Name: isolation of glomeruli and in vivo labeling of glomerular cell surface proteins
Uploaded: 2019-01-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins at JoVE.com

著者は、彼女の卓越したテクニカル サポートにブランカ Duvnjak をありがとうございます。この作品は、ドイツ研究振興協会 (www.dfg.de) WO1811/2-1 m. w. に、QU280/3-1 星に想いを支えられました。出資者には、研究デザイン、データ収集、データ分析、意思決定、公開する、原稿の準備の役割はなかった。

マウスは、ローカル動物のケア施設やフランスでジャンビエ ラボから社内品種として得られました。ケアと実験動物の使用 (米国国家機関の健康出版 85-23 号、1996 の改正のため、ガイドに記載されているガイドラインに従って、調査を行った。関連機関の承認に従ってすべての動物実験を行った (州政府 LANUV 参照番号 AZ:84-02.04。2016.A435)。
1. 商品、ソリューション、および...

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	<li>Jefferson, J. A., Alpers, C. E., Shankland, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocyte+biology+for+the+bedside.">Podocyte biology for the bedside.</a> American Journal of Kidney Disease. 58 (5), 835-845 (2011).</li><li>Konigshausen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+increases+glomerular+permeability+by+beta-arrestin+mediated+nephrin+endocytosis.">Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis.</a> Scientific Reports. 6, 39513 (2016).</li><li>Quack, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Arrestin2+mediates+nephrin+endocytosis+and+impairs+slit+diaphragm+integrity.">beta-Arrestin2 mediates nephrin endocytosis and impairs slit diaphragm integrity.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (38), 14110-14115 (2006).</li><li>Quack, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKC+alpha+mediates+beta-arrestin2-dependent+nephrin+endocytosis+in+hyperglycemia.">PKC alpha mediates beta-arrestin2-dependent nephrin endocytosis in hyperglycemia.</a> Journal of Biological Chemitry. 286 (15), 12959-12970 (2011).</li><li>Swiatecka-Urban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+Trafficking+at+the+Mature+Podocyte+Slit+Diaphragm.">Endocytic Trafficking at the Mature Podocyte Slit Diaphragm.</a> Frontiers in Pediatrics. 5, 32 (2017).</li><li>Swiatecka-Urban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+trafficking+in+podocyte+health+and+disease.">Membrane trafficking in podocyte health and disease.</a> Pediatric Nephrology. 28 (9), 1723-1737 (2013).</li><li>Soda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+dynamin,+synaptojanin,+and+endophilin+in+podocyte+foot+processes.">Role of dynamin, synaptojanin, and endophilin in podocyte foot processes.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4401-4411 (2012).</li><li>Kestila, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positionally+cloned+gene+for+a+novel+glomerular+protein--nephrin--is+mutated+in+congenital+nephrotic+syndrome.">Positionally cloned gene for a novel glomerular protein--nephrin--is mutated in congenital nephrotic syndrome.</a> Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).</li><li>Martin, C. E., Jones, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephrin+Signaling+in+the+Podocyte:+An+Updated+View+of+Signal+Regulation+at+the+Slit+Diaphragm+and+Beyond.">Nephrin Signaling in the Podocyte: An Updated View of Signal Regulation at the Slit Diaphragm and Beyond.</a> Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 9, 302 (2018).</li><li>Nielsen, J. S., McNagny, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+podocalyxin+in+health+and+disease.">The role of podocalyxin in health and disease.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (8), 1669-1676 (2009).</li><li>Yasuda, T., Saegusa, C., Kamakura, S., Sumimoto, H., Fukuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab27+effector+Slp2-a+transports+the+apical+signaling+molecule+podocalyxin+to+the+apical+surface+of+MDCK+II+cells+and+regulates+claudin-2+expression.">Rab27 effector Slp2-a transports the apical signaling molecule podocalyxin to the apical surface of MDCK II cells and regulates claudin-2 expression.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3229-3239 (2012).</li><li>Tossidou, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocytic+PKC-alpha+is+regulated+in+murine+and+human+diabetes+and+mediates+nephrin+endocytosis.">Podocytic PKC-alpha is regulated in murine and human diabetes and mediates nephrin endocytosis.</a> Public Library of Science One. 5 (4), 10185 (2010).</li><li>Qin, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+nephrin+triggers+its+internalization+by+raft-mediated+endocytosis.">Phosphorylation of nephrin triggers its internalization by raft-mediated endocytosis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (12), 2534-2545 (2009).</li><li>Waters, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+promotes+dynamin-dependent+endocytosis+of+nephrin.">Notch promotes dynamin-dependent endocytosis of nephrin.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (1), 27-35 (2012).</li><li>Zhang, X., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+tyrosine+kinases+endocytosis+in+endothelium:+biology+and+signaling.">Receptor tyrosine kinases endocytosis in endothelium: biology and signaling.</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 34 (9), 1831-1837 (2014).</li><li>Maes, H., Olmeda, D., Soengas, M. S., Agostinis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+trafficking+mechanisms+in+endothelial+cells+as+modulators+of+the+tumor+vasculature+and+targets+of+antiangiogenic+therapies.">Vesicular trafficking mechanisms in endothelial cells as modulators of the tumor vasculature and targets of antiangiogenic therapies.</a> Federation of European Biochemical Societies Journal. 283 (1), 25-38 (2016).</li><li>Satchell, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+immortalized+human+glomerular+endothelial+cells+expressing+fenestrations+in+response+to+VEGF.">Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF.</a> Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).</li><li>Takemoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+large+scale+isolation+of+kidney+glomeruli+from+mice.">A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice.</a> American Journal of Pathology. 161 (3), 799-805 (2002).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+glomeruli+from+mice:+A+practical+approach+for+beginners.">Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners.</a> Experimental and Therapeutic Medicine. 5 (5), 1322-1326 (2013).</li><li>Haase, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vivo+method+to+quantify+slit+diaphragm+protein+abundance+in+murine+proteinuric+kidney+disease.">A novel in vivo method to quantify slit diaphragm protein abundance in murine proteinuric kidney disease.</a> Public Library of Science One. 12 (6), 0179217 (2017).</li><li>Satoh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=aPKClambda+maintains+the+integrity+of+the+glomerular+slit+diaphragm+through+trafficking+of+nephrin+to+the+cell+surface.">aPKClambda maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface.</a> Journal of Biochemistry. 156 (2), 115-128 (2014).</li><li>Tomas, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombospondin+type-1+domain-containing+7A+in+idiopathic+membranous+nephropathy.">Thrombospondin type-1 domain-containing 7A in idiopathic membranous nephropathy.</a> New England Journal of Medicine. 371 (24), 2277-2287 (2014).</li><li>Daniels, G. M., Amara, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+labeling+of+neurotransmitter+transporters+at+the+cell+surface.">Selective labeling of neurotransmitter transporters at the cell surface.</a> Methods in Enzymology. 296, 307-318 (1998).</li><li>Ougaard, M. K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+Nephrotoxic+Nephritis+as+a+Model+of+Chronic+Kidney+Disease.">Murine Nephrotoxic Nephritis as a Model of Chronic Kidney Disease.</a> International Journal of Nephrology. 2018, 8424502 (2018).</li><li>Salant, D. J., Darby, C., Couser, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+membranous+glomerulonephritis+in+rats.+Quantitative+studies+of+glomerular+immune+deposit+formation+in+isolated+glomeruli+and+whole+animals.">Experimental membranous glomerulonephritis in rats. Quantitative studies of glomerular immune deposit formation in isolated glomeruli and whole animals.</a> Journal of Clinical Investigation. 66 (1), 71-81 (1980).</li></ol>

提案手法により糸球体糸球体 RNA か蛋白質を調査するための分離を成功させる。さらに、プライマリの腎糸球体細胞文化は分離の腎糸球体から実行できます。ビオチンは、糸球体の分離の前に適用されます、腎糸球体細胞表面蛋白質の分類が実行できます。この方法では、体内の腎糸球体細胞表面タンパク質輸送を学ぶことができると蛋白質量の半定量が可能です。腎糸球体細胞の表?...

蛋白尿は糸球体傷害の特徴で、通常糸球体のフィルター1の破壊を伴います。糸球体のフィルターは、穴あきの内皮細胞、糸球体基底膜と足細胞で構成されます。デリケートな糸球体のフィルターの分子構造は非常に動的かつセル表面蛋白質両方健康と病気の腎臓2,3,4,5,6 で人身売買の対象.セル表面蛋白質のエンドサイトーシスは、足7の生存のために不可欠であると示されています。ネフリンとポドカリキシン足細胞に発現する膜貫通タンパク質であります。ネフリンはスリット糸球体ダイヤフラムのバックボーン ポドカリキシンはコーティング足8,9,10の二次足プロセス シアロ糖タンパク質。エンドサイトーシスの人身売買は、ネフリンとポドカリキシン3,11,12,13,14以前示されています。
我々 の知る限り、セル表面蛋白質のエンドサイトーシスまだ記載されていない文献で糸球体の内皮細胞。ところが、血管内皮細胞は、一般にエンドサイトーシス (すなわち、クラスリン依存、いかだ依存エンドサイトーシス)15,16のさまざまな種類のすべての必要な蛋白質を表現します。したがって、血管内皮 (VE) を使用してこのメソッドを学ぶことができる血管内皮細胞表面の人身売買-カドヘリンおよび細胞の細胞接着分子 (ICAM-2)17糸球体内皮細胞のマーカー蛋白質の表面.
残念ながら、繊細な糸球体 3 層のフィルター表面蛋白質の売買を検討する、セルの正確な体外モデルはありません。このメソッドの目的は、人身売買生体腎糸球体蛋白を勉強します。さらに、このプロトコルには、糸球体、さらに糸球体の RNA、蛋白質、または細胞の解析を有効にするを分離する方法に関する情報が含まれています。18,19のテクニックは別によって記述されていると同様の糸球体分離グループの。
以前は、私たちと他の人の使用している前のヴィヴォビオチン化2,3,4,20,21腎糸球体細胞表面蛋白質の分類します。ただし、この前のヴィヴォメソッドで孤立した糸球体は、エンドサイトーシス人身売買に影響を与える可能性があります機械的ストレスにさらされました。また、腎糸球体細胞表面タンパク質の蛍光標識は広範囲で使用されて文学2,20,22。この方法では、しかし、少数の蛋白質だけを 1 つのスライド内で分析できる、蛍光画像の定量は困難です。
この新しい体内法腎糸球体細胞表面蛋白質豊かさと人身売買で正確に健康と病気、腎臓を勉強する信頼性の高いツールを提供しています、蛍光抗体テストへの追加として使用できます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:671px;" width="669">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Motic SMZ168 BL</td>
			<td style="width:77px;">Motic</td>
			<td style="width:101px;">SMZ168BL</td>
			<td style="width:235px;">microscope for mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:257px;">KL1500LCD</td>
			<td style="width:77px;">Pulch and Lorenz microscopy</td>
			<td style="width:101px;">150500</td>
			<td>light for mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Rompun (Xylazin) 2%</td>
			<td style="width:77px;">Bayer</td>
			<td>PZN:01320422</td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Microfederschere</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">FD100R</td>
			<td>fine scissors, for cut into the aorta</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Durotip Feine Scheren</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BC210R</td>
			<td>for abdominal cut</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Anatomische Pinzette</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BD215R</td>
			<td>for surgery until the abdomen is opened</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Pr&#228;parierklemme</td>
			<td style="width:77px;">Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BJ008R</td>
			<td>for surgery&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Seraflex</td>
			<td style="width:77px;">Serag Wiessner</td>
			<td style="width:101px;">IC108000</td>
			<td>silk thread</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Ketamine 10%</td>
			<td style="width:77px;">Medistar</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Rompun (Xylazin) 2%</td>
			<td style="width:77px;">Bayer</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm</td>
			<td style="width:77px;">Portex</td>
			<td style="width:101px;">800/100/100</td>
			<td style="width:235px;">Catheter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm</td>
			<td style="width:77px;">Portex</td>
			<td style="width:101px;">800/100/200</td>
			<td style="width:235px;">Catheter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Harvard apparatus 11 Plus</td>
			<td style="width:77px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:101px;">70-2209</td>
			<td>syringe pump</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin</td>
			<td style="width:77px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">21335</td>
			<td>biotin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Dynabeads Untouched Mouse T-cells</td>
			<td style="width:77px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">11413D</td>
			<td>to embolize glomeruli</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Collagenase A</td>
			<td style="width:77px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">10103578001</td>
			<td>to digest kidney tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">DynaMag-2</td>
			<td style="width:77px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">123.21D</td>
			<td>Magnet catcher</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">100&#181;m cell stainer</td>
			<td style="width:77px;">Greiner-bio</td>
			<td style="width:101px;">542000</td>
			<td>for glomerular isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Axiovert 40 CFL</td>
			<td style="width:77px;">Zeiss</td>
			<td style="width:101px;">non available</td>
			<td>to confirm glomerular purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">TissueRuptor</td>
			<td style="width:77px;">Quiagen</td>
			<td style="width:101px;">9002755</td>
			<td>Tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">CHAPS</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">C3023</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Tris-HCL</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T5941</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">NaCl</td>
			<td style="width:77px;">VWR chemicals</td>
			<td style="width:101px;">27810295</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">NaF</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">201154</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">EDTA</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">E5134</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">ATP</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">34369-07-8</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:77px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">23225</td>
			<td>Follow the manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">nephrin antibody</td>
			<td style="width:77px;">Progen</td>
			<td style="width:101px;">GP-N2</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Polyclonal goat anti-podocalyxin antibody</td>
			<td style="width:77px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:101px;">AF15556-SP</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Streptavidin Agarose Resin</td>
			<td style="width:77px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">20347</td>
			<td>for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:257px;">Protein A sepharose CL-4B</td>
			<td style="width:77px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:101px;">17096303</td>
			<td>for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">polyclonal rabbit anti-p57 antibody</td>
			<td style="width:77px;">SCBT</td>
			<td style="width:101px;">sc-8298</td>
			<td>for Immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">mouse monoclonal anti-beta actin antibody, clone AC-74</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">A2228</td>
			<td>Western blot loading control</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">rabbit anti-p44/42</td>
			<td style="width:77px;">cell signalling</td>
			<td style="width:101px;">4695</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Pierce High sensitivity streptavidin-HRP</td>
			<td style="width:77px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">21130</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">polyclonal mouse ICAM-2 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF774</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">polyclonal mouse anti-VE-cadherin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF1002</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of glomeruli and in vivo labeling of glomerular cell surface proteins

蛋白尿は糸球体のフィルター窓内皮細胞、糸球体基底膜とスリットにダイアフラムの足で構成されているの中断に起因します。デリケートな糸球体のフィルター、特にスリット ダイヤフラムの構造は、さまざまな細胞表面蛋白質の相互作用に依存しています。これらの細胞の表面蛋白質を勉強ところの in vitro研究や組織学的分析にとどまってきた。標識法は、生理学的および病態生理学的条件下での腎糸球体細胞表面タンパク質の研究を可能にするマウス体内の講演を紹介します。このプロトコルは、マウス腎臓の灌流、腎糸球体に分離および興味の蛋白質の内因性の免疫沈降を実行する方法について説明します。腎糸球体細胞表面豊かな半定量はこの手法とビオチン血流にアクセス可能なすべての蛋白質ですぐに利用できる、免疫沈降法を学ぶことができます。さらに、ビオチン化の有無は糸球体を分離できますさらに主糸球体細胞培養 (つまり、プライマリ ポドサイト細胞培養) と同様、糸球体の RNA とタンパク質の解析であります。

糸球体を正確に分離するには、最初 PBSCM とマウスの腎臓を灌流する必要は。PBSCM による血液灌流腎淡 (図 1A) になります。磁気ビーズと糸球体の塞栓術、腎臓の表面 (図 1B) に茶色のドットとして表示されます。マグネット キャッチャーで糸球体の分離は、(図 1C) ...

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Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

腎糸球体と腎糸球体細胞表面タンパク質の標識体内の分離

ここでマウスの体内でビオチンと腎糸球体細胞表面タンパク質のラベリングのためのプロトコルを提案する.このプロトコルは、マウス腎臓の灌流、腎糸球体に分離および興味の蛋白質の内因性の免疫沈降を実行する方法について説明します。

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

この方法は、タンパク尿性腎臓病ではなくタンパク尿性における細胞表面タンパク質の人身売買の役割に関する腎臓学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、生体内での細胞表面タンパク質の密売の研究を容易にし、実験ごとに複数のタンパク質を分析できることです。この方法は糸球体細胞表面の人身売買に関する洞察を提供することができるが、また、浸透し、分離技術によってアクセス可能である他の器官系に適用することができる。つまみつまみへの応答の欠如を確認し、麻酔マウスの腹側を70%イソプロピルで消毒することから始めます。骨盤から胸骨まで皮膚を切り抜け、ピンセットを使って腹部筋膜から皮膚を取り除きます。腹部の中線の両側の皮膚を切断し、膀胱からxiphoidに腹筋層を通して媒体を作る。はさみと鉗子を使用して筋肉を4つの象限に分割し、2つの外科用クランプを使用して動物の首に向かって上の2つの象限を固定します。動物を解剖顕微鏡の下に置き、無菌スワップを使用して内臓を脇に移動します。細かいはさみを使用して、肝腎靭帯を切断します。細かい外科用ピンセットを使用して、腎動脈の肝性腸間膜動脈発膜の周りに1つの縫合を置く。そして大動脈の周り, 腎動脈に近位, 副腎で.鼻隠しから遠位大オルタを解放します, 脂肪や他の組織.次に、分岐の高さで大動脈と大動脈を包み込み、腎動脈の大動脈遠位の周りに別の縫合を配置する。ピンセットを使用して近位大動脈縫合を引き締め、血流を減衰させ、大動脈の直径の半分を大動脈に小さな穴を切断し、腎動脈に遠位する。5ミリリットルの氷冷PBSとカルシウムとマグネシウムを含む10ミリリットルのシリンジに取り付けられた10センチメートルのカテーテルを大間に挿入します。そして、準備された合字でカテーテルを固定します。その後、毎分流量2ミリリットルで腎臓を浸透させ始める。細かいはさみを使って腎動脈の腎静脈に穴を開け、肝および腸間膜動脈の周りの縫合を引き締める。PBSの全容が配信された後、パーフューズを5ミリリットルの氷冷PBSに加え、表面標識用のミリリットルビオチンあたり0.5ミリグラムを補ったカルシウムとマグネシウムに置き換えます。毎分流速2ミリリットルで腎臓を浸透させ続ける。全容が送達されたら、5ミリリットルの氷冷PBSに加えて、100ミリモルグリシンを添加したカルシウムとマグネシウムをカテーテルに含む注射器をカテーテルに取り付けます。グリシン溶液の5ミリリットルすべてを毎分流量2ミリでグリメルリをクエンチする。その後、5ミリリットルの氷冷PBSに加えて、カルシウムとマグネシウムを1ミリリットル当たり200マイクロリットルの磁気ビーズで1分2ミリリットルの流量で腎臓に浸透させます。褐色の磁気ビーズによる糸球体の塞栓は腎臓表面に見える。すべてのビーズが配信されたら、腎臓のカプセルを取り除き、ヒラムで腎臓を収穫します。15ミリリットルのPBSとカルシウムとマグネシウムを含む10センチメートルの細胞培養皿に腎臓を入れます。新しい両刃の刃を使用して、腎臓を可能な限り小さな部分に切ります。コラゲターゼA1ミリリットルを含む2ミリリットルのチューブに30分間摂氏37度で組織を移し、消化前後の組織溶液を修正された1000マイクロリットルピペットチップと穏やかに混合する。インキュベーションの終わりに、100ミクロンの細胞ストレーナーを通して消化された組織をフィルター処理する。細胞スクレーパーと氷冷PBSに加えて、カルシウムとマグネシウムを使用して、残りの組織を細胞ストレーナーを通してつぶします。新鮮な氷冷PBSプラスカルシウムとマグネシウムで腎臓単細胞懸濁液の最終量を最大50ミリリットルにし、遠心分離によって腎臓細胞を収集します。上澄み液を取り除き、1.5ミリリットル未満の氷冷PBSとカルシウムとマグネシウムでペレットを再中断し、糸球体懸濁液を新しい2ミリリットルチューブに移します。糸球体を洗うために、チューブを磁石に入れ、糸球体を凝集します。1分後、上清を取り除くために1000マイクロリットルのピペットを使用してください。そして、磁石からチューブを取り外します。組織にPBSとカルシウムとマグネシウムの1ミリリットルを追加します。糸球体を1回上下にピペットし、細胞を渦巻く。マグネットにチューブを戻し、ちょうど実証したように、グロメルリをもう一度洗います。試料純度が40〜100倍倍での光顕微鏡分析により少なくとも90%に達するまで。次いで、遠心分離により精製糸球体を精製した磁気ビーズを回収する。95%以上の純度を達成するためには、糸球体は実証したように十分に洗浄する必要がありました。ビオチン灌流は、ビオチンの毛細管ループの標識を容易にするが、制御された浸透マウス腎臓を促進しない。糸球体抽出物のビオチン分画の免疫沈殿は、糸球体膜貫通タンパク質ネフリンおよびポドカリキシンがビオチンで免疫沈降するが、対照画分ではないことを明らかにする。ストレプトアビジンによる免疫沈降分の染色は、浸透したビオチン中のビオチンの沈殿したネフリンの存在をさらに確認するが、浸透した動物を制御しない。血管内皮内膜内皮内膜内接着分子2と内皮内タンパク質もビオチン画分内で免疫沈降する。腎毒性腎炎の初期段階では、細胞表面の減少した発現は、コントロールと比較して腎毒性腎炎動物で観察される。確かに密度分析は、コントローラーと比較して腎毒性腎炎動物におけるビオチンのラッドネフリンの有意な減少を示す。全腎リンとアクチン比の定量分析は、マウスのコントロールと腎毒性性腎炎との間に有意な差がないことを明らかにしている。さらに、同量のポドサイトが腎毒性腎炎および対照動物において観察される。後期腎毒性腎炎では、腎毒性のネフリティック動物は、コントロールマウスとネフロー毒性ネフリティックマウスとネフロー中毒性ネフリンマウスの間で測定した細胞表面ネフリンに有意な差がなく、ネフリン発現の回復を示し、ネフロー毒性ネフリティック動物の全体的な全ネフリン減少を示す。また、制御動物に比べてポドサイト数が減少する。この手順を試みる間、糸球体の空気塞栓症を避け、腎臓灌流が始まったら氷冷状態で働くために、接続中に注射器の泡を自由に保つことを忘れないでください。この手順に従って、糸球体RNAおよびタンパク質の単離のような他の方法は、健康で病気の腎臓におけるタンパク質発現または相互作用に関する追加の質問に答えるために行うことができる。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

ライブセル光親和性標識によって、ネイティブの細胞環境における小分子結合タンパク質の同定

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

複数のマウス組織からの中間体フィラメントタンパク質の単離による老化に関連する翻訳後修飾の研究

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

ビオチン化細胞表面タンパク質の精製<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt;上皮腸細胞

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

分離とシロイヌナズナ由来のミトコンドリアの呼吸測定

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

プロテオーム的分類の単一分子レベルでの均一性の定量化

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

外向きに見る:シアノバクテリア放出炭水化物ポリマーとタンパク質の単離

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU

4-チウラシル(Ers4tU)を使用したビボにおけるRNAの非常に迅速かつ特異的な代謝標識

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

細胞内高速光化学タンパク質による細胞タンパク質の特性分析

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

成熟米の横断断面(オリザ・サティバ L.ピペットチップを固定化支援として用いた走査電子顕微鏡イメージング用カーネル

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

代謝標識と薄層クロマトグラフィーによる サッカロミセス・セレビシエ における中性脂質合成の解析

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...