संख्या एक स्लाइड के भीतर विश्लेषण किया जा सकता है, और इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों के quantitation अक्सर मुश्किल है ।
vivo विधि में यह उपंयास glomerular सेल सतह प्रोटीन बहुतायत और स्वस्थ और रोगग्रस्त गुर्दे में सही तस्करी का अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय उपकरण प्रदान करता है, और यह इम्यूनोफ्लोरेसेंस परीक्षण के लिए एक अतिरिक्त के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:671px;" width="669">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Motic SMZ168 BL</td>
			<td style="width:77px;">Motic</td>
			<td style="width:101px;">SMZ168BL</td>
			<td style="width:235px;">microscope for mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:257px;">KL1500LCD</td>
			<td style="width:77px;">Pulch and Lorenz microscopy</td>
			<td style="width:101px;">150500</td>
			<td>light for mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Rompun (Xylazin) 2%</td>
			<td style="width:77px;">Bayer</td>
			<td>PZN:01320422</td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Microfederschere</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">FD100R</td>
			<td>fine scissors, for cut into the aorta</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Durotip Feine Scheren</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BC210R</td>
			<td>for abdominal cut</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Anatomische Pinzette</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BD215R</td>
			<td>for surgery until the abdomen is opened</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Pr&#228;parierklemme</td>
			<td style="width:77px;">Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BJ008R</td>
			<td>for surgery&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Seraflex</td>
			<td style="width:77px;">Serag Wiessner</td>
			<td style="width:101px;">IC108000</td>
			<td>silk thread</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Ketamine 10%</td>
			<td style="width:77px;">Medistar</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Rompun (Xylazin) 2%</td>
			<td style="width:77px;">Bayer</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm</td>
			<td style="width:77px;">Portex</td>
			<td style="width:101px;">800/100/100</td>
			<td style="width:235px;">Catheter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm</td>
			<td style="width:77px;">Portex</td>
			<td style="width:101px;">800/100/200</td>
			<td style="width:235px;">Catheter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Harvard apparatus 11 Plus</td>
			<td style="width:77px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:101px;">70-2209</td>
			<td>syringe pump</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin</td>
			<td style="width:77px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">21335</td>
			<td>biotin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Dynabeads Untouched Mouse T-cells</td>
			<td style="width:77px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">11413D</td>
			<td>to embolize glomeruli</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Collagenase A</td>
			<td style="width:77px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">10103578001</td>
			<td>to digest kidney tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">DynaMag-2</td>
			<td style="width:77px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">123.21D</td>
			<td>Magnet catcher</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">100&#181;m cell stainer</td>
			<td style="width:77px;">Greiner-bio</td>
			<td style="width:101px;">542000</td>
			<td>for glomerular isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Axiovert 40 CFL</td>
			<td style="width:77px;">Zeiss</td>
			<td style="width:101px;">non available</td>
			<td>to confirm glomerular purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">TissueRuptor</td>
			<td style="width:77px;">Quiagen</td>
			<td style="width:101px;">9002755</td>
			<td>Tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">CHAPS</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">C3023</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Tris-HCL</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T5941</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">NaCl</td>
			<td style="width:77px;">VWR chemicals</td>
			<td style="width:101px;">27810295</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">NaF</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">201154</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">EDTA</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">E5134</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">ATP</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">34369-07-8</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:77px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">23225</td>
			<td>Follow the manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">nephrin antibody</td>
			<td style="width:77px;">Progen</td>
			<td style="width:101px;">GP-N2</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Polyclonal goat anti-podocalyxin antibody</td>
			<td style="width:77px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:101px;">AF15556-SP</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Streptavidin Agarose Resin</td>
			<td style="width:77px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">20347</td>
			<td>for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:257px;">Protein A sepharose CL-4B</td>
			<td style="width:77px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:101px;">17096303</td>
			<td>for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">polyclonal rabbit anti-p57 antibody</td>
			<td style="width:77px;">SCBT</td>
			<td style="width:101px;">sc-8298</td>
			<td>for Immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">mouse monoclonal anti-beta actin antibody, clone AC-74</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">A2228</td>
			<td>Western blot loading control</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">rabbit anti-p44/42</td>
			<td style="width:77px;">cell signalling</td>
			<td style="width:101px;">4695</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Pierce High sensitivity streptavidin-HRP</td>
			<td style="width:77px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">21130</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">polyclonal mouse ICAM-2 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF774</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">polyclonal mouse anti-VE-cadherin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF1002</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of glomeruli and in vivo labeling of glomerular cell surface proteins

glomerular फिल्टर है कि fenestrated endothelium, glomerular तहखाने झिल्ली से बना है के विघटन से Proteinuria परिणाम, और उनके भट्ठा डायाफ्राम के साथ podocytes । glomerular फिल्टर की नाजुक संरचना, विशेष रूप से भट्ठा डायाफ्राम, विविध कोशिका सतह प्रोटीन के साथ खेलना पर निर्भर करता है । इन सेल की सतह प्रोटीन का अध्ययन अब तक इन विट्रो अध्ययन या histologic विश्लेषण करने के लिए सीमित किया गया है । यहां, हम vivo biotinylation लेबलिंग विधि में एक murine मौजूद है, जो शारीरिक और pathophysiologic शर्तों के तहत glomerular सेल सतह प्रोटीन के अध्ययन में सक्षम बनाता है । इस प्रोटोकॉल कैसे माउस गुर्दे perfuse करने के लिए, glomeruli को अलग, और ब्याज की एक प्रोटीन के अंतर्जात immunoprecipitation प्रदर्शन के बारे में जानकारी शामिल है । glomerular सेल सतह बहुतायत के अर्द्ध quantitation इस उपंयास विधि के साथ आसानी से उपलब्ध है, और सभी बायोटिन छिड़काव और immunoprecipitation के लिए सुलभ प्रोटीन का अध्ययन किया जा सकता है । इसके अलावा, glomeruli के साथ या बिना biotinylation के अलगाव glomerular आरएनए और प्रोटीन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्राथमिक glomerular सेल संस्कृति (यानी, प्राथमिक podocyte सेल संस्कृति) के आगे विश्लेषण सक्षम बनाता है ।

glomeruli को अलग करने के लिए पहले PBSCM के साथ murine किडनी को perfuse करना जरूरी होता है । PBSCM के साथ छिड़काव गुर्दे पीला (चित्रा 1ए) बदल जाता है । चुंबकीय मोतियों के साथ glomeruli के Embolization गुर्दे की सत?...

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Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

अलगाव की Glomeruli और Vivo में Glomerular सेल सतह प्रोटीन की लेबलिंग

यहां हम vivo में murine के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान glomerular कोशिका की सतह प्रोटीन के साथ बायोटिन की लेबलिंग । इस प्रोटोकॉल कैसे माउस गुर्दे perfuse करने के लिए, glomeruli को अलग, और ब्याज की प्रोटीन के अंतर्जात immunoprecipitation प्रदर्शन के बारे में जानकारी शामिल है ।

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

इस विधि में प्रोटीनुरिक में सेल सतह प्रोटीन तस्करी की भूमिका के बारे में नेफ्रोलॉजी क्षेत्र में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में मदद कर सकते हैं और प्रोटीनुरिक गुर्दे की बीमारी नहीं है। इस तकनीक के मुख्य फायदे यह है कि यह सेल सरफेस प्रोटीन ट्रैफिकिंग इन-वीवो के अध्ययन की सुविधा प्रदान करता है और प्रति प्रयोग एक से अधिक प्रोटीन का विश्लेषण किया जा सकता है । हालांकि यह विधि ग्लोमेरुलर सेल सतह तस्करी में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है, लेकिन अन्य अंग प्रणालियों पर भी लागू किया जा सकता है जो परफ्यूज किए गए हैं और अलगाव तकनीकों द्वारा सुलभ हैं।पंजे की चुटकी के लिए प्रतिक्रिया की कमी की पुष्टि करके शुरू करें और 70% आइसोप्रोपिल के साथ एनेस्थेटाइज्ड माउस के वेंट्रल पक्ष को कीटाणुरहित करें। श्रोणि से उरोस्थि तक त्वचा के माध्यम से एक औसत कट बनाएं और पेट के प्रावरणी से त्वचा को हटाने के लिए चिमटी का उपयोग करें। पेट की मिडलाइन के दोनों किनारों पर त्वचा को काटें और मूत्राशय से xiphoid तक पेट की मांसपेशियों की परत के माध्यम से एक माध्यम बनाएं।मांसपेशियों को चार क्वाड्रेंट में विभाजित करने के लिए कैंची और संदंश का उपयोग करें और जानवरों की गर्दन की ओर ऊपरी दो क्वाड्रंट्स को सुरक्षित करने के लिए दो सर्जिकल क्लैंप का उपयोग करें। जानवर को विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे रखें और आंत के अंगों को अलग करने के लिए बाँझ स्वैप का उपयोग करें। ठीक कैंची का उपयोग करके, हेपेटिक फ्रेनिक स्नायु को काट लें।ठीक सर्जिकल चिमटी का उपयोग करना, गुर्दे की धमनियों के हेपेटिक मेसेंटेरिक धमनी ब्रैनियल के चारों ओर एक सीवन रखें। और महाधमनी के आसपास, गुर्दे की धमनियों के लिए समीपस्थ, अधिवृक्क ग्रंथि पर । प्रावरणी, वसा और अन्य ऊतकों से डिस्टल महाधमनी को मुक्त करें।फिर, विभाजन की ऊंचाई पर वेना कावा और महाधमनी को दबाएं और गुर्दे की धमनियों के महाधमनी डिस्टल के चारों ओर एक और सीवन रखें। समीपस्थ महाधमनी सीवन को कसने के लिए चिमटी का उपयोग करें, रक्त प्रवाह को कम करें और महाधमनी के व्यास के एक छोटे छेद को महाधमनी में काट लें, गुर्दे की धमनियों को डिस्टल करें। महाधमनी में बर्फ ठंडे पीबीएस प्लस कैल्शियम और मैग्नीशियम के पांच मिलीलीटर युक्त 10 मिलीलीटर से जुड़े 10 सेंटीमीटर कैथेटर डालें।और तैयार लिगेचर के साथ कैथेटर को ठीक करें। फिर दो मिलीलीटर प्रति मिनट प्रवाह दर पर गुर्दे को देखकर शुरू करें। गुर्दे की धमनियों में गुर्दे की नस में एक छेद काटने और हेपेटिक और मेसेंटेटिक धमनियों के चारों ओर सीवन को कसने के लिए ठीक कैंची का उपयोग करना।पीबीएस की पूरी मात्रा के बाद बर्फ ठंड पीबीएस प्लस कैल्शियम और मैग्नीशियम के पांच मिलीलीटर के साथ perfusate की जगह दिया गया है सतह लेबलिंग के लिए ०.५ मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर बायोटिन के साथ पूरक । दो मिलीलीटर प्रति मिनट प्रवाह दर पर गुर्दे को छिद्रित करना जारी रखें। जब पूरी मात्रा वितरित की गई है, तो कैथेटर को 100 मिलीमोलर ग्लाइसिन के साथ पूरक बर्फ ठंडे पीबीएस प्लस कैल्शियम और मैग्नीशियम के पांच मिलीलीटर युक्त सिरिंज संलग्न करें।ग्लाइसिन समाधान के सभी पांच मिलीलीटर के साथ ग्लोमेरुली को दो मिलीलीटर प्रति मिनट प्रवाह दर पर बुझाएं। फिर बर्फ ठंड पीबीएस प्लस कैल्शियम और मैग्नीशियम के पांच मिलीलीटर के साथ गुर्दे को दो मिलीलीटर प्रति मिनट प्रवाह दर पर मिलीलीटर प्रति मिलीलीटर चुंबकीय मोतियों के २०० माइक्रोलीटर के साथ पूरक किया जाता है । भूरे चुंबकीय मोतियों के साथ ग्लोमेरुली का एम्बोलाइजेशन किडनी की सतह पर दिखाई देगा।जब सभी मोतियों को वितरित किया गया है गुर्दे के कैप्सूल को हटा दें और हिलम में गुर्दे की कटाई करें। गुर्दे को 10 सेंटीमीटर सेल कल्चर डिश में रखें जिसमें 15 मिलीलीटर पीबीएस प्लस कैल्शियम और मैग्नीशियम होता है। गुर्दे को सबसे छोटे टुकड़ों में काटने के लिए एक नए डबल धार ब्लेड का उपयोग करें।ऊतक को दो मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए कोलेजनेज़ ए का एक मिलीलीटर होता है, ऊतक समाधान को धीरे-धीरे मिलाकर एक संशोधित 1000 माइक्रोलिटर पिपेट टिप के साथ पाचन से पहले और बाद में। इनक्यूबेशन के अंत में, 100 माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से पचा ऊतक को फ़िल्टर करें। सेल छन्नी के माध्यम से शेष ऊतकों को मैश करने के लिए सेल स्क्रैपर और आइस कोल्ड पीबीएस प्लस कैल्शियम और मैग्नीशियम का उपयोग करें।ताजा बर्फ ठंड पीबीएस प्लस कैल्शियम और मैग्नीशियम के साथ 50 मिलीलीटर तक गुर्दे एकल कोशिका निलंबन की अंतिम मात्रा लाओ और अपकेंद्रित्र द्वारा गुर्दे की कोशिकाओं को इकट्ठा। सुपरनैट को हटा दें फिर 1.5 मिलीलीटर बर्फ ठंडे पीबीएस प्लस कैल्शियम और मैग्नीशियम के साथ गोली को फिर से निलंबित करें, जबकि भंवर और एक नई दो मिलीलीटर ट्यूब में ग्लोमेरुलर निलंबन स्थानांतरित करें। ग्लोमेरुली को धोने के लिए, ट्यूब को एक चुंबक में रखें ताकि ग्लोमेरुली को एकत्रित किया जा सके।एक मिनट के बाद, सुपरनिटेंट को हटाने के लिए 1000 माइक्रोलीटर पिपेट का उपयोग करें। और चुंबक से ट्यूब निकालें। ऊतकों में पीबीएस प्लस कैल्शियम और मैग्नीशियम का एक मिलीलीटर जोड़ें।एक बार ऊपर और नीचे ग्लोमेरुली को पिपेट करें और कोशिकाओं को भंवर दें। चुंबक के लिए ट्यूब वापस और फिर से glomeruli धोने के रूप में सिर्फ प्रदर्शन किया । जब तक एक नमूना शुद्धता 40 से 100 एक्स आवर्धन पर प्रकाश माइक्रोस्कोप विश्लेषण द्वारा कम से कम 90% तक पहुंच नहीं गई है।फिर अपकेंद्रित्र द्वारा चुंबकीय मनका शुद्ध महिमा इकट्ठा करें। 95% से अधिक शुद्धता प्राप्त करने के लिए, ग्लोमेरुली को प्रदर्शन के रूप में अच्छी तरह से धोया जाना चाहिए। बायोटिन पर्फ्यूजन बायोटिन में केशिका छोरों की लेबलिंग की सुविधा देता है लेकिन नियंत्रित नहीं किया जाता है माउस गुर्दे।ग्लोमेरुलर अर्क के बायोटिन अंश की प्रतिरक्षा वर्षा से पता चलता है कि ग्लोमेरुलर ट्रांसमेम्ब्रान प्रोटीन नेफ्रिन और पोडोकैलिक्सिन को बायोटिन के साथ इम्यूनोप्रिपिबद्ध किया जाता है लेकिन नियंत्रण अंश के साथ नहीं। स्ट्रेप्टाविडिन के साथ इम्यूनोप्रिपिटेटेड अंश का धुंधला होना बायोटिन में बायोटिन लैड नेफ्रिन की उपस्थिति की पुष्टि करता है लेकिन पर्फ्यूस किए गए जानवरों को नियंत्रित नहीं करता है। एंडोथेलियल प्रोटीन वैस्कुलर एंडोथेलियल कैडेरिन और इंट्रासेलुलर आसंजन अणु दो भी बायोटिन अंश के भीतर इम्यूनोप्रिपिटेटेड होते हैं।नेफ्रोटोक्सिक नेफ्राइटिस के शुरुआती चरण में नियंत्रण की तुलना में नेफ्रोटॉक्सिक नेफ्राइटिस जानवरों में कोशिका सतह नेफ्रिन की कम अभिव्यक्ति देखी जाती है। वास्तव में घनत्व विश्लेषण नियंत्रकों की तुलना में नेफ्रोटॉक्सिक नेफ्राइटिस जानवरों में बायोटिन लैड नेफ्रिन की एक महत्वपूर्ण कमी दिखाता है। ऐक्टिन अनुपात के लिए कुल नेफ्रिन के मात्रात्मक विश्लेषण से नियंत्रण और नेफ्रोटॉक्सिक नेफ्राइटिस चूहों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पता चलता है।इसके अलावा, नेफ्रोटॉक्सिक नेफ्राइटिस में पॉडोसाइट्स की बराबर मात्रा देखी जाती है और जानवरों को नियंत्रित करती है। देर से नेफ्रोटॉक्सिक नेफ्राइटिस में, नेफ्रोटॉक्सिक नेफ्रिटिक जानवर नियंत्रण और नेफ्रोटॉक्सिक नेफ्रिटिक चूहों के बीच मापा जाने वाले सेल सतह नेफ्रिन में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं होने और नेफ्रोटॉक्सिक नेफ्रिटिक जानवरों में समग्र कुल नेफ्रिन कमी के साथ नेफ्रिन अभिव्यक्ति की वसूली का प्रदर्शन करते हैं। इसके अलावा, जानवरों को नियंत्रित करने की तुलना में पोडोसाइट संख्या में कमी आई है।इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, ग्लोमेरुली के वायु एम्बोलिज्म से बचने और एक बार किडनी परफ्यूजन शुरू होने के बाद बर्फ की ठंड की स्थिति में काम करने के लिए अपने कनेक्शन के दौरान सीरिंज बुलबुला मुक्त रखना याद रखना महत्वपूर्ण है। इस प्रक्रिया के बाद ग्लोमेरुली आरएनए और प्रोटीन के अलगाव जैसे अन्य तरीकों को स्वस्थ और रोगग्रस्त गुर्दे में प्रोटीन अभिव्यक्ति या बातचीत के बारे में अतिरिक्त सवालों के जवाब देने के लिए किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

लाइव सेल Photoaffinity लेबल द्वारा एक मूल निवासी सेलुलर वातावरण में छोटे अणु-बाध्यकारी प्रोटीन की पहचान

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

इंटरमीडिएट फिलामेंट प्रोटीन का मल्टीपल माऊस ट्यूस्यूज से अलगाव, एजिंग से जुड़े पोस्ट-ट्रांसजेशनल संशोधनों का अध्ययन

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

बायोटिनिलाटेड सेल सतह प्रोटीन की शुद्धि<em&gt; राइप्सीफलस माइक्रोप्रलस</em&gt; एपिथेलियल पेट कोशिकाओं

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

अलगाव और Arabidopsis थालियाना से Mitochondria की श्वसन माप

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

प्रोसिटोम एकल अणु स्तर पर लेबलिंग एकरूपता का व्यापक परिमाणन

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

बाहर की ओर देख रहे हैं: Cyanobactrial जारी कार्बोहाइड्रेट पॉलिमर और प्रोटीन के अलगाव

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU

4-Thiouracil (Ers4tU) के साथ Vivo में आरएनए की अत्यंत तेजी से और विशिष्ट मेटाबोलिक लेबलिंग

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

प्रोटीन के इन-सेल फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीकरण के साथ सेलुलर प्रोटीन की विशेषता

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

परिपक्व चावल के अनुप्रस्थ विभाजन(Oryza sativa एल.) स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए कर्नेल्स स्थिरीकरण समर्थन के रूप में पिपेट युक्तियाँ का उपयोग कर

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

मेटाबोलिक लेबलिंग और पतली परत क्रोमेटोग्राफी द्वारा सैकरोमाइसेस सेर्विसिया में तटस्थ लिपिड संश्लेषण का विश्लेषण

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...